Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFA0103200), Национальным фондом естественных наук Китая (81671734) и ключевыми проектами программы научно-технической поддержки Тяньцзиня (18YF-CSY00010), Фондам фундаментальных исследований для Центральные университеты (63191155). Мы признаем изменения Глории Нэнс, которые были полезны для улучшения качества нашей рукописи.

Эксперименты должны соответствовать национальным и институциональным нормам, касающимся использования животных в исследовательских целях. Разрешения на проведение экспериментов должны быть получены. Обработка животных и экспериментальные процедуры исследования придерживаются Ру...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

В этом протоколе описан неинвазивный двойной blI подход для мониторинга развития опухоли и ангиогенеза. Система репортеров BLI впервые разработана, содержащая ген самоубийцы HSV-ttk/GCV для отслеживания прогрессирования опухоли и регрессии in vivo с помощью rluc imaging. Между тем, опухолевый ангиоге...

Ангиогенез является важным процессом в прогрессировании рака от небольших, локализованных неоплазм ы на большие, потенциально метастатические опухоли1,2. Корреляция между ростом опухоли и ангиогенезом становится одной из точек внимания в области онкологических исследований. Однако традиционные методы измерения морфологических изменений не контролируют прогрессирование опухоли и ангиогенез одновременно у живых животных с помощью визуализированного подхода.
Биолюминесценция (BLI) опухолевых клеток является особенно подходящим экспериментальным методом для мониторинга роста опухоли из-за его неинвазивности, чувствительности и специфичности3,4,5,6 . Технология BLI основана на принципе, что люцифераза может катализировать окисление конкретного субстрата при испускании биолюминесценции. Люцифераза, выраженная в имплантированных опухолевых клетках, реагирует с инъекционным субстратом, который может быть обнаружен живой системой визуализации, и сигналы косвенно отражают изменения в количестве клеток или локализации клеток in vivo6,7.
За исключением роста опухоли, опухолевый ангиогенез (критический шаг в прогрессии рака) также может быть визуализирована с помощью технологии BLI с использованием Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей8,9,10. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vegf) рецептор 2 (Vegfr2), один тип рецептора Vegf, в основном выражается в сосудистых эндотелиальных клетках взрослых мышей11. В Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей, последовательность ДНК светлячок (Fluc) постучал в первый экзон эндогенной последовательности Vegfr2. В результате, Fluc выражается (который появляется как сигналы BLI) таким образом, что идентична уровню ангиогенеза у мышей. Чтобы вырасти за несколько миллиметров в размерах, опухоль набирает новые сосуды из существующих кровеносных сосудов, которые высоко выражают Vegfr2 вызвано факторами роста из опухолевых клеток1. Это открывает возможность использования Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей неинвазивно контролировать ангиогенез опухоли BLI.
В этом протоколе, опухолевые мыши модель установлена для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в одной мыши через Светлячок люциферазы (Fluc) и Ренилья luciferase (Rluc) изображений, соответственно (Рисунок 1). 4T1 клеточной линии (4T1-RR) создается, что стационарно выражает Rluc и красный флуоресцентный белок (RFP) для отслеживания роста клеток Rluc изображений. Для дальнейшего изучения динамических изменений ангиогенеза в прогрессии и регрессии опухоли, другой 4T1 клеточной линии (4T1-RRT) создается, что выражает самоубийство гена простого герпеса вирус усеченный тимидин киназы (HSV-ttk), Rluc, и RFP. При администрации ганцикловира (GCV), HSV-ttk выражающие клетки избирательно абляции. На основе этих клеточных линий построена модель опухолевых мышей Vegfr2-Fluc-KI, которая служит экспериментальной моделью, преодолевая прогрессирование опухоли и опухолевой ангиогенез in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

Ангиогенез, как решающий процесс прогрессирования опухоли, стал горячей точкой исследования и мишенью противоопухолевой терапии. Однако, нет надежной модели для отслеживания прогрессирования опухоли и ангиогенеза одновременно в визуальной и чувствительной манере. Биолюминесценция изображения отображает свое уникальное превосходство в живой визуализации из-за его преимущества высокой чувствительности, сильная специфичность, и точные измерения. Представлено здесь протокол для создания опухолевых мыши модели путем введения Renilla luciferase помечены морин рака молочной железы линии 4T1 в трансгенной мыши с ангиогенезом индуцированной светлячок выражение. Эта модель мыши обеспечивает ценный инструмент для одновременного мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в режиме реального времени путем двойной биолюминесценции изображения в одной мыши. Эта модель может быть широко применена в скрининге противоопухолевого препарата и онкологических исследованиях.

В этом эксперименте, модель мыши рака молочной железы была создана с использованием 4T1 клеток для исследования взаимосвязи между ростом опухоли и ангиогенеза опухоли (Рисунок 1). Во-первых, были упакованы два лентивируса, которые перевозили генные посл?...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Двойное биолюминесценционное изображение прогрессирования опухоли и ангиогенеза

Этот протокол описывает создание опухолевой мыши модели для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в режиме реального времени двойной биолюминесценции изображений.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Ангиогенез играет важную роль в метастазах и прогрессировании опухоли. В этом протоколе мы будем использовать метод двойной биолюминесценции для мониторинга динамического прогрессирования опухоли и ангиогенеза в мышиной модели рака молочной железы. В этой модели мы можем отслеживать рост опухоли и ангиогенез одновременно в одной мыши через Светлячок люциферазы и Ренилла люцифераза изображения, соответственно.Эта модель может быть широко применена в противоопухолевных скрининга наркотиков и онкологических исследований. Эта двойная модель биолюминесценции может быть использована для отслеживания прогрессирования и регрессии опухоли и обнаружения молекулярных процессов, связанных с опухолью, в ответ на терапевтические стратегии. Ангиогенез является важнейшим процессом прогрессирования опухоли.Поэтому мониторинг прогрессирования опухоли и ангиогенеза на визуальной и чувствительной основе необходим для разработки эффективных методов лечения опухоли. Процедуры продемонстрируют Кайюэ Чжан, Чэнь Ван и Шан Чэнь, студенты из нашей лаборатории. Для упаковки лентивируса и производства семян один раз от 10 до шестого из 293T клеток в двух миллилитров DMEM дополняется 10% плода бычьей сыворотки на а в шесть хорошо пластины для ночной культуры во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.На следующее утро смешайте 7,5 микролитров липосомы с 250 микролитров минимальной существенной среды в двух отдельных 1,5-миллилитровых трубках в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре. Для подготовки ДНК-решений добавьте плазмидный лентивирусный вектор RR и плазмиды помощников в 250 микролитров минимальной существенной среды в отдельных 1,5-миллилитровых трубках, как указано в таблице. В конце инкубации аккуратно добавьте растворы DNA RR в липосомные суспензии в капле-мудрый образом и позволить ДНК связи с липидными мембранами в течение 20 минут при комнатной температуре.В то время как смесь инкубации, заменить супернатант 293T клеточной культуры с одним миллилитр свежей среды культуры, и осторожно добавить 0,5 миллилитров соответствующей липосомы смеси ДНК к каждому хорошо. Верните клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 12-16 часов, прежде чем заменить супернатант в каждом хорошо с одним миллилитром свежей культуры среды, дополненной антибиотиками. После дополнительных 36 часов инкубации, объединить супернатанты в одну коническую трубку на штамм лентивируса, чтобы от осадки 293T клеток центрифугации.Затем перенесите лентивирус RR-содержащие супернатанты в отдельные 1,5-миллилитровые стерильные полипропиленные трубки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для лентивирусной трансдукции для экспрессии генов в клетках молочной опухоли 4T1, замените супернатант в каждом хорошо из шести-хорошо 4T1 клеточной культуры пластины с одним миллилитром свежих RPMI основе клеточной культуры среды дополняется фетальной сыворотки крупного рогатого скота и один миллилитр лентивирусного бульона. Затем добавьте восемь микрограмм на миллилитр полибрена к каждой хорошо, и осторожно пипетки несколько раз, чтобы смешать.Центрифуга пластины, чтобы помочь увеличить эффективность трансдукции, и вернуть клетки в инкубатор культуры клеток в течение четырех-12 часов. В конце инкубации замените супернатант в каждом хорошо со свежей культурой среды, дополненной сывороткой и антибиотиками, чтобы удалить любые лентивирусные частицы и полибрен. Чтобы выбрать для лентивирусных транспонированных клеток, прохождение транс индуцированных 4T1 клеточных культур на один-к-три к одному-четыре соотношение со средним выбором, изменение среды каждые два-три дня.После семи дней отбора средней культуры, просматривать транс индуцированных клеточных культур под флуоресценции перевернутой фазы контрастного микроскопа и подсчитать количество красных флуоресцентных белков-положительных или RFP-4T1 клеток и всех клеток 4T1 в трех областях зрения для оценки RFP-положительное соотношение. Чтобы создать модель опухолевых мышей, вымойте 80% стеченных трансфуцированных клеточных культур с PBS, прежде чем отделить клетки с двумя миллилитров трипсина-ЭДТА на 60-миллиметровую культурную пластину. Когда клетки подняли с дна пластины остановить реакцию с 5 до 10 миллилитров сыворотки дополняется среды на тарелку.И перенести культуры в отдельные 15-миллилитровые центрифуги труб для подсчета. Разбавить клетки в один раз от 10 до шестой клетки на 100 микролитров среды культуры без концентрации сыворотки. А подкожно вводят 100 микролитров клеточной линии 4T1-RR в левое плечо обезболивающей опухоленосной модели мыши и 100 микролитров клеточной линии 4T1-RRT в правое плечо той же мыши.После инъекций поместите каждую мышь в соответствующую зону восстановления с тепловой поддержкой до полного выздоровления. Пальпировать опухолевые массы каждый день в течение семи дней, чтобы подтвердить, что мыши опухолевых. На седьмой день после имплантации интраперитонно вводят по 50 микрограммов на килограмм Ганцикловира в каждую опухоленосную мышь два раза в день до окончания эксперимента.Для роста опухоли откройте систему живой визуализации. Инициализируйте программное обеспечение Living Imaging и инициализируйте систему. В то время как система инициализируется, используйте инсулиновый шприц, чтобы ввести каждую мышь, чтобы быть изображены с соответствующим объемом coelenterazine в ретробульбар.Поместите инъекционных мышей в камеру камеры и сразу же получить несколько фотографий мыши dorsally приобрести Ренилла люцифераза сигналы от 4T1 клеток, пока биолюминесцентные сигналы исчезают. Через 10 минут после ренилья люцифераза изображения, использовать инсулин шприц интраперитонально вводить соответствующий объем D-люциферина в каждое животное. Через 10 минут после инъекции D-люциферина поместите мышей в камеру камеры и получить несколько изображений спинной мыши, чтобы приобрести сигналы Светлячка люциферазы от ангиогенеза.После трансдукции лентивируса более 99% клеток являются RFP-положительными без различий в морфологии клеточной культуры, наблюдаемой между двумя трансдуцированными клеточными линиями. Впоследствии биолюминесценция изображений транс индуцированных клеток показывает, что обе клеточные линии излучают сильные биолюминесцентные сигналы аналогичной силы. После подкожной инъекции трансдуцированных клеточных линий в трансгенную модель опухолевых мышей, ангиогенез-индуцированный рост опухоли может быть оценен сигналами Светлячка люциферазы в присутствии D-люциферина в том же животном.В течение семи дней после имплантации администрация Ганцикловира вызывает смерть в клетках 4T1-RRT, что приводит к резкому снижению сигнала лусиферазы Рениллы в опухолях, установленных этими клетками. Сигналы светлячка люциферазы также увеличиваются в сочетании с увеличением экспрессии люциферазы Renilla и уменьшаются после снижения люциферазы. Взятые вместе, эти результаты показывают, что существует прямая корреляция между ангиогенезом опухоли и ростом опухоли.Действительно, Ганцикловир индуцированной смерти опухолевых клеток может привести к ингибированию ангиогенеза опухоли. Кроме того, иммуностеинирование для антисосудистого эндотелиального фактора роста рецептора II, как маркер ангиогенеза, выявляет более значительно установленную микрососудистую структуру в секциях опухолевых тканей 4T1-RR, чем в секциях из опухолей 4T1-RRT, что согласуется со снижением сигнала Светлячка люциферазы, наблюдаемого после введения Ганцикловира. Наиболее важным шагом протокола является использование двух видов люциферазы, таких как FLuc и RLuc для одновременного отслеживания клеток и ангиогенеза.Эта технология может быть использована для лечения раковых клеток в разных местах, и она может быть широко использована в моделях рака вируса. Эта модель мыши позволяет рост опухоли и противоопухолкового воздействия системы отслеживания HSV-ttk/GCV быть динамически визуализированы в живом животном. Для предотвращения трансфекции лентивируса требуется средство биобезопасности II уровня, поскольку средства массовой информации содержат частицы лентивируса, которые могут быть вредны для человека.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Два режима изображения кожных оксигенации тканей и сосудистой функции

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Мониторинг опухоли Метастазы и остеолитические Поражения с биолюминесценции и микро-КТ

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

В естественных условиях Биолюминесценция изображения опухоли Гипоксия Динамика груди метастазы рака мозга у мышей

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

В естественных условиях двойного основания Bioluminescent изображений

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

MAME Модели 4D Онлайн-клеточного изображения опухоли: микроокружение взаимодействия, что воздействие злокачественной прогрессии

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

В естественных изображений опухолевого ангиогенеза с помощью флуоресцентной конфокальной видеомикроскопии

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Роман с высоким разрешением<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображений методика исследования динамических характеристик внутричерепных структур к росту опухоли и терапии

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Отслойки Модель в Грызуны по субретинальной инжекции гиалуронат натрия

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida Albicans биопленки развития на медицинской актуальных инородных тел в мышиной подкожной модели с последующим биолюминесценции изображений

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Создание человека Множественная миелома модели ксенотрансплантата в Курица по изучению роста опухоли, инвазии и ангиогенеза

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...