Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Denna forskning stöddes av National Key R & D program i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), och viktiga projekt i Tianjin Science and Technology support program (18YFZCSY00010), grundläggande forskningsmedel för de centrala universiteten (63191155). Vi erkänner Gloria Nance: s revideringar, som var värdefulla för att förbättra kvaliteten på vårt manuskript.

Experiment måste överensstämma med nationella och institutionella bestämmelser om användning av djur för forskningsändamål. Tillstånd att utföra experiment måste erhållas. Behandlingen av djur och experimentella procedurer i studien följer Nankai-universitetets djur vårds-och användnings kommitté riktlinjer som överensstämmer med de riktlinjer för djuromsorg som godkänts av National Institutes of Health (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) och LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral förp...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

I detta protokoll beskrivs en icke-invasiv Dual BLI-metod för övervakning av tumörutveckling och angiogenes. BLI reporter systemet är först utvecklat, som innehåller HSV-TTK/GCV Suicide Gene för att spåra tumör progression och regression in vivo av Rluc Imaging. Samtidigt bedöms tumör angiogenes med hjälp av Vegfr2-Fluc-KI-möss via Fluc Imaging. Denna tumör-bärande musmodell kan ge en praktisk plattform för kontinuerlig och icke-invasiv spårning tumörutveckling och tumör angiogenes genom Dual BLI i en ...

Angiogenes är en viktig process i utvecklingen av cancer från små, lokaliserade neoplasmer till större, potentiellt metastaserande tumörer1,2. Sambandet mellan tumörtillväxt och angiogenes blir en av de punkter som betoningen i området onkologi forskning. Emellertid, traditionella metoder för att mäta morfologiska förändringar misslyckas med att övervaka tumörprogression och angiogenes samtidigt i levande djur med hjälp av en visualiserad metod.
Bioluminescence Imaging (bli) av tumörceller är en särskilt lämplig experimentell metod för att övervaka tumörtillväxt på grund av dess icke-invasivitet, känslighet, och specificitet3,4,5,6 . BLI-tekniken bygger på principen att luciferas kan katalysera oxidation av ett specifikt substrat samtidigt som det avger bioluminescens. Den luciferas uttrycks i implanterade tumörceller reagerar med det injicerade substratet, som kan upptäckas av ett levande avbildningssystem, och signaler indirekt återspeglar förändringarna i cell nummer eller cell lokalisering in vivo6,7.
Med undantag för tumörtillväxt, tumör angiogenes (det kritiska steget i cancer progression) kan också visualiseras genom bli-teknik med Vegfr2-Fluc-KI transgena möss8,9,10. Den vaskulära endoteliala tillväxtfaktorn (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), en typ av VEGF-receptorn, uttrycks mestadels i de vaskulära endotelcellerna hos vuxna möss11. I Vegfr2-Fluc-KI transgena möss slås DNA-sekvensen av Firefly luciferas (Fluc) in i den första exon av den endogena Vegfr2 sekvensen. Som ett resultat uttrycks Fluc (som visas som BLI-signaler) på ett sätt som är identiskt med nivån av angiogenes hos möss. Att växa bortom några millimeter i storlek, tumören rekryterar nya vasculatures från befintliga blodkärl, som uttrycker mycket Vegfr2 utlöses av tillväxtfaktorer från tumörceller1. Detta öppnar möjligheten att använda Vegfr2-Fluc-KI transgena möss för att icke-invasivt övervaka tumör angiogenes av BLI.
I detta protokoll är en tumör-bärande musmodell inrättas för att övervaka tumörprogression och angiogenes i en enda mus genom Firefly luciferas (Fluc) och Renilla luciferas (rluc) Imaging, respektive (figur 1). En 4T1-celllinje (4T1-RR) skapas som stabilt uttrycker Rluc och Red fluorescerande protein (RFP) för att spåra celltillväxt av Rluc Imaging. För att ytterligare undersöka de dynamiska förändringarna av angiogenes i progression och regression av tumören, en annan 4T1 cellinjer (4T1-RRT) skapas som uttrycker självmord gen herpes simplex virus stympad tymidin Kinas (HSV-TTK), rluc, och RFP. Genom administrering av ganciklovir (GCV), de HSV-TTK uttrycker celler selektivt ableras. Baserat på dessa cellinjer, en tumör-bärande modell i Vegfr2-Fluc-KI möss är byggd som fungerar som en experimentell modell överbrygga tumör progression och tumör angiogenes in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

Angiogenes, som en avgörande process av tumör progression, har blivit en forskning hotspot och mål av anti-tumör terapi. Emellertid, det finns ingen tillförlitlig modell för att spåra tumör progression och angiogenes samtidigt på ett visuellt och känsligt sätt. Bioluminescence Imaging visar sin unika överlägsenhet i levande avbildning på grund av dess fördelar med hög känslighet, stark specificitet, och noggrann mätning. Presenteras här är ett protokoll för att upprätta en tumör-bärande musmodell genom att injicera en Renilla luciferas-märkt murina bröstcancer cell linje 4T1 in i transgena mus med angiogenes-inducerad Firefly luciferas uttryck. Denna musmodell ger ett värdefullt verktyg för att samtidigt övervaka tumörprogression och angiogenes i realtid av Dual Mareld Imaging i en enda mus. Denna modell kan vara allmänt tillämpas i anti-tumör Drug screening och onkologi forskning.

I detta experiment, en bröstcancer musmodell etablerades med hjälp av 4T1 celler för att undersöka sambandet mellan tumörtillväxt och tumör angiogenes (figur 1). För det första var två lentivirus förpackade, som bar gensekvenser som uttrycker Rluc/RFP (LV-RR) och Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), respektive, som tidigare rapporterats7. Sedan, två olika 4T1 cellinjer, som heter 4T1-RR och 4T1-RRT, skapades genom att transducing LV-...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Dubbel bioluminescens avbildning av tumörprogression och angiogenes

Detta protokoll beskriver inrättandet av en tumör-bärande musmodell för att övervaka tumörprogression och angiogenes i realtid av Dual Mareld Imaging.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Angiogenes spela viktig roll i tumör metastasering och progression. I detta protokoll kommer vi att använda dubbla bioluminescens imaging metod för att övervaka den dynamiska tumörprogression och angiogenes i en mus modell av bröstcancer. I denna modell, Vi kan spåra tumörtillväxt och angiogenes samtidigt i den enda musen genom Firefly luciferas och Renilla luciferase imaging, respektive.Denna modell kan tillämpas allmänt i antitumör narkotika screening och onkologi forskning. Denna dubbla bioluminescensmodell kan användas för att spåra tumörprogression och regression och för att upptäcka tumörrelaterade molekylära processer som svar på terapeutiska strategier. Angiogenes är en avgörande process av tumör progression.Därför är övervakning tumör progression och angiogenes på ett visuellt och känsligt sätt nödvändigt för att utveckla effektiva tumör behandlingar. De förfaranden som kommer att demonstreras av Kaiyue Zhang, Chen Wang, och Shang Chen, studenter från vårt labb. För lentivirusförpackningar och produktionsfrö en gång 10 till den sjätte av 293T-celler i två milliliter dmem kompletterat med 10%fetalt bovinsserum per brunn in i en sex-brunnsplatta för övernattningskultur i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Nästa morgon blanda 7,5 mikroliter av liposom med 250 mikroliter av Minimal Essential Medium i två separata 1,5-milliliter rör för en fem minuters inkubering vid rumstemperatur. För att förbereda DNA-lösningarna tillsätt plasmid lentivirus RR-vektorn och hjälparplasmiderna till 250 mikroliter av Minimal Essential Medium i enskilda 1,5-milliliterrör som beskrivs i tabellen. I slutet av inkubationen tillsätt försiktigt DNA RR-lösningarna till liposomupphängningar på ett droppvis sätt och låt DNA:t binda till lipidmembranen i 20 minuter vid rumstemperatur.Medan blandningen inkuberar, ersätta supernatant av 293T cellkultur med en milliliter av färskt odlingsmedium, och försiktigt lägga 0,5 milliliter av lämplig liposom DNA-blandning till varje brunn. Återför cellerna till cellodlingsinkubatorn i 12 till 16 timmar innan du ersätter supernatanten i varje brunn med en milliliter färskt odlingsmedium kompletterat med antibiotika. Efter ytterligare 36 timmars inkubation, pool supernatanterna i ett koniskt rör per lentivirus stam till sediment de 293T celler genom centrifugeringen.Överför sedan de lentivirus RR-innehållande supernatanterna till individuella 1,5-milliliter sterila polypropylenlagringsrör för förvaring vid minus 80 grader Celsius. För lentiviral transduktion för genuttryck i 4T1 brösttumörceller, ersätt supernatanten i varje brunn av en sex-väl 4T1 cellodlingsplatta med en milliliter av färskt RPMI-baserat cellkulturmedium kompletterat med fetalt bovint serum och en milliliter lentiviral stock. Tillsätt sedan åtta mikrogram per milliliter Polybrene till varje brunn, och försiktigt pipettera några gånger för att blanda.Centrifugera plattan för att öka transduktionseffektiviteten, och återföra cellerna till cellodlingsinkubatorn i fyra till 12 timmar. I slutet av inkubationen, ersätta supernatanten i varje brunn med färskt odlingsmedium kompletterat med serum och antibiotika för att avlägsna eventuella lentiviralpartiklar och Polybrene. För att välja för de lentivirus-transduced cellerna, passage de transduced 4T1 cellkulturer på en-till-tre till en-till-fyra förhållande med urval medium, ändra mediet varannan till tre dagar.Efter sju dagar av urval medium kultur, visa de transduced cellkulturerna under en fluorescens inverterad fas kontrast mikroskop och räkna antalet röda fluorescerande protein-positiva eller RFP-4T1 celler och alla de 4T1 celler i tre synfält för att uppskatta den RFP-positiva förhållandet. För att ställa in en tumörbärande musmodell, tvätta 80%konfluenta transduced cellkulturer med PBS innan lossnar cellerna med två milliliter trypsin-EDTA per 60-millimeters odlingsplatta. När cellerna har lyft från plattan bottnar stoppa reaktionen med fem till 10 milliliter serum kompletteras medium per platta.Och överföra kulturerna till enskilda 15-milliliter centrifugrör för räkning. Späd cellerna till en en gånger 10 till de sjätte cellerna per 100 mikroliter av odlingsmedium utan serumkoncentration. Och subkutant injicera 100 mikroliter av 4T1-RR cellinje i den vänstra axeln av en sövd tumör-bärande modell mus, och 100 mikroliter av 4T1-RRT cellinje i den högra axeln av samma mus.Efter injektionerna, placera varje mus i ett lämpligt återhämtningsområde med ett termiskt stöd tills den återhämtat sig helt. Palperas tumörmassorna varje dag i sju dagar för att bekräfta att mössen är tumörbärande. Vid dag sju post-implantation, intraperitoneally injicera 50 mikrogram per kilo Ganciclovir i varje tumörbärande mus två gånger per dag fram till slutet av experimentet.För tumörtillväxt, öppna Living Imaging System. Initiera Living Imaging-programvaran och initiera systemet. Medan systemet är initiering, använd en insulinspruta för att injicera varje mus som ska avbildas med lämplig volym av coelenterazine i retrobulbar.Placera de injicerade mössen i kamerakammaren och skaffa omedelbart flera bilder av musen dorsal för att förvärva Renilla luciferassignalerna från 4T1-celler tills bioluminescerande signaler bleknar bort. 10 minuter efter avbildningen av Renilla luciferas, använd en insulinspruta för att intraperitoneally injicera lämplig volym av D- luciferin i varje djur. 10 minuter efter D-luciferin injektion, placera mössen i kameran kammaren och få flera bilder av musen dorsala att förvärva Firefly luciferase signaler från angiogenes.Efter lentivirus transduction, mer än 99%av cellerna är RFP-positiva med inga skillnader i cellkultur morfologi observerats mellan de två transduced cellinjer. Därefter bioluminescens imaging av de transduced cellerna visar att båda cellinjerna avger starka bioluminescerande signaler av en liknande styrka. Efter subkutan injektion av de transduced cellinjerna i en transgen tumör-bärande mus modell, angiogenes-inducerad tumör tillväxt kan utvärderas av Firefly luciferas signaler i närvaro av D-luciferin i samma djur.Vid sju dagars post-implantation, Ganciclovir administration inducerar död i 4T1-RRT cellerna vilket resulterar i en dramatisk minskning av Renilla luciferas signalen i tumörer som fastställts av dessa celler. Firefly luciferas signaler ökar också i samband med en ökning av Renilla luciferas uttryck och minska efter luciferas nedgång. Sammantaget tyder dessa resultat på att det finns en direkt korrelation mellan tumörangiogenes och tumörtillväxt.Faktum är att Ganciclovir-inducerad tumör celldöd kan leda till en hämning av tumör angiogenes. Vidare, immunfärgning för anti-vaskulär endotel tillväxtfaktor receptor II, som en markör för angiogenes, avslöjar en mer påtagligt etablerad microvascular struktur i 4T1-RR tumör vävnad sektioner än i avsnitt från 4T1-RRT tumörer, överensstämmer med nedgången i Firefly luciferase signal observeras efter Ganciclovir administration. Det mest kritiska steget i protokollet är att använda två typer av luciferas, såsom FLuc och RLuc för samtidig spårning av cellerna och angiogenes.Denna teknik skulle kunna användas för att behandla cancerceller inom olika platser, och det kan användas i stor utsträckning i viruscancer modeller. Denna mus modell tillåter tumörtillväxt och anti-tumör effekterna av HSV-ttk/GCV spårningssystem som ska visualiseras dynamiskt i ett levande djur. En biosäkerhet nivå II anläggning krävs för att förhindra en lentivirus transfection, eftersom media innehåller lentivirus partiklar som kan vara skadliga för människor.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Dual-mode scanning av kutana syresättningen av vävnaderna och kärlfunktionen

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Övervakning tumör metastaser och Osteolytiska lesioner med mareld och Micro CT

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescence avbildning av tumör Hypoxi Dynamics i bröstcancer metastaser i hjärnan i en musmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller för 4D Live-cell imaging av tumör: mikromiljö Interaktioner som påverkar malign progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo avbildning av blodkärl i tumören med hjälp av fluorescens Confocal videomikroskopi

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Högupplöst<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknik för att studera dynamiska svaret för intrakraniell Structures till tumörtillväxt och Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm utveckling på Medicinskt-relevanta främmande föremål i en mus Subkutan Model Följt av Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Inrättande av en människa multipelt myelom xenograftmodell i Chicken att studera tumörtillväxt, invasion och Angiogenes

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...