Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Dette arbejde er finansieret af r00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) og opstart midler fra Michigan State University. Forfatterne ønsker at takke Dr. jun Yang (University of California at Davis) og Lalitha Karchalla (Michigan State University) for hjælp med optimering af den enzymatiske reaktion, og Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry og metabolomics Facility) for at få hjælp til indsamling af HRMS-data.

Forsigtig: Se alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS), før du bruger de anførte kemikalier.
1. udtryk for vildtype BM3
<ol><li>Inokulere pBS-BM3 transficeret DH5α E. coli (en generøs donation fra Dr. F. Ann Walker) i 5 ml steril lb bouillon med 0,5 mg ampicillin tilsættes til en 20 ml kulturrør.</li>
	<li>Cellekulturen inkuleeres i en shaker ved 37 °C i 24 timer ved 200 rpm. Tilsæt den nattende start kultur (5 mL) og 100 mg ampicillin til 1 L steril LB-bouillon i en Fernba...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

Her præsenterer vi en driftsmæssigt enkel og omkostningseffektiv metode til at forberede de to mest rigelige epoxy metabolitter af DHA-19, 20 og 16, 17-EDP. Disse epoxy fedtsyrer kan tilberedes i meget enantiopure (som deres S, R-isomerer) form ved hjælp af Wild-type BM3 enzym. Flere kritiske punkter, som kan anvendes til fejlfinding, og udvidelse af vores metode til at forberede enantiopure epoxy metabolitter af AA og EPA, er beskrevet nedenfor.
BM3 retningslinjer for opbe...

Som interesse i den rolle, som flerumættede fedtsyrer (især Omega-3 og omega-6 flerumættede fedtsyrer) spiller i menneskets biologi er vokset i de seneste år, forskere har taget notits af den brede vifte af tiltalende fordele, at deres metabolitter Udstille. Især epoxy fedtsyre metabolitter produceret af cytokrom P450 klasse af enzymer har været et stort fokuspunkt. F. eks. spiller mange PUFA Epoxider, herunder epoxyeicosatrienoic syrer (Eets), epoxydocosapentaenoinsyre (EDPs) og epoxyeicosatetraenoinsyre (eeqs), en afgørende rolle i reguleringen af blodtryk og inflammation på1,2 , 3 af , 4 af , 5. interessant, de specifikke enantiomerer og regioisomerer af AA og EPA Epoxider er kendt for at have varierende virkninger på vasokonstriktion6,7. Mens de fysiologiske virkninger af enantiomerer og regioisomerer af EETs og EEQs er dokumenteret, vides der kun lidt om virkningen af de analoge epoxydocosapentaenoinsyre (EDPs) dannet af DHA. Udbredt brug af fiskeolie8, som er rig på både EPA og DHA, har også vakt interesse i EDPs9. Fordelene ved disse kosttilskud menes at være delvis på grund af downstream DHA metabolitter (16, 17-EDP og 19, 20-EDP er den mest rigelige), fordi in vivo niveauer af EDPs koordinerer meget godt med mængden af DHA i kosten10, 11. der er
Undersøgelse af mekanismerne og målene for disse epoxy fedtsyrer ved metabolomics, kemisk biologi og andre metoder har vist sig udfordrende, til dels fordi de findes som blandinger af regio-og stereo-isomerer, og en metode til at opnå rene mængder af der er behov for enantiomerer og regioisomerer. Konventionelle midler til kemisk syntese af disse forbindelser har vist sig ineffektive. Anvendelse af peroxysyrer som meta-chloroperoxybensyre til epoxidering har mange ulemper, især manglen på epoxidation selektivitet, som nødvendiggør dyre og omhyggelige rensning af individuelle regioisomerer og enantiomerer. Total syntese af DHA og EPA metabolitter er muligt, men også lider af ulemper, der gør det upraktisk for storstilet syntese såsom høje omkostninger og lave udbytter12,13. Effektiv samlet produktion kan opnås med enzymatisk syntese, da enzymatiske reaktioner er Regio-og stereo selektive14. Undersøgelser viser, at enzymatisk epoxidering af AA og EPA (med BM3) er både regioselective og enantioselektiv15,16,17,18, men denne procedure er ikke blevet testet med DHA, eller på en stor Skala. Det overordnede mål med vores metode var at opskalere og optimere denne kemo enzymatiske epoxidering for hurtigt at producere betydelige mængder af rene epoxy fedtsyrer som deres individuelle enantiomerer. Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, har forskerne adgang til en enkel og omkostningseffektiv strategi for syntese af EDPs og andre PUFA epoxy metabolitter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

De epoxidiserede metabolitter af forskellige flerumættede fedtsyrer (PUFAs), såkaldte epoxy fedtsyrer, har en bred vifte af roller i menneskelig fysiologi. Disse metabolitter produceres endogent af cytokrom P450 klassen af enzymer. På grund af deres mangfoldige og potente biologiske virkninger, er der betydelig interesse i at studere disse metabolitter. Bestemmelse af disse metabolitters unikke roller i kroppen er en vanskelig opgave, da epoxy fedtsyrer først skal opnås i betydelige mængder og med høj renhed. Opnåelse af forbindelser fra naturlige kilder er ofte arbejdskraftintensive, og opløselig epoxid hydrolaser (SEH) hydrolyserer hurtigt metabolitterne. På den anden side, at opnå disse metabolitter via kemiske reaktioner er meget ineffektiv, på grund af vanskeligheden ved at opnå rene regioisomerer og enantiomerer, lave udbytter, og omfattende (og dyre) rensning. Her præsenterer vi en effektiv enzymatisk syntese af 19 (s), 20 (r)-og 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) fra DHA via EPOXIDERING med BM3, et bakterielt CYP450-enzym isoleret oprindeligt fra Bacillus megaterium (som let udtrykkes i Escherichia coli). Karakterisering og bestemmelse af renhed udføres med nuklear magnetisk resonansspektroskopi (NMR), højtydende væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri (MS). Denne procedure illustrerer fordelene ved enzymatisk syntese af PUFA epoxy metabolitter og gælder for epoxidering af andre fedtsyrer, herunder arachidonsyre (AA) og eicosapentaensyre Acid (EPA) til fremstilling af den analoge epoxyeicosatrienoic henholdsvis EETs og epoxyeicosatetraenoinsyre (EEQs).

Flash kolonne kromatogrammet (udført ved hjælp af et automatiseret flash rensningssystem som beskrevet nedenfor) fremkommet ved rensning af den rå blanding fra enzymatisk epoxidering er vist i figur 1. Efter esterificering og adskillelse af regioisomererne blev der opnået rene 16 (s), 17 (r)-EDP og 19 (s), 20 (r)-EDP-methylestere. Typisk, de er til stede i en omtrentlig 1:4 til 1:5 ratio, med det vigtigste produkt er 19...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatisk syntese af Epoxidiserede metabolitter af Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic og arachidonsyre

Vi præsenterer en metode, der er nyttig til storstilet enzymatisk syntese og rensning af specifikke enantiomerer og regioisomerer af Epoxider af arachidonsyre (AA), docosahexaensyre (DHA) og eicosapentaensyre Acid (EPA) med brug af en bakteriel cytokrom P450-enzym (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Så vores protokol giver os mulighed for at forberede enantiopure epoxy fedtsyrer, og denne metode kan bidrage til at fremme forskning på de mekanismer, som disse metabolitter handle i kroppen. Historisk set er rene epoxyfedtsyrer meget vanskelige at opnå. Så vores protokol er enkel, hurtig, omkostningseffektiv, og det giver os mulighed for at forberede betydelige mængder af disse metabolitter.Ja, vi har udviklet en protokol for DHA, men det fungerer også meget godt for EPA og arachidonsyre. Arbejd hurtigt, da nogle af reagenserne er luftfølsomme, specielt DHA og NADPH, og sørg for at parre alt på forhånd, så opsætningen er enkel. Vær også opmærksom på farerne.Vores protokol bruger teknikker i både enzymologi og organisk kemi. Visualisering er afgørende for at hjælpe læsere og seere, der ikke er bekendt med de specialiserede teknikker på disse områder. At vaccinere, bruge en steril løkke eller pipette dyppet i glycerol lager af pBS-BM3 transfected DH5-alpha E.coli i fem milliliter sterile LB bouillon suppleret med 0,5 milligram ampicillin.Inkuber cellekulturen i en shaker ved 37 grader Celsius i 24 timer ved 200 omdrejninger i minuttet. Derefter tilsættes fem-milliliter starter kultur og 100 milligram ampicillin til en liter steril LB bouillon i en Erlenmeyer kolbe. Ryst ved 37 grader Celsius i seks timer ved 200 rpm, derefter ved 30 grader Celsius i 18 timer ved 200 rpm.Derefter indsamles cellekulturen i centrifugerør, og centrifuge cellekulturen ved fire grader Celsius i 10 minutter ved 1.000 gange g. Supernatanten hældes i en anden kolbe. Dekontaminere med blegemiddel eller ved hjælp af autoklaven, og opbevar cellepellet ved minus 78 grader Celsius indtil enzymrensning.For at udføre cellelyse skal du først tø cellepillerne op på is og opslæmre 40 milliliter iskold opløselsesbuffer, der indeholder Tris, PMSF og EDTA. Mens du er på is, sonikere cellerne i et minut med en ultralydshomogenisator, med en udgangseffektindstilling på 10 og pligt på 100, efterfulgt af en et-minutters pause på is for at lyse cellerne. Gentag denne procedure seks gange.Centrifuge cellen lysater ved fire grader Celsius i 30 minutter ved 11, 000 gange g for at pellete cellerester. For at udføre affinitetkromatografi, i et koldt rum eller køleskab med en skydedør, ved fire grader Celsius, først forberede en stærk anion udveksling kromatografi kolonne ved at vaske harpiksen med fem kolonne mængder af buffer A på 10-millimolar Tris på pH 7,8. Dernæst tilsættes supernatant af cellen lysater til den ligevægtede kolonne, og vask kolonnen med tre kolonne mængder af kold buffer A.Derefter eluterer BM3 ved at vaske kolonnen med seks kolonne mængder af kold buffer B på 10-millimolar Tris og 600-millimolar natriumchlorid.Opsaml den rødbrune elluentfraktion. Hvis proteinet ikke anvendes med det samme, blandes det med en tilsvarende mængde glycerol og flash-freeze med flydende nitrogen. Den frosne opløsning opbevares på minus 78 grader Celsius.For at udføre epoxidation af DHA, først bestemme koncentrationen af optøet BM3 enzym, i henhold til kulilte dithionit spektralanalyse metode. Derefter i et bægerglas, der indeholder to liter reaktion buffer omrøres på en magnetisk røre plade, tilsæt 0,94 millimoles af DHA fortyndet i 18,8 milliliter DMSO og BM3 enzym fortyndet til 20 nanomolar. Mens opløsningen er omrøring, begynde epoxidation reaktion ved at tilføje 8,7 milliliter reaktion buffer indeholder 0,94 millimoles af NADPH.Rør reaktionen i 30 minutter, mens der bobles luft ind i reaktionsblandingen med en luftfyldt ballon fastgjort til en sprøjte og nål tapede på indersiden af bægerglasset. Derefter skal du udarbejde en mikroliter af reaktionsblandingen og sætte den i et NanoDrop-spektrofotometer for at måle absorbansen ved 340 nanometer. Brug vand som tom.Hvis der ikke er nogen resterende absorbans, hvilket indikerer, at NADPH er blevet indtaget, er reaktionen komplet. Sluk reaktionsblandingen ved langsomt at tilsætte en-molar oxalsyre dropwise, indtil pH af opløsningen når cirka fire. Nu udtrække slukket buffer løsning med to liter vandfri, peroxid-fri diethyl ether.Brug en separattragt til at ryste og adskille lagene, og opsaml æteren i en Erlenmeyerkolbe. Gentag to ekstra gange, og tilsæt ca. 50 gram vandfri magnesiumsulfat til at tørre æteren. På en vakuumfiltertragt hældes den tørrede æter for at filtrere magnesiumsulfatet, og det filtrerede æterlag overføres til en rundbundet kolbe af den roterende fordamper.Juster omdrejningshastigheden til medium, og start vakuum for at koncentrere væsken for at give rå EDP-rest. Læg restproduktet i en 40-gram silicapatron for at udføre flashsøjlekromatografi ved hjælp af en automatiseret flashrensningsmaskine. Start ved 10% ethylacetat i hexaner, og rampe op til 60% ethylacetat i hexaner over 22 minutter.Brøkene opsamles automatisk i rør. Derefter kombinere fraktioner fra hver top i en rund bundkolbe, sat på den roterende fordamper, og start fordampningen. Tre fraktioner er opnået, DHA, EDP isomerer, og diepoxid.For at esterify de opnåede 0,151 gram epoxid, i en rund-bund kolbe eller lille hætteglas, tilsæt to milliliter vandfri methanol og tre milliliter vandfri toluen, og tilsæt en røre bar. Kolben forbindes med en ballon fyldt med argon gennem en gummiskvæg og en nål, og der tilsættes 0,26 milliliter to-molar TMS-diazomethan gennem en sprøjte under omrøring. Vent 10 minutter, og tilsæt yderligere 05 milliliter TMS-diazomethan, indtil en bleg gul farve vises.Efter 30 minutter skal blandingen forsigtigt koncentreres ved hjælp af den roterende fordamper, og der anvendes en 40-gram silicagelsøjlepatron på flashkromatografimaskinen til at rense restproduktet. Elute med en isokratisk koncentration på 4%ethylacetat i hexaner over 22 minutter. De fraktioner, der indeholder de rensede 19S, 20R-EDP methylester eluates først, efterfulgt af 16S, 17R-EDP methylester.Nu vurdere fraktioner ved tyndt lag kromatografi i en otte-til-en hexan-til-ethyl-acetat blanding. Plet med kaliumpermanganat for at kontrollere for eventuelle blandede fraktioner, der indeholder begge isomerer. De fraktioner, der svarer til hver top, koncentreres på en roterende fordamper, og vægten vejes derefter på en balance for at bestemme mængden af fremkomne EDP-estere.Hvis der stadig er blandede fraktioner tilbage, skal de rekrograf med samme opløsningsmiddelsystem som tidligere anvendt. Hver fraktion, der indeholder den enkelte regioisomer, koncentreres om en roterende fordamper. For at konvertere individuelle EDP methylester regioisomerer til deres syreformer, fortyndes EDP-esteren i et lille hætteglas med ca. 0,7 milliliter THF pr. 0,1 ml ester sammen med 0,175 milliliter vand.Cool hætteglasset til nul grader Celsius i et isbad, tilsæt tre ækvivalenter af lithiumhydroxid opløsning, og rør på en røreplade under argon natten, mens opvarmning til stuetemperatur. Om morgenen, slukke reaktionen ved langsomt at tilføje myresyre, indtil pH af blandingen når tre til fire. Derefter tilsættes vand og to milliliter ethylacetat til at adskille lagene.Vandlaget udvindes med 10 milliliter ethylacetat tre gange, vaskes med 20 milliliter mættet saltlageopløsning, og der tilsættes flere gram vandfri natriumsulfat i opløsningen til tør ethylacetatlaget. Ethylacetatopløsningen koncentreres ved hjælp af den roterende fordamper, der tilsættes 10 milliliter hexaner, og koncentrat igen. Gentag to gange for azeotropically fjerne resterende myresyre.Rensning af restproduktet ved flashsøjlekromatografi, der eluterer med 10 til 30% ethylacetat over 15 minutter. Koncentrat de ønskede fraktioner i den roterende fordamper, og tør i vacuo at give den rensede syre. Flashsøjlen kromatogram opnået ved rensning af den rå blanding fra enzymatisk epoxidation er vist her.Tre store toppe blev opnået, eluting i rækkefølgen af, første, ureageret DHA, andet, blanding af EDP isomerer, og for det tredje diepoxid, som er normale over-oxidation produkter. Efter esterificering og adskillelse af regioisomerne indikerer proton NMR-spektre, at der blev opnået 16S, 17R-EDP og 19S, 20R-EDP-methylestere. Chiral HPLC bekræftede enantiomerisk renhed af de sure former af EDP'er.Sørg for at holde din bouillon steril, mens håndtering og podning for at undgå forurening. Epoxidationen kan bruges til andre fedtsyrer. Så vi har også prøvet det med arachidoniske og eicosapentaenoic syrer, og vi opnåede gode udbytter af disse enantiopure epoxider, så 14, 15-EET og 17, 18-EEQ.Så en protokol, der giver forskerne mulighed for at få adgang til epoxy fedtsyrer kan støtte i forskning i de biologiske funktioner i disse forbindelser, hvilket kan føre til deres anvendelse som narkotika fører. De farlige kemikalier er PMSF, som er farligt ved kontakt, og TMS-diazomethan, som er meget giftigt ved kontakt og indånding. Så sidstnævnte bør anvendes i en røghætte og med korrekt personlige værnemidler.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Kvalitativ Identifikation af carboxylsyrer, borsyrer og Aminer Brug korsformede Fluoroforer

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering af funktionaliserede Metal-organisk Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

Syntese og Reaktion kemi nanostørrelse Mononatrium titanat

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Light-driven Enzymatisk Decarboxylering

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering af supramolekylære Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Hydroquinon Based Syntese af guld nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Kemo-enzymatisk syntese af N- glycans for arrayet udvikling og HIV antistof profilering

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzymatisk Cascade reaktioner til syntese af Chiral Amino alkoholer fra L-lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...