Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

ويمول هذا العمل من قبل R00 ES024806 (المعاهد الوطنية للصحة)، DMS-1761320 (المؤسسة الوطنية للعلوم) وصناديق بدء التشغيل من جامعة ولاية ميشيغان. يرغب المؤلفون في شكر الدكتور جون يانغ (جامعة كاليفورنيا في ديفيس) ولاليتا كرشالا (جامعة ولاية ميتشيغان) على مساعدتهم في تحسين التفاعل الأنزيمي، والدكتور توني شيلميلر (مرفق قياس الطيف الكتلي وMetabolomics) للحصول على المساعدة في الحصول على بيانات إدارة الموارد البشرية.

تحذير: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.
1. التعبير عن البرية من نوع BM3
<ol><li>التلقيح PBS-BM3 المصابة DH5α E. القولونية (تبرع سخي من الدكتور F. آن ووكر) في 5 مل من مرق LB معقمة مع 0.5 ملغ من الأمبيسلين وأضاف في أنبوب ثقافة ...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

نحن نقدم هنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة من الناحية التشغيلية لإعداد اثنين من الأيض الايبوكسي الأكثر وفرة من إدارة الشؤون الإنسانية - 19،20 و 16،17-EDP. هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي يمكن إعدادها في enantiopure للغاية (كما S، R-isomers) باستخدام الإنزيم BM3 من نوع البرية. ويرد أدناه وصف العديد من ...

كما نمت الاهتمام في الدور الذي الأحماض الدهنية غير المشبعة (وخاصة أوميغا 3 وأوميغا 6 الأحماض الدهنية غير المشبعة) في البيولوجيا البشرية في السنوات الأخيرة، وقد أحاط الباحثون علما مجموعة واسعة من الفوائد الجذابة التي الأيض بهم المعرض. على وجه الخصوص، الأيض الأحماض الدهنية الايبوكسي التي تنتجها فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات كانت نقطة تركيز كبيرة. على سبيل المثال، تلعب العديد من الايبوكسيات الايبوكسية ، بما في ذلك الأحماض الايبوكسيكوساترينيويك (EETs) ، الأحماض الايبوكسيدوسابنتينويك (EDPs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs) ، دورا حاسما في تنظيم ضغط الدم والتهاب1،2 , 3 , 4 , 5. ومن المثير للاهتمام، ومن المعروف أن enantiomers محددة وregioisomers من أأ وإيبوكسيدات وكالة حماية البيئة أن لها آثار متفاوتة على مضيق الأوعية6،7. في حين تم توثيق الآثار الفسيولوجية للأنانتيومرات وregioisomers من EETs وEEJs، لا يعرف سوى القليل عن تأثير الأحماض الايبوكسي الايبوكسية المماثلة (EDPs) التي تشكلت من إدارة الشؤون الإنسانية. الاستخدام الواسع النطاق لزيت السمك8، وهو غني في كل من وكالة حماية البيئة وإدارة الشؤون الإنسانية ، كما أثار الاهتمام في EDPs9. ويعتقد أن فوائد هذه المكملات الغذائية جزئيا بسبب نواتج الأيض DHA المصب (16,17-EDP و 19,20-EDP كونها الأكثر وفرة) لأنه في مستويات الجسم الحي من EDPs تنسيق جيد جدا مع كمية من إدارة الشؤون الإنسانية في النظام الغذائي10, 11.
وقد ثبت دراسة آليات وأهداف هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي من قبل الميتابولوميك، البيولوجيا الكيميائية، وغيرها من الأساليب تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها موجودة كخليط من regio- وستيريو الايزومرات، وطريقة للحصول على كميات نقية من مطلوب انانتيومرات وregioisomers. وقد ثبت أن الوسائل التقليدية لتوليف هذه المركبات كيميائيا غير فعالة. استخدام peroxyacids مثل حمض ميتاكلوروبروكسي بنزويك للإبكسيدات له العديد من العيوب، ولا سيما عدم الانتقائية إبكسيدون، مما يتطلب تنقية مكلفة ومضنية من regioisomers الفردية وenantiomers. التوليف الكلي للإدارة ووكالة حماية البيئة المستقلات ممكن, ولكن يعاني أيضا من العيوب التي تجعل من غير العملي لتركيب على نطاق واسع مثل ارتفاع التكاليف وانخفاض الغلة12,13. يمكن تحقيق كفاءة الإنتاج العام مع التوليف الأنزيمي، كما ردود الفعل الأنزيمية هي regio- وstereoselective14. تظهر الدراسات أن الايبكسيد الأنزيمي لAA وEPA (مع BM3) هو على حد سواء regioselective وenantioselective15،16،17،18، ولكن هذا الإجراء لم يتم اختباره مع إدارة الشؤون الإنسانية ، أو على كبير نطاق. وكان الهدف العام من أسلوبنا لتوسيع وتحسين هذا الايبوكسيد chemoenzymatic لإنتاج كميات كبيرة بسرعة من الأحماض الدهنية الايبوكسي النقية كما enantiomers الفردية الخاصة بهم. باستخدام الطريقة المعروضة هنا، والباحثين الوصول إلى استراتيجية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتركيب EDPs وغيرها من الأيض الايبوكسي بوفا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

الأيض epoxidized من مختلف الأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs)، يطلق عليها الأحماض الدهنية الايبوكسي، لديها مجموعة واسعة من الأدوار في علم وظائف الأعضاء البشرية. يتم إنتاج هذه الأيض الذاتية من قبل فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات. بسبب آثارها البيولوجية المتنوعة والقوية، هناك اهتمام كبير في دراسة هذه الأيض. تحديد الأدوار الفريدة لهذه الأيض في الجسم مهمة صعبة, كما يجب أولاً الحصول على الأحماض الدهنية الايبوكسي بكميات كبيرة وعالية النقاء. الحصول على مركبات من المصادر الطبيعية غالباً ما تكون كثيفة العمالة، وثنائي أكسيد الذوبان (sEH) بسرعة hydrolyze الأيض. من ناحية أخرى، الحصول على هذه الأيض عن طريق التفاعلات الكيميائية غير فعالة للغاية، وذلك بسبب صعوبة الحصول على regioisomers النقي وenantiomers، وانخفاض الغلة، وواسعة النطاق (ومكلفة) تنقية. هنا، نقدم تخليق الأنزيمية كفاءةمن 19 (S)، 20 (R) - و 16 (S)، 17 (R) - الأحماض الايبوكسي (R)-الايبوكسيدوسابنتانويك (EDPs) من إدارة الشؤون الإنسانية عن طريق الايبكسيد مع BM3، وهو إنزيم CYP450 البكتيرية معزولة أصلا من عصية megaterium (التي يتم التعبير عنها بسهولة في القولونية الإشريكية). يتم إجراء التوصيف وتحديد النقاء باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، والقياس الطيفي الكتلي (MS). يوضح هذا الإجراء فوائد التوليف الأنزيمي للأيضات الايبوكسي PUFA، وينطبق على الايبوكسيال الايبوكسي الأحماض الدهنية الأخرى، بما في ذلك حمض الأراشيدونيك (AA) وحمض eicosapentaenoic (EPA) لإنتاج الايبوكسيكوساتينويك المماثل الأحماض (EETs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs)، على التوالي.

ويرد في الشكل 1كروماتوغرام عمود الفلاش (الذي يتم تنفيذه باستخدام نظام تنقية الفلاش الآلي كما هو موضح أدناه) عند تنقية الخليط الخام من الأيبكسيد الأنزيمي . بعد استراتيشن وفصل regioisomers، نقية16 (S)، 17 (R)-EDP و 19 (S)، 20 (R) - EDP تم الحصول على استرات الميثيل....

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

التوليف الأنزيمي للميتابوليت الأيبسيدية من الدوكوساهيكسانويك، إيكوسابنتانويك، وحمض الأراكيدونية

نقدم طريقة مفيدة للتوليف الأنزيمي على نطاق واسع وتنقية enantiomers محددة وregioisomers من ايبوكسيدات حمض الأراشيدونيك (AA)، وحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)، وحمض eicosapentaenoic (EPA) مع استخدام السيتوكروم البكتيرية P450 انزيم (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

لذلك يسمح لنا بروتوكولنا بإعداد الأحماض الدهنية الإيبوكسي ، وقد تساعد هذه الطريقة في تقدم الأبحاث على الآليات التي تعمل بها هذه الأيضات في الجسم. تاريخيا، الأحماض الدهنية الايبوكسي نقية من الصعب جدا الحصول عليها. لذلك بروتوكول لدينا هو بسيط وسريع وفعال من حيث التكلفة، وأنه يسمح لنا لإعداد كميات كبيرة من هذه الأيض.نعم، قمنا بتطوير بروتوكول لإدارة الشؤون الإنسانية، لكنه يعمل أيضا بشكل جيد جدا لوكالة حماية البيئة وحمض arachidonic. العمل بسرعة، وبعض الكواشف حساسة للهواء، وبالتحديد DHA و NADPH، وتأكد من إقران كل شيء مقدما بحيث يكون الإعداد بسيطًا. أيضا، أن تكون على بينة من المخاطر.يستخدم بروتوكولنا تقنيات في كل من علم الأنزيم والكيمياء العضوية. يعد التصور أمرًا بالغ الأهمية لمساعدة القراء والمشاهدين الذين لا يعرفون التقنيات المتخصصة في هذه المجالات. للتطعيم، استخدم حلقة معقمة أو ماصة مغموسة في مخزون الجلسرين من pBS-BM3 transfected DH5-ألفا E.coli إلى خمسة ملليلتر من مرق LB العقيمة المكملة مع 0.5 ملليغرام من الأمبيسيلين.احتضان ثقافة الخلية في شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. ثم، إضافة ثقافة بداية خمسة ملليلتر و 100 ملليغرام من الأمبيسيلين إلى لتر واحد من مرق LB العقيمة في قارورة Erlenmeyer. يهز في 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات في 200 دورة في الدقيقة، ثم في 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.بعد ذلك، وجمع ثقافة الخلية في أنابيب الطرد المركزي، والطرد المركزي ثقافة الخلية في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 1،000 مرات ز. صب قبالة زانة في قارورة أخرى. تطهير مع التبييض أو باستخدام الأوتوكلاف، وتخزين بيليه الخلية في ناقص 78 درجة مئوية حتى تنقية انزيم.لأداء تحلل الخلية، أولا ذوبان بيليه الخلية على الجليد، و resuspend في 40 ملليلتر من الجليد الباردة solubilization العازلة التي تحتوي على تريس، PMSF، وEDTA. بينما على الجليد، sonicate الخلايا لمدة دقيقة واحدة مع التجانس بالموجات فوق الصوتية، مع إعداد قوة الانتاج من 10 وواجب من 100، تليها استراحة دقيقة واحدة على الجليد من أجل تسييز الخلايا. كرر هذا الإجراء ست مرات.الطرد المركزي الخلية lysate في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في 11،000 مرات ز إلى بيليه حطام الخلية. لأداء اللوني تقارب، في غرفة باردة أو ثلاجة مع باب منزلق، في أربع درجات مئوية، أولا إعداد عمود اللونية تبادل أنيون قوية عن طريق غسل الراتنج مع وحدات التخزين خمسة أعمدة من العازلة A من تريس 10 ملليمولار في درجة الحرارة 7.8. بعد ذلك ، إضافة عظمى من الخلية lysates إلى العمود التوازنية ، وغسل العمود مع ثلاثة مجلدات العمود من المخزن البارد A.Then ، elute BM3 عن طريق غسل العمود مع ستة مجلدات العمود من المخزن البارد B من تريس 10 ملليمولار وكلوريد الصوديوم 600 ملليمولار.جمع الكسر المحمر البني eluent. إذا لم يتم استخدام البروتين على الفور، اخلطه مع حجم متساو من الجلسرين، وفلاش تجميد مع النيتروجين السائل. تخزين الحل المجمدة في ناقص 78 درجة مئوية.لأداء إبوكسيد من إدارة الشؤون الإنسانية، أولا تحديد تركيز إنزيم BM3 المذاب، وفقا لطريقة تحليل ثنائي أكسيد الكربون الطيفي. ثم، في منقار يحتوي على لترين من العازلة رد فعل يجري تحريكها على لوحة ضجة المغناطيسي، إضافة 0.94 millimoles من DHA المخفف في 18.8 ملليلتر من DMSO وإنزيم BM3 المخفف إلى 20 نانومولر. في حين أن الحل هو اثارة، تبدأ رد فعل إبوكسيديشن بإضافة 8.7 ملليلتر من العازلة التفاعل التي تحتوي على 0.94 ملليمول من NADPH.يحرك رد الفعل لمدة 30 دقيقة في حين محتدما الهواء في خليط التفاعل مع بالون مملوءة بالهواء تعلق على حقنة وإبرة مسجلة على داخل منقار. بعد ذلك ، قم برسم ميكرولتر واحد من خليط التفاعل ، ووضعها في مقياس طيف NanoDrop لقياس الامتصاص عند 340 نانومتر. استخدام الماء كفراغ.إذا لم يكن هناك امتصاص المتبقية، مما يدل على أن NADPH قد استهلكت، رد فعل كامل. يُروى خليط التفاعل بإضافة حمض الأوكسيليك أحادي الضرس ببطء، حتى يصل الأسي من المحلل إلى أربعة تقريباً. الآن، استخراج محلول عازلة مطفأة مع اثنين من لترات من اللامائية، خالية من البيروكسيد دييثيل الأثير.استخدم قمعًا فاصلًا لزعزعة الطبقات وفصلها، وجمع الأثير في قارورة Erlenmeyer. كرر مرتين إضافيتين، وإضافة ما يقرب من 50 غراما من كبريتات المغنيسيوم اللامائية لتجفيف الأثير. على قمع تصفية فراغ، صب الأثير المجفف لتصفية كبريتات المغنيسيوم، ونقل طبقة الأثير المصفاة إلى قارورة مستديرة القاع من المبخر الدوار.ضبط سرعة دوران إلى متوسطة، وبدء الفراغ لتركيز السائل على إنتاج بقايا EDP الخام. قم بتحميل البقايا في خرطوشة سيليكا 40 جرامًا لإجراء كروماتوغرافيا عمود فلاش باستخدام آلة تنقية وميض تلقائية. تبدأ في 10٪ خلات إيثيل في سداسيات، وتتصاعد تصل إلى 60٪ خلات إيثيل في سداسيات على مدى 22 دقيقة.يتم جمع الكسور تلقائيا في الأنابيب. ثم، والجمع بين الكسور من كل قمة في قارورة مستديرة القاع، وضعت على المبخر الدوارة، وبدء التبخر. يتم الحصول على ثلاثة أجزاء، إدارة الشؤون الإنسانية، ايزومرات EDP، و diepoxide.لestrify 0.151 غراما من epoxide، في قارورة مستديرة القاع أو قارورة صغيرة، إضافة ملليلتر اثنين من الميثانول اللامائية وثلاثة ملليلترات من التولوين اللامائية، وإضافة شريط ضجة. ربط قارورة مع بالون مليئة الأرجون من خلال الحاجز المطاطي وإبرة، وإضافة 0.26 ملليلتر من اثنين من المولور TMS-diazomethane من خلال حقنة أثناء التحريك. انتظر 10 دقائق، وإضافة 05 ملليلتر إضافية من TMS-diazomethane حتى يظهر لون أصفر باهت.بعد 30 دقيقة، والتركيز بعناية الخليط باستخدام المبخر الدوارة، واستخدام 40 غرام هلام السيليكا خرطوشة العمود على آلة كروماتوغرافيا فلاش لتنقية المخلفات. Elute مع تركيز متساوي الراسمي من 4٪ خلات الإيثيل في سداسيات أكثر من 22 دقيقة. جمع الكسور التي تحتوي على 19S المنقاة، 20R-EDP ميثيل استر يُستجد أولاً، تليها 16S، 17R-EDP ميثيل إستر.الآن، تقييم الكسور حسب طبقة رقيقة من الكروماتوغرافيا في خليط هيكسان إلى إثيل-خلات من ثمانية إلى واحد. وصمة عار مع برمنغنات البوتاسيوم للتحقق من وجود أي كسور مختلطة تحتوي على كل من الأيزومرات. تركيز الكسور المقابلة لكل قمة على المبخر الدوارة، ومن ثم تزن على التوازن لتحديد كمية استرات EDP التي تم الحصول عليها.إذا بقيت الكسور المختلطة، إعادة اللون لهم مع نفس نظام المذيبات كما كان يستخدم سابقا. تركيز كل كسر يحتوي على كل regioisomer الفردية على المبخر دوارة. لتحويل الفردية EDP استر regioisomers إلى أشكال حمضهم، وتمييع استر EDP في قارورة صغيرة مع ما يقرب من 0.7 ملليلتر من THF لكل 0.1 ملليمول من استر، جنبا إلى جنب مع 0.175 ملليلتر من الماء.تبريد القارورة إلى الصفر درجة مئوية في حمام الثلج، إضافة ثلاثة ما يعادل محلول هيدروكسيد الليثيوم، ويحرك على لوحة ضجة تحت الأرجون بين عشية وضحاها في حين الاحترار إلى درجة حرارة الغرفة. في الصباح ، يطفئ التفاعل بإضافة حمض الفورميك ببطء ، حتى يصل درجة الحموضة في الخليط إلى ثلاثة إلى أربعة. ثم، إضافة الماء واثنين من ملليلتر من خلات الإيثيل لفصل الطبقات.استخراج طبقة المياه مع 10 ملليلتر من خلات الإيثيل ثلاث مرات، وغسل مع 20 ملليلتر من محلول ملحي المشبعة، وإضافة عدة غرامات من كبريتات الصوديوم اللامائية في محلول لتجفيف طبقة خلات الإيثيل. تركيز خلات الإيثيل حل باستخدام المبخر الدوارة، إضافة 10 ملليلتر من سداسيات، والتركيز مرة أخرى. كرر مرتين لإزالة azeotropically حمض الفورميك المتبقية.تنقية بقايا بواسطة الكروماتوغرافيا العمود فلاش، مسيل مع 10 إلى 30٪ خلات إيثيل أكثر من 15 دقيقة. تركيز الكسور المطلوبة في المبخر الدوار، وجافة في vacuo لتحمل حمض النقية. يظهر الكروم العمود فلاش التي تم الحصول عليها عند تنقية الخليط الخام من إبوكسيد الأنزيمية هنا.تم الحصول على ثلاث قمم رئيسية ، مُمَرَّجة في ترتيب ، أولاً ، DHA غير مُجَدَّد ، ثانياً ، خليط من ايزومرات EDP ، وثالثاً ، diepoxide ، وهي منتجات عادية للأكسدة المفرطة. وبعد استر الستيرة وفصل الوزمات الوريجيو، تشير أطياف البروتون NMR إلى أنه تم الحصول على استرات ميثيل 16S و17R-EDP و 19S و 20R-EDP. وأكد Chiral HPLC النقاء enantiomeric من أشكال حمض من EDPs.تأكد من الحفاظ على مرق الخاص معقمة أثناء التعامل مع وتطعيم لتجنب التلوث. ويمكن استخدام إبوكسيديشن للأحماض الدهنية الأخرى. لذلك حاولنا أيضا مع الأحماض arachidonic وeicosapentaenoic، وحصلنا على غلة جيدة من تلك الإكسيدات إينانتيوبر، لذلك 14، 15-EET و 17، 18-EEQ.لذلك فإن البروتوكول الذي يسمح للباحثين بالوصول إلى الأحماض الدهنية الإيبوكسي قد يساعد في الأبحاث على الوظائف البيولوجية لهذه المركبات ، والتي يمكن أن تؤدي إلى استخدامها كدواء يؤدي. والمواد الكيميائية الخطرة هي PMSF، وهي خطرة عن طريق الاتصال، و TMS-diazomethane، وهي سامة جدا عن طريق الاتصال والاستنشاق. لذلك ينبغي أن تستخدم هذه الأخيرة في غطاء الدخان ومع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

تحديد النوعية من الأحماض الكربوكسيلية، الأحماض Boronic، والأمينات طريق Fluorophores صليبي

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

أطر توليف وتوصيف بين functionalized المعدنية العضوية

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

التوليف وتفاعل كيمياء Nanosize أحادية الصوديوم ملح التيتان

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

مدفوعة خفيفة الأنزيمية نزع الكربوكسيل

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

توليف وتوصيف المواد الغروية Supramolecular

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

الهيدروكينون القائم على توليف نانواعواد الذهب

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

توليف الكيماوي الانزيمية من N-جليكانس للتنمية الصفيف وأضداد الفيروس التنميط

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

تتالي الانزيمية ردود لتوليف الكحوليات الأمينية مراوان L-يسين

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...