Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Bu araştırma Çin Ulusal anahtar R & D programı (2017YFA0103200), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81671734) ve Tianjin bilim ve teknoloji destek programı (18YFZCSY00010) anahtar projeleri, temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir Merkezi üniversiteler (63191155). Biz Gloria Nance 's revizyonlar, bizim el yazması kalitesini iyileştirmek için değerli olduğunu kabul ediyoruz.

Deneyler, hayvanların araştırma amaçlı kullanımı ile ilgili ulusal ve kurumsal düzenlemelere uymalıdır. Denemeler yürütmek için izinler elde edilmelidir. Hayvanların tedavisi ve çalışmanın deneysel prosedürler Nankai Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi yönergelerine uygun hayvan bakımı için yönergeler Ulusal Sağlık Enstitüsü (NıH) tarafından onaylanmış uyması.
1. LV-Rluc-RFP (RR) ve LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral paketleme ve üretim
<p ...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

Bu protokolde, tümör gelişimi ve anjiyogenezi izlemek için invaziv olmayan çift BLı yaklaşımı açıklanmıştır. BLı muhabiri sistemi ilk olarak HSV-TTK/GCV intihar geni ve Rluc görüntüleme tarafından tümör progresyonu ve regresyon in vivo takip için içerir geliştirilmiştir. Bu arada, tümör anjiyojenezi Fluc görüntüleme yoluyla Vegfr2-Fluc-KI fareler kullanılarak değerlendirilir. Bu tümör taşıyan fare modeli, sürekli ve non-invaziv izleme tümörü gelişimi için pratik bir platform ve y...

Angiogenesis, küçük, lokalize neoplazmların daha büyük, potansiyel metastatik tümörlerden1,2' ye kadar kanserin ilerlemesini temel bir süreçtir. Tümör büyüme ve anjiyojenez arasındaki korelasyon Onkoloji araştırması alanında vurgu noktalarından biri haline gelir. Ancak, morfolojik değişikliklerin ölçülmesi için geleneksel yöntemler, görsel bir yaklaşım kullanarak yaşayan hayvanlarda tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi aynı anda izlemez.
Tümör hücrelerinde biyoluminesans görüntüleme (Bli), invaziv olmayan, duyarlılık ve özgüllüğü nedeniyle tümör büyümesini izlemek için özellikle uygun bir deneysel yöntemdir3,4,5,6 . Bli teknolojisi, Lusiferaz 'ın biyoluminesans yayan belirli bir substrat oksidasyonunu katalizleştirebilmesine temel alınarak tasarlanmıştır. İmplante edilen tümör hücrelerinde ifade edilen Lusiferaz, yaşayan bir görüntüleme sistemi tarafından tespit edilebilen enjekte edilmiş substrat ile tepki verir ve sinyaller, vivo6,7' deki hücre numarası veya hücre lokalizasyonunda yapılan değişiklikleri dolaylı olarak yansıtır.
Tümör büyümesi dışında, tümör anjiyogenezi (kanser progresyonunda kritik adım) Vegfr2-Fluc-kı transjenik fareler kullanarak Bli teknolojisi ile görselleştirilebilir8,9,10. Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) reseptör 2 (Vegfr2), bir tür VEGF reseptörü, çoğunlukla yetişkin farelerin vasküler endotel hücrelerinde ifade edilir11. Vegfr2-Fluc-kı transjenik fareler, Firefly Lusiferaz (Fluc) DNA dizisi endojen Vegfr2 dizisinin ilk eXoN içine çarptı. Sonuç olarak, Fluc farelerde anjiyogenez düzeyine benzer bir şekilde (BLı sinyalleri olarak görünür) ifade edilir. Büyüklüğü birkaç milimetre ötesinde büyümek için, tümör mevcut kan damarlarından yeni vasculatures acemi, hangi son derece tümör hücrelerinden büyüme faktörleri tarafından tetiklenen Vegfr2 ifade1. Bu Vegfr2-Fluc-KI transjenik fareler kullanarak olasılığı açar-invazif BLı tarafından tümör anjiyojenezi izlemek.
Bu protokolde, sırasıyla Firefly Lusiferaz (Fluc) ve Renilla Lusiferaz (rluc) görüntüleme ile tek bir fare içinde tümör ilerlemesi ve anjiyojenezi izlemek için bir tümör taşıyan fare modeli kurulmuştur (Şekil 1). Bir 4T1 hücre hattı (4T1-RR), rluc ve kırmızı floresan proteini (RFP) r-görüntüleme ile hücre büyümesini takip etmek için stabil bir şekilde ifade eden oluşturulur. Tümör progresyon ve regresyon anjiyojenik dinamik değişiklikleri daha fazla araştırmak için, başka bir 4T1 hücre hattı (4T1-RRT) intihar gen herpes simpleks virüs kesilmiş tirosin kinaz ifade oluşturulur (HSV-TTK), Rluc, ve RFP. Gansiklovir (GCV) yönetimiyle, hücreleri ifade eden HSV-TTK seçici olarak ablasyona aittir. Bu hücre hatlarına dayanarak, Vegfr2-Fluc-KI farelerinde tümör taşıyan bir model, tümör progresyonu ve tümör anjiyogenezi içinde vivo olarak deneysel bir model olarak hizmet vermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

Anjiyogenezi, tümör ilerlemesinin önemli bir süreci olarak, anti-tümör tedavisinin bir araştırma Hotspot ve hedef haline gelmiştir. Ancak, görsel ve hassas bir şekilde aynı anda tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi izlemek için güvenilir bir model yoktur. Bioluminescence görüntüleme, yüksek hassasiyet, güçlü özgüllük ve doğru ölçüm avantajları nedeniyle canlı görüntülemede benzersiz üstünlüğü gösterir. Burada sunulan, anjiyojenez kaynaklı Firefly Lusiferaz ifadesi ile transgenik fare içine Renilla Lusiferaz etiketli murine meme kanseri hücre hattı 4t1 enjekte ederek bir tümör taşıyan fare modeli kurmak için bir protokoldür. Bu fare modeli, tek bir fare içinde çift biyolüminesans görüntüleme tarafından gerçek zamanlı olarak tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi aynı anda izlemek için değerli bir araç sağlar. Bu model yaygın anti-tümör ilaç taraması ve onkoloji araştırması uygulanabilir.

Bu deneyde, tümör büyüme ve tümör anjiyogenezi arasındaki ilişkiyi araştırmak için 4T1 hücre kullanılarak bir meme kanseri fare modeli kuruldu (Şekil 1). Birincisi, iki Lentivirus paketlenmiş, hangi Rluc/RFP ifade gen dizileri taşınan (LV-RR) ve Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), sırasıyla, daha önce bildirilen7. Ardından, 4T1-RR ve 4T1-RRT adlı iki farklı 4T1 hücre çizgisi, sırasıyla LV-RR ve LV-RRT dönüştürüc?...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Bu protokol, Çift Bioluminesans görüntüleme ile tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi gerçek zamanlı olarak izlemek için tümör taşıyan bir fare modelinin kurulması açıklanmaktadır.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Anjiyogenez tümör metastazı ve ilerlemesinde önemli rol oynar. Bu protokolde, meme kanserinin fare modelinde dinamik tümör progresyonunu ve anjiyogenezi izlemek için çift biyolüminesans görüntüleme yöntemini kullanacağız. Bu modelde, sırasıyla Firefly luciferase ve Renilla luciferase görüntüleme ile tek fare de tümör büyüme ve anjiyogeneziz eş zamanlı olarak izleyebilirsiniz.Bu model antitümör ilaç tarama ve onkoloji araştırmalarında yaygın olarak uygulanabilir. Bu çift biyolüminesans modeli tümör progresyonu ve regresyon izlemek ve terapötik stratejilere yanıt olarak tümör ile ilgili moleküler süreçleri tespit etmek için kullanılabilir. Anjiyogenez tümörün ilerlemesinin önemli bir sürecidir.Bu nedenle etkili tümör tedavilerini geliştirmek için tümör progresyonu ve anjiyogenezingörsel ve hassas bir şekilde izlenmesi gereklidir. Prosedürler Kaiyue Zhang, Chen Wang ve Shang Chen, bizim laboratuvar öğrencileri tarafından gösterilecek. Lentivirus paketleme ve üretim tohumu için bir kez 10 dmem iki mililitre 293T hücrelerinin altıncı için iyi bir geceleme için altı iyi bir plaka içine fetal sığır serum u tamamlanır 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi.Ertesi sabah oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için iki ayrı 1,5 mililitre tüpler minimal Esansiyet Orta 250 mikrolitre ile lipozom 7.5 mikrolitre karıştırın. DNA çözeltilerini hazırlamak için plazmid lentivirus RR vektörü ve yardımcı plazmidleri tabloda belirtildiği gibi tek tek 1,5 mililitrelik tüplerde 250 mikrolitre Minimal Essential Medium'a ekleyin. Kuluçka sonunda yavaşça bir damla akıllıca lipozom süspansiyonlar için DNA RR çözümleri ekleyin ve DNA oda sıcaklığında 20 dakika boyunca lipid membranlar bağ sağlar.Karışım kuluçka yakarken, 293T hücre kültürünün süpernatantını bir mililitre taze kültür ortamıyla değiştirin ve her kuyuya uygun lipozom DNA karışımının 0,5 mililitresini nazikçe ekleyin. Antibiyotikler ile desteklenen taze kültür ortamı bir mililitre ile her kuyuda supernatant değiştirmeden önce 12 ila 16 saat hücre kültürü kuluçka için hücreleri iade edin. Ek bir kuluçka 36 saat sonra, santrifüj ile 293T hücreleri tortu lentivirus suşu başına bir konik tüp içine supernatants havuz.Sonra eksi 80 santigrat derece depolama için bireysel 1.5 mililitrelik steril polipropilen depolama tüpleri içine lentivirus RR içeren supernatants aktarın. 4T1 meme tümörü hücrelerinde gen ekspresyonu için lentiviral transdüksiyon için, fetal sığır serumu ve bir mililitre lentiviral stok ile desteklenen taze RPMI tabanlı hücre kültürü orta bir mililitre ile altı iyi 4T1 hücre kültürü plaka her kuyuda supernatant değiştirin. Sonra her kuyuya mililitre başına sekiz mikrogram Polibrene ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe pipet.Transdüksiyon verimliliğini artırmak için plakayı santrifüj edin ve hücreleri 4 ila 12 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda, taze kültür orta serum ve antibiyotikler ile takviye taze kültür ortamı ile her kuyuda supernatant değiştirin herhangi bir lentiviral parçacıklar ve Polibren kaldırmak için. Lentivirus'un transize edilen hücreleri seçmek için, transduced 4T1 hücre kültürlerini seçim ortamıyla bire bir-dört oranında geçirin ve ortayı her iki ila üç günde bir değiştirin.Seçim orta kültür yedi gün sonra, bir floresan ters faz kontrast mikroskop altında transduced hücre kültürleri görüntülemek ve kırmızı floresan protein-pozitif veya RFP-4T1 hücrelerinin sayısını saymak ve görüş üç alanda 4T1 hücrelerinin tüm RFP-pozitif oranını tahmin etmek. Tümör taşıyan bir fare modeli kurmak için, 60 milimetrelik kültür plakası başına iki mililitre tripsin-EDTA ile hücreleri ayırmadan önce PBS ile %80 eşzamanlı transdükse hücre kültürlerini yıkayın. Hücreler plaka diplerinden kaldırDığında plaka başına 5 ila 10 mililitre serum takviyesi ile reaksiyonu durdurur.Ve saymak için kültürleri 15 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın. Hücreleri serum konsantrasyonu olmadan 100 mikrolitre kültür ortamı başına 10 ila altıncı hücrelere kadar bir kez seyreltin. Ve subkutan bir şekilde 4T1-RR hücre hattının 100 mikrolitresini anestezik tümör taşıyan model farenin sol omzuna ve 4T1-RRT hücre hattının 100 mikrolitresini aynı farenin sağ omzuna enjekte edin.Enjeksiyonlardan sonra, her fareyi tamamen iyileşene kadar termal destekle uygun bir kurtarma alanına yerleştirin. Farelerin tümör taşıdığını doğrulamak için yedi gün boyunca her gün tümör kitleleri palpate. Yedinci gün implantasyon sonrası, intraperitoneally her tümör taşıyan fare içine gansiclovir kilogram başına 50 mikrogram enjekte deney sonuna kadar günde iki kez.Tümör büyümesi için, Yaşayan Görüntüleme Sistemi açın. Living Imaging yazılımını başlangıç ve sistemi başlatma. Sistem başbaşlarken, retrobulbar içine coelenterazine uygun hacmi ile görüntülenecek her fare enjekte etmek için bir insülin şırınga kullanın.Enjekte edilen fareleri kamera odasına yerleştirin ve biyolüminesans sinyalleri kaybolana kadar 4T1 hücrelerinden Renilla luciferase sinyallerini elde etmek için fare nin birkaç fotoğrafını hemen alın. Renilla luciferase görüntüleme 10 dakika sonra, intraperitoneally her hayvaniçine D-luciferin uygun hacmi enjekte etmek için bir insülin şırınga kullanın. D-luciferin enjeksiyonundan 10 dakika sonra, fareleri kamera odasına yerleştirin ve anjiyogenezden Firefly luciferase sinyallerini elde etmek için fare dorsalının çeşitli görüntülerini elde edin.Lentivirüs transdüksiyonundan sonra hücrelerin %99'dan fazlası RFP pozitiftir ve iki transdüktör hücre çizgisi arasında gözlenen hücre kültürü morfolojisinde farklılık yoktur. Daha sonra, transekten hücrelerin biyolüminesans görüntüleme her iki hücre hatları benzer bir güç güçlü biyolüminesans sinyalleri yontma ortaya koymaktadır. Transdükse hücre hatlarının transgenik tümör taşıyan fare modeline deri altı enjeksiyonundan sonra, anjiyogenez kaynaklı tümör büyümesi aynı hayvanda D-luciferin varlığında Firefly luciferase sinyalleri ile değerlendirilebilir.Yedi gün sonra implantasyon, Ganciclovir yönetimi 4T1-RRT hücrelerinde ölüme neden olan bu hücreler tarafından kurulan tümörlerde Renilla luciferase sinyaldramatik bir azalma ile sonuçlanan. Firefly luciferase sinyalleri de Renilla luciferase ifade bir artış ile birlikte artış ve luciferase düşüş aşağıdaki azalma. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar tümör anjiyogenezve tümör büyümesi arasında doğrudan bir korelasyon olduğunu düşündürmektedir.Gerçekten de, Gansiclovir kaynaklı tümör hücre ölümü tümör anjiyogenezinin inhibisyonuna yol açabilir. Ayrıca, anti-vasküler endotelsel büyüme faktörü reseptörü II için immünboyama, anjiyogenez bir belirteç olarak, 4T1-RR tümör dokusu bölümlerinde daha önemli bir mikrovasküler yapı ortaya 4T1-RRT tümörlerden bölümlerde daha, Ganciclovir uygulamadan sonra gözlenen Firefly luciferase sinyaldüşüş ile tutarlı. Protokolün en kritik adımı, hücrelerin ve anjiyogenezin eşzamanlı takibi için FLuc ve RLuc gibi iki tür luciferase kullanmaktır.Bu teknoloji farklı yerlerde kanser hücrelerinin tedavisinde kullanılabilir, ve virüs kanseri modellerinde yaygın olarak kullanılabilir. Bu fare modeli, hsv-ttk/GCV takip sisteminin tümör büyümesine ve anti-tümör etkilerinin canlı bir hayvanda dinamik olarak görselleştirilmesine olanak sağlar. Bir biyogüvenlik seviyesi II tesis lentivirus transfeksiyon önlemek için gereklidir, medya insanlar için zararlı olabilir lentivirus parçacıkları içerir gibi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Kutanöz Doku oksijenasyon ve Damar Fonksiyon dual-mode Görüntüleme

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Biyoparlaklık ve Micro CT Görüntüleme Tümör Metastazlari ve osteolitik Lezyonlar İzleme

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...