Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Ces travaux sont financés par R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) et des fonds de démarrage de l'Université d'État du Michigan. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jun Yang (Université de Californie à Davis) et Lalitha Karchalla (Michigan State University) pour leur aide dans l'optimisation de la réaction enzymatique, et le Dr Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) pour l'aide à l'acquisition de données DU SMR.

CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'utiliser les produits chimiques énumérés.
1. Expression de type sauvage BM3
<ol><li>Inoculer le pBS-BM3 transfecté DH5MD E. coli (un don généreux du Dr F. Ann Walker) dans 5 ml de bouillon lb stérile avec 0,5 mg d'ampicilline ajouté dans un tube de culture de 20 ml.</li>
	<li>Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 oC pour 24 h à 200 tr/min. Ajou...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

Nous présentons ici une méthode opérationnellement simple et rentable pour préparer les deux métabolites époxy les plus abondants de DHA - 19,20 et 16,17-EDP. Ces acides gras époxy peuvent être préparés en très enantiopure (comme leur S,R-isomers) forme en utilisant l'enzyme de type sauvage BM3. Plusieurs points critiques qui peuvent être utilisés pour le dépannage, et l'extension de notre méthode à la préparation des métabolites époxy éantiopure de AA et EPA, sont décrits ci-dessous.
<p...

Comme l'intérêt pour le rôle que les acides gras polyinsaturés (en particulier les acides gras oméga-3 et oméga-6 gras polyinsaturés) jouent dans la biologie humaine a augmenté ces dernières années, les chercheurs ont pris connaissance de la large gamme d'avantages attrayants que leurs métabolites pièce. En particulier, les métabolites d'acide gras époxy produits par la classe cytochrome P450 d'enzymes ont été un grand point de discussion. Par exemple, de nombreux époxydes PUFA, y compris les acides époxyeicosatrienoic (EET), les acides époxydocosapentaenoic (EDP) et les acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), jouent un rôle critique dans la régulation de la tension artérielle et de l'inflammation1,2 , 3 (en) , 4 ( en plus) , 5. Fait intéressant, les enantiomères spécifiques et les regioisomers des époxydes AA et EPA sont connus pour avoir des effets variables sur la vasoconstriction6,7. Tandis que les effets physiologiques des enantiomers et des regioisomers des EET et des EEQs ont été documentés, peu est connu au sujet de l'effet des acides éoxydocoentaénoïques analogues (EDP) formés à partir de DHA. L'utilisation généralisée de l'huile de poisson8, qui est riche en EPA et En DHA, a également suscité l'intérêt pour les PDE9. Les avantages de ces suppléments sont censés être en partie dus aux métabolites en aval de DHA (16,17-EDP et 19,20-EDP étant les plus abondants) parce que les niveaux in vivo des EDP coordonnent très bien avec la quantité de DHA dans le régime10,, 11.
L'étude des mécanismes et des cibles de ces acides gras époxy par la métabolomique, la biologie chimique, et d'autres méthodes s'est avérée provocante, en partie parce qu'elles existent en tant que mélanges de regio- et de stéréo-isomers, et une méthode d'obtenir des quantités pures de la enantiomers et regioisomers est nécessaire. Les moyens conventionnels pour synthétiser chimiquement ces composés se sont avérés inefficaces. L'utilisation de peroxyacids comme l'acide méta-chloroperoxybenzoïque pour l'époxidation présente de nombreux inconvénients, notamment le manque de sélectivité de l'époxidation, qui nécessite une purification coûteuse et minutieuse des regioisomers et des enantiomères individuels. La synthèse totale des métabolites de DHA et d'EPA est possible, mais souffre également des inconvénients qui le rendent peu pratique pour la synthèse à grande échelle telle que les coûts élevés et les rendements bas12,13. Une production globale efficace peut être réalisée avec la synthèse enzymatique, car les réactions enzymatiques sont regio- et stéréosélective14. Les études montrent que l'époxidation enzymatique de l'AA et de l'EPA (avec BM3) est à la fois regioselective et enantioselective15,16,17,18, mais cette procédure n'a pas été testée avec DHA, ou sur un grand échelle. L'objectif global de notre méthode était d'augmenter et d'optimiser cette époxidation chimioenzymatique pour produire rapidement des quantités significatives d'acides gras époxy purs comme leurs enantiomères individuels. En utilisant la méthode présentée ici, les chercheurs ont accès à une stratégie simple et rentable pour la synthèse des PDE et d'autres métabolites époxy PUFA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

Les métabolites époxidés de divers acides gras polyinsaturés (PUFAs), appelés acides gras époxy, ont un large éventail de rôles dans la physiologie humaine. Ces métabolites sont produits endogènement par la classe cytochrome P450 d'enzymes. En raison de leurs effets biologiques divers et puissants, il y a un intérêt considérable dans l'étude de ces métabolites. Déterminer les rôles uniques de ces métabolites dans le corps est une tâche difficile, car les acides gras époxy doivent d'abord être obtenus en quantités significatives et avec une grande pureté. L'obtention de composés à partir de sources naturelles est souvent laborieuse, et les hydrolases solubles d'époxyde (sEH) hydrolysent rapidement les métabolites. D'autre part, l'obtention de ces métabolites par des réactions chimiques est très inefficace, en raison de la difficulté d'obtenir des regioisomers purs et des enantiomères, de faibles rendements, et la purification étendue (et coûteuse). Ici, nous présentons une synthèse enzymatique efficace de 19(S), 20(R)- et 16(S), 17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDP) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus mégaterium (qui s'exprime facilement dans Escherichia coli). La caractérisation et la détermination de la pureté sont effectuées avec la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse (MS). Cette procédure illustre les avantages de la synthèse enzymatique des métabolites époxy PUFA, et s'applique à l'époxidation d'autres acides gras, y compris l'acide arachidonique (AA) et l'acide eicosapentaenoic (EPA) pour produire l'époxyeicosatrienoic analogue acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), respectivement.

Le chromatogramme de colonne flash (exécuté à l'aide d'un système automatisé de purification flash tel que décrit ci-dessous) obtenu lors de la purification du mélange brut de l'époxidation enzymatique est montré dans la figure 1. Après l'estérification et la séparation des regioisomers, des esters purs 16(S), 17(R)-EDP et 19(S), 20(R)-EDP esters méthylaux ont été obtenus. Typiquement, ils sont présents dans...

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Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Synthèse enzymatique des métabolites époxidisés de Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, et Arachidonic Acids

Nous présentons une méthode utile pour la synthèse et la purification enzymatiques à grande échelle des enantiomers et des regioisomers spécifiques des époxydes de l'acide arachidonique (AA), de l'acide docosahexaénoïque (DHA), et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) avec l'utilisation d'un cytochrome bactérien P450 enzyme (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Ainsi, notre protocole nous permet de préparer des acides gras époxy enantiopure, et cette méthode pourrait aider à faire avancer la recherche sur les mécanismes par lesquels ces métabolites agissent dans le corps. Historiquement, les acides gras époxy purs sont très difficiles à obtenir. Donc, notre protocole est simple, rapide, rentable, et il nous permet de préparer des quantités importantes de ces métabolites.Oui, nous avons développé un protocole pour le DHA, mais il fonctionne aussi très bien pour l’EPA et l’acide arachidonique. Travaillez rapidement, car certains des reagents sont sensibles à l’air, en particulier DHA et NADPH, et assurez-vous de tout jumeler à l’avance afin que la configuration soit simple. En outre, soyez conscient des dangers.Notre protocole utilise des techniques en enzymologie et en chimie organique. La visualisation est essentielle pour aider les lecteurs et les téléspectateurs qui ne sont pas familiers avec les techniques spécialisées dans ces domaines. Pour inoculer, utilisez une boucle stérile ou une pipette trempée dans du stock de glycérol de PBS-BM3 transfecté DH5-alpha E.coli en cinq millilitres de bouillon stérile LB complété par 0,5 milligramme d’ampicilline.Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 tours. Ensuite, ajoutez la culture de démarrage de cinq millilitres et 100 milligrammes d’ampicilline à un litre de bouillon LB stérile dans un flacon Erlenmeyer. Agiter à 37 degrés Celsius pendant six heures à 200 rpm, puis à 30 degrés Celsius pendant 18 heures à 200 rpm.Après cela, recueillir la culture cellulaire dans des tubes de centrifugeuse, et centrifuger la culture cellulaire à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1000 fois g. Verser le surnatant dans un autre flacon. Décontaminer avec de l’eau de Javel ou en utilisant l’autoclave, et stocker la pastille cellulaire à moins 78 degrés Celsius jusqu’à la purification enzymatique.Pour effectuer la lyse cellulaire, décongelez d’abord la pastille cellulaire sur la glace, et résuspendez dans 40 millilitres de tampon de solubilisation glacée contenant tris, PMSF, et EDTA. Sur la glace, sonifier les cellules pendant une minute avec un homogénéiseur ultrasonique, avec un réglage de puissance de sortie de 10 et le devoir de 100, suivie d’une pause d’une minute sur la glace afin de lyse les cellules. Répétez cette procédure six fois.Centrifugeuse la cellule lysate à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 11.000 fois g pour pelleter les débris cellulaires. Pour effectuer la chromatographie d’affinité, dans une pièce froide ou un réfrigérateur avec une porte coulissante, à quatre degrés Celsius, préparez d’abord une forte colonne de chromatographie d’échange d’anion en lavant la résine avec cinq volumes de colonne de tampon A de Tris de 10 millimolar au pH 7.8. Ensuite, ajoutez le supernatant des lysates cellulaires à la colonne équilibrée, et lavez la colonne avec trois volumes de colonne de tampon froid A.Then, évaluez le BM3 en lavant la colonne avec six volumes de colonne de tampon froid B de Tris de 10 millimolaires et de chlorure de sodium de 600 millimolaires.Recueillir la fraction élitente brun-rougeâtre. Si la protéine n’est pas utilisée immédiatement, mélangez-la avec un volume égal de glycérol et clignotez avec de l’azote liquide. Conservez la solution congelée à moins 78 degrés Celsius.Pour effectuer l’epoxidation du DHA, déterminez d’abord la concentration de l’enzyme BM3 décongelée, selon la méthode d’analyse spectrale de dithionite de monoxyde de carbone. Puis, dans un bécher contenant deux litres de tampon de réaction agités sur une plaque magnétique, ajouter 0,94 millimoles de DHA diluées en 18,8 millilitres de DMSO et l’enzyme BM3 diluée à 20 nanomolaires. Pendant que la solution est en remuant, commencez la réaction d’epoxidation en ajoutant 8.7 millilitres de tampon de réaction contenant 0.94 millimoles de NADPH.Remuer la réaction pendant 30 minutes tout en bouillonnant l’air dans le mélange de réaction avec un ballon rempli d’air attaché à une seringue et une aiguille scotchée à l’intérieur du bécher. Après cela, dessinez un microlitre du mélange de réaction, et mettez-le dans un spectrophotomètre NanoDrop pour mesurer l’absorption à 340 nanomètres. Utilisez l’eau comme blanc.S’il n’y a pas d’absorption restante, ce qui indique que la NADPH a été consommée, la réaction est complète. Étanchez le mélange de réaction en ajoutant lentement de l’acide oxalique uni molaire dans le sens de la goutte, jusqu’à ce que le pH de la solution atteigne environ quatre. Maintenant, extrayez la solution tampon trempée avec deux litres d’éther de déthyle anhydre et sans peroxyde.Utilisez un entonnoir séparateur pour secouer et séparer les couches, et recueillir l’éther dans un flacon Erlenmeyer. Répéter deux fois de plus et ajouter environ 50 grammes de sulfate de magnésium anhydre pour sécher l’éther. Sur un entonnoir de filtre à vide, verser l’éther séché pour filtrer le sulfate de magnésium et transférer la couche d’éther filtrée dans un flacon à fond rond de l’évaporateur rotatif.Réglez la vitesse de rotation à moyen, et commencez le vide pour concentrer le liquide pour produire des résidus bruts d’EDP. Chargez les résidus dans une cartouche de silice de 40 grammes pour effectuer une chromatographie à colonne flash à l’aide d’une machine automatisée de purification flash. Commencez à 10% d’acétate d’éthylique dans les hexanes, et rampez jusqu’à 60% d’acétate d’éthylique dans les hexanes plus de 22 minutes.Les fractions sont automatiquement collectées dans des tubes. Ensuite, combinez les fractions de chaque pic dans un flacon à fond rond, mettez l’évaporateur rotatif et commencez l’évaporation. Trois fractions sont obtenues, DHA, isomers EDP, et diepoxide.Pour estérifier les 0,151 grammes d’epoxide obtenus, dans un flacon à fond rond ou un petit flacon, ajouter deux millilitres de méthanol anhydre et trois millilitres de toluène anhydre, et ajouter une barre d’agitation. Connectez le flacon avec un ballon rempli d’argon à travers un septum en caoutchouc et une aiguille, et ajoutez 0,26 millilitres de tms-diazomethane à deux molaires à travers une seringue en remuant. Attendez 10 minutes et ajoutez 05 millilitres supplémentaires de TMS-diazomethane jusqu’à ce qu’une couleur jaune pâle apparaisse.Après 30 minutes, concentrer soigneusement le mélange à l’aide de l’évaporateur rotatif et utiliser une cartouche de colonne de gel de silice de 40 grammes sur la machine à chromatographie flash pour purifier les résidus. Elute avec une concentration isocratique de 4% d’acétate d’éthyle dans les hexanes plus de 22 minutes. Recueillir les fractions contenant le purifié 19S, 20R-EDP ester méthyle élit d’abord, suivie par 16S, 17R-EDP ester méthyle.Maintenant, évaluez les fractions par chromatographie de couche mince dans un mélange de huit à un hexane-à-éthyl-acétate. Tache avec du permanganate de potassium pour vérifier toutes les fractions mélangées contenant les deux isomères. Concentrez les fractions correspondant à chaque pic sur un évaporateur rotatif, puis pesez sur un équilibre pour déterminer la quantité d’esters EDP obtenus.S’il reste des fractions mélangées, re chromatographiez-les avec le même système de solvants qu’auparavant. Concentrez chaque fraction contenant le regioisomer individuel sur un évaporateur rotatif. Pour convertir les regioisomers méthyles EDP individuels en leurs formes acides, diluer l’ester EDP dans un petit flacon d’environ 0,7 millilitres de THF par 0,1 millimoles d’ester, ainsi que 0,175 millilitres d’eau.Refroidir le flacon à zéro degré Celsius dans un bain de glace, ajouter trois équivalents de solution hydroxyde de lithium, et remuer sur une plaque de remue-pièce sous argon pendant la nuit tout en se réchauffant à température ambiante. Le matin, étanchez la réaction en ajoutant lentement de l’acide formique, jusqu’à ce que le pH du mélange atteigne trois à quatre. Ajouter ensuite de l’eau et deux millilitres d’acétate d’éthyle pour séparer les couches.Extraire la couche d’eau avec 10 millilitres d’acétate d’éthyle trois fois, laver avec 20 millilitres de solution de saumure saturée, et ajouter plusieurs grammes de sulfate de sodium anhydre dans la solution pour sécher la couche d’acétate d’éthyle. Concentrez la solution d’acétate d’éthylique à l’aide de l’évaporateur rotatif, ajoutez 10 millilitres d’hexanes et concentrez-vous à nouveau. Répétez deux fois pour éliminer azeotropically acide formique résiduel.Purifier les résidus par chromatographie à colonne flash, en l’évasant de 10 à 30% d’acétate d’éthyle pendant 15 minutes. Concentrez les fractions désirées dans l’évaporateur rotatif et séchez-les en vacuo pour vous permettre l’acide purifié. Le chromatogramme de colonne flash obtenu lors de la purification du mélange brut de l’epoxidation enzymatique est montré ici.Trois pics majeurs ont été obtenus, s’échappant de l’ordre, d’une première, d’un DHA non réagi, deuxièmement, d’un mélange d’isomères EDP et, troisièmement, de diepoxide, qui sont des produits normaux de suroxydation. Après l’estérification et la séparation des regioisomers, les spectres de NMR de proton indiquent que des esters méthyles de haute pureté 16S, 17R-EDP et 19S, 20R-EDP méthyle ont été obtenus. Chiral HPLC a confirmé la pureté enantiomeric des formes acides des EDP.Assurez-vous de garder votre bouillon stérile pendant la manipulation et l’inoculation pour éviter la contamination. L’epoxidation peut être utilisée pour d’autres acides gras. Nous l’avons donc aussi essayé avec des acides arachidoniques et eicosapentaénoïques, et nous avons obtenu de bons rendements de ces epoxides enantiopure, donc 14, 15-EET et 17, 18-EEQ.Ainsi, un protocole qui permet aux chercheurs d’accéder aux acides gras époxy pourrait aider à la recherche sur les fonctions biologiques de ces composés, ce qui pourrait conduire à leur utilisation comme médicaments conduit. Les produits chimiques dangereux sont le PMSF, qui est dangereux par contact, et le TMS-diazomethane, qui est très toxique par contact et inhalation. Ainsi, ce dernier doit être utilisé dans un capot de fumée et avec un équipement de protection individuelle approprié.

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