Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Diese Arbeit wird von R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) und Startup-Fonds der Michigan State University finanziert. Die Autoren danken Dr. Jun Yang (University of California at Davis) und Lalitha Karchalla (Michigan State University) für die Unterstützung bei der Optimierung der enzymatischen Reaktion und Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) Unterstützung bei der HRMS-Datenerfassung.

VORSICHT: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.
1. Ausdruck des Wildtyps BM3
<ol><li>Inokulat pBS-BM3 transfizierte DH5- E. coli (eine großzügige Spende von Dr. F. Ann Walker) in 5 ml steriler LB-Brühe mit 0,5 mg Ampicillin in einem 20 ml Kulturrohr.</li>
	<li>Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 °C für 24 h bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Fügen Sie die Nachtstarterkultur (...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

Wir präsentieren hier eine operativ einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung der beiden am häufigsten vorkommenden Epoxidmetaboliten von DHA - 19,20 und 16,17-EDP. Diese Epoxidfettsäuren können in hochenantiopurer (als S,R-Isomere) Form mit Wildtyp-BM3-Enzym hergestellt werden. Im Folgenden werden mehrere kritische Punkte beschrieben, die zur Fehlerbehebung verwendet werden können, und die Erweiterung unserer Methode zur Herstellung von enantiopuren Epoxidmetaboliten von AA und EPA.
<p cla...

Da das Interesse an der Rolle, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren (insbesondere Omega-3 und Omega-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren) in der menschlichen Biologie spielen, in den letzten Jahren zugenommen hat, haben Forscher die breite Palette attraktiver Vorteile, die ihre Metaboliten ausstellen. Insbesondere Epoxid-Fettsäure-Metaboliten, die von der Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen produziert wurden, waren ein großer Schwerpunkt. Beispielsweise spielen viele PUFA-Epoxide, einschließlich Epoxyeicosatrienosäuren (EETs), Epoxydocosapentaensäuren (EDP) und Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs), eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Blutdruck und Entzündungen1,2 , 3 , 4 , 5. Interessanterweise haben die spezifischen Enantiomere und Regioisomere von AA- und EPA-Epoxiden bekanntlich unterschiedliche Auswirkungen auf die Vasokonstriktion6,7. Während die physiologischen Wirkungen der Enantiomere und Regioisomere von EETs und EEQs dokumentiert sind, ist wenig über die Wirkung der analogen Epoxidokanosäuren (EDP) aus DHA bekannt. Die weitverbreitete Verwendung von Fischöl8, das sowohl an EPA als auch an DHA reich ist, hat ebenfalls das Interesse an DEN EDP9geweckt. Die Vorteile dieser Ergänzungen werden geglaubt, um teilweise aufgrund der nachgelagerten DHA-Metaboliten (16,17-EDP und 19,20-EDP ist die am häufigsten vorkommende), weil in vivo Niveaus von EDP sehr gut mit der Menge an DHA in der Ernährung10 , 11.
Die Untersuchung der Mechanismen und Ziele dieser Epoxidfettsäuren durch Metabolomik, chemische Biologie und andere Methoden hat sich als herausforderunglich erwiesen, zum Teil, weil sie als Mischungen von Regio- und Stereo-Isomeren existieren, und eine Methode zur Gewinnung reiner Mengen der Enantiomere und Regioisomer erforderlich sind. Herkömmliche Mittel zur chemischen Synthese dieser Verbindungen haben sich als unwirksam erwiesen. Die Verwendung von Peroxysäuren wie Meta-Chloroperoxybenzoesäure für die Epoxidation hat viele Nachteile, insbesondere den Mangel an Epoxidationsselektivität, der eine teure und sorgfältige Reinigung einzelner Regioisomere und Enantiomere erfordert. Die Gesamtsynthese von DHA- und EPA-Metaboliten ist möglich, leidet aber auch unter Nachteilen, die es für großflächige Syntheseen wie hohe Kosten und niedrige Erträge12,13machen. Effiziente Gesamtproduktion kann mit enzymatischer Synthese erreicht werden, da enzymatische Reaktionen regio- und stereoselektiv sind14. Studien zeigen, dass die enzymatische Epoxidation von AA und EPA (mit BM3) sowohl regioselektiv als auch enantioselektivist 15,16,17,18, aber dieses Verfahren wurde nicht mit DHA oder an einem großen skala. Das übergeordnete Ziel unserer Methode war es, diese chemoenzymatische Epoxidation zu skalieren und zu optimieren, um schnell signifikante Mengen an reinen Epoxidfettsäuren als ihre individuellen Enantiomere zu produzieren. Mit der hier vorgestellten Methode haben Forscher Zugang zu einer einfachen und kostengünstigen Strategie für die Synthese von EDV und anderen PUFA-Epoxidmetaboliten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

Die epoxidierten Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs), die als Epoxidfettsäuren bezeichnet werden, haben eine Vielzahl von Rollen in der menschlichen Physiologie. Diese Metaboliten werden endogen durch die Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen hergestellt. Aufgrund ihrer vielfältigen und starken biologischen Wirkung besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung dieser Metaboliten. Die Bestimmung der einzigartigen Rolle dieser Metaboliten im Körper ist eine schwierige Aufgabe, da die Epoxidfettsäuren zunächst in signifikanten Mengen und mit hoher Reinheit erhalten werden müssen. Die Gewinnung von Verbindungen aus natürlichen Quellen ist oft arbeitsintensiv, und lösliche Epoxidhydrolasen (sEH) hydrolysieren die Metaboliten schnell. Andererseits ist die Erlangung dieser Metaboliten über chemische Reaktionen sehr ineffizient, da es schwierig ist, reine Regioisomere und Enantiomere, niedrige Erträge und eine umfangreiche (und teure) Reinigung zu erhalten. Hier präsentieren wir eine effiziente enzymatische Synthese von 19(S), 20(R)- und 16(S),17(R)-epoxydocosapentaennoic acids (EDPs) aus DHA via Epoxidation mit BM3, einem bakteriellen CYP450-Enzym, das ursprünglich aus Bacillus isoliert wurde Megaterium (das leicht in Escherichia coliausgedrückt wird). Die Charakterisierung und Bestimmung der Reinheit erfolgt mit DerKernspinresonanzspektroskopie (NMR), der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Massenspektrometrie (MS). Dieses Verfahren veranschaulicht die Vorteile der enzymatischen Synthese von PUFA-Epoxid-Metaboliten und ist auf die Epoxidation anderer Fettsäuren anwendbar, einschließlich Arachidonsäure (AA) und Eicosapentaensäure (EPA), um die analoge epoxyeicosatrienoische Säuren (EETs) bzw. Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs).

Das Blitzsäulenchromatogramm (durchgeführt mit einem automatisierten Blitzreinigungssystem, wie unten beschrieben), das bei der Reinigung des Rohgemischs aus enzymatischer Epoxidation erhalten wurde, ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Veresterung und Trennung der Regioisomerewurden reine 16( S), 17(R)-EDP und 19(S),20(R)-EDP Methylester erhalten. In der Regel sind sie in einem ungefähren Verhältnis von 1:4bis ...

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Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren

Wir präsentieren eine Methode, die für die großflächige enzymatische Synthese und Reinigung spezifischer Enantiomere und Regioisomere von Epoxiden von Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) unter Verwendung eines bakteriellen Cytochroms nützlich ist. P450-Enzym (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

So ermöglicht unser Protokoll uns, enantiopure Epoxid-Fettsäuren vorzubereiten, und diese Methode könnte helfen, die Forschung über die Mechanismen, mit denen diese Metaboliten im Körper wirken, voranzutreiben. Historisch gesehen sind reine Epoxidfettsäuren sehr schwer zu erhalten. Unser Protokoll ist also einfach, schnell und kostengünstig und ermöglicht es uns, erhebliche Mengen dieser Metaboliten vorzubereiten.Ja, wir haben ein Protokoll für DHA entwickelt, aber es funktioniert auch sehr gut für EPA und Arachidonsäure. Arbeiten Sie schnell, da einige der Reagenzien luftempfindlich sind, speziell DHA und NADPH, und achten Sie darauf, alles im Voraus zu koppeln, so dass die Einrichtung einfach ist. Seien Sie sich auch der Gefahren bewusst.Unser Protokoll verwendet Techniken sowohl in der Enzymologie als auch in der organischen Chemie. Die Visualisierung ist wichtig, um Lesern und Betrachtern zu helfen, die mit den spezialisierten Techniken in diesen Bereichen nicht vertraut sind. Um zu impfen, verwenden Sie eine sterile Schleife oder Pipette in Glycerin-Bestand von pBS-BM3 transfiziert DH5-alpha E.coli in fünf Milliliter sterile LB-Brühe mit 0,5 Milligramm Ampicillin ergänzt.Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 Grad Celsius 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute bebrüten. Dann fügen Sie die Fünf-Milliliter-Starterkultur und 100 Milligramm Ampicillin zu einem Liter steriler LB-Brühe in einem Erlenmeyerkolben hinzu. Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden bei 200 Rpm, dann bei 30 Grad Celsius für 18 Stunden bei 200 Rpm.Danach die Zellkultur in Zentrifugenröhren sammeln und die Zellkultur bei vier Grad Celsius 10 Minuten bei 1000 mal g zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand in einen anderen Kolben. Dekontaminieren Sie mit Bleichmittel oder mit dem Autoklaven, und speichern Sie das Zellpellet bei minus 78 Grad Celsius bis zur Enzymreinigung.Um die Zelllyse durchzuführen, tauen Sie zuerst das Zellpellet auf Eis auf und setzen Sie in 40 Millilitere eiskalte Löslichkeitspuffer mit Tris, PMSF und EDTA wieder auf. Während sie auf dem Eis sind, beschallen Sie die Zellen für eine Minute mit einem Ultraschall-Homogenisator, mit einer Ausgangsleistungseinstellung von 10 und einer Leistung von 100, gefolgt von einer einminütigen Pause auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal.Zentrifuge die Zelle lysiert bei vier Grad Celsius für 30 Minuten bei 11.000 mal g, um den Zellabfall zu pellet. Um die Affinitätschromatographie in einem Kühlraum oder Kühlschrank mit Schiebetür bei vier Grad Celsius durchzuführen, bereiten Sie zunächst eine starke Anionenaustauschchromatographiesäule vor, indem Sie das Harz mit fünf Säulenvolumen des Puffers A von 10-Millimolar Tris bei pH 7,8 waschen. Als nächstes fügen Sie den Überstand der Zelllysate in die ausgeglichene Spalte ein und waschen Sie die Säule mit drei Spaltenvolumina des Kaltpuffers A. Dann, elute die BM3 durch Waschen der Spalte mit sechs Spaltenvolumen kaltpuffer B von 10-Millimolar Tris und 600-Millimolar Natriumchlorid.Sammeln Sie die rötlich-braune Eluentenfraktion. Wenn das Protein nicht sofort verwendet wird, mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von Glycerin, und Flash-Freeze mit flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die gefrorene Lösung bei minus 78 Grad Celsius auf.Um die Epoxidation von DHA durchzuführen, bestimmen Sie zunächst die Konzentration des aufgetauten BM3-Enzyms gemäß der Carbonmonoxid-Dithionit-Spektral-Assay-Methode. Dann, in einem Becher, der zwei Liter Reaktionspuffer enthält, der auf einer magnetischen Rührplatte gerührt wird, fügen Sie 0,94 Millimol DHA in 18,8 Milliliter DMSO verdünnt und das BM3-Enzym auf 20 Nanomolar verdünnt. Während die Lösung rührt, beginnen Sie die Epoxidationsreaktion, indem Sie 8,7 Milliliter Reaktionspuffer hinzufügen, der 0,94 Millimole NADPH enthält.Rühren Sie die Reaktion für 30 Minuten, während Luft in die Reaktionsmischung mit einem luftgefüllten Ballon an einer Spritze befestigt und Nadel an der Innenseite des Bechers geklebt. Danach einen Mikroliter des Reaktionsgemisches aufstellen und in ein NanoDrop Spektralphotometer geben, um die Absorption bei 340 Nanometern zu messen. Verwenden Sie Wasser als Rohling.Wenn keine Restabsorption vorhanden ist, was darauf hinweist, dass NADPH verbraucht wurde, ist die Reaktion vollständig. Das Reaktionsgemisch durch langsames Hinzufügen von einmollaren Oxalsäure tropfenweise ablöschen, bis der pH-Wert der Lösung etwa vier erreicht. Extrahieren Sie nun die abgeschreckte Pufferlösung mit zwei Litern wasserfreiem, peroxidfreiem Diethylether.Verwenden Sie einen Trenntrichter, um die Schichten zu schütteln und zu trennen, und sammeln Sie den Äther in einem Erlenmeyerkolben. Wiederholen Sie zwei weitere Male, und fügen Sie etwa 50 Gramm wasserfreies Magnesiumsulfat hinzu, um den Äther zu trocknen. Auf einem Vakuumfiltertrichter den getrockneten Äther gießen, um das Magnesiumsulfat zu filtern, und die gefilterte Ätherschicht in einen rund-Boden-Kolben des Rotationsverdampfers geben.Stellen Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf Medium ein, und starten Sie das Vakuum, um die Flüssigkeit zu konzentrieren, um rohe EDP-Rückstände zu erzielen. Laden Sie den Rückstand in eine 40-Gramm-Kieselsäurepatrone, um die Flash-Säulenchromatographie mit einer automatischen Blitzreinigungsmaschine durchzuführen. Beginnen Sie bei 10%ethylacetat in Hexanen und hochfahren bis zu 60%ethylacetat in Hexanen über 22 Minuten.Die Fraktionen werden automatisch in Rohren gesammelt. Kombinieren Sie dann die Fraktionen von jedem Gipfel zu einem rund-Boden-Kolben, setzen Sie den Rotationsverdampfer auf und starten Sie die Verdunstung. Es werden drei Fraktionen erhalten, DHA, EDP-Isomere und Diepoxid.Um die erhaltenen 0,151 Gramm Epoxid in einem rund-Boden-Kolben oder einer kleinen Durchstechflasche zu verestern, fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies Methanol und drei Milliliter wasserfreies Toluol hinzu, und fügen Sie einen Rührbalken hinzu. Verbinden Sie den Kolben mit einem mit Argon gefüllten Ballon durch ein Gummiseptum und eine Nadel, und fügen Sie 0,26 Milliliter zweimollaren TMS-Diazomememe durch eine Spritze unter Rühren hinzu. Warten Sie 10 Minuten, und fügen Sie weitere 05 Milliliter TMS-Diazomethan hinzu, bis eine blassgelbe Farbe erscheint.Nach 30 Minuten die Mischung sorgfältig mit dem Rotationsverdampfer konzentrieren und eine 40-Gramm-Kieselgel-Säulenpatrone auf der Blitzchromatographie-Maschine verwenden, um den Rückstand zu reinigen. Elute mit einer isokratischen Konzentration von 4%Ethylacetat in Hexanen über 22 Minuten. Sammeln Sie zuerst die Fraktionen, die die gereinigten 19S, 20R-EDP Methylestereluate enthalten, gefolgt von 16S, 17R-EDP Methylester.Bewerten Sie nun die Fraktionen durch dünnschichtige Chromatographie in einem Hexan-Ethylacetat-Gemisch von acht zu eins. Stain mit Kaliumpermanganat, um nach gemischten Fraktionen zu suchen, die beide Isomere enthalten. Konzentrieren Sie die Fraktionen, die jedem Peak entsprechen, auf einen Rotationsverdampfer und wiegen Sie dann auf einem Gleichgewicht, um die Menge der erhaltenen EDP-Ester zu bestimmen.Wenn gemischte Fraktionen übrig bleiben, rechromatographieren Sie sie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie bisher verwendet. Konzentrieren Sie jede Fraktion, die das einzelne Regioisomer enthält, auf einen Rotationsverdampfer. Um einzelne EDV-Methylester-Regioisomen in ihre Säureformen umzuwandeln, verdünnen Sie den EDV-Ester in einer kleinen Durchstechflasche mit etwa 0,7 Milliliter THF pro 0,1 Millimol Ester, zusammen mit 0,175 Milliliter Wasser.Kühlen Sie die Durchstechflasche in einem Eisbad auf null Grad Celsius, fügen Sie drei Äquivalente von Lithiumhydroxid-Lösung hinzu und rühren Sie auf einer Rührplatte unter Argon über Nacht, während sie sich auf Raumtemperatur erwärmt. Am Morgen die Reaktion durch langsames Hinzufügen von Ameisensäure abschrecken, bis der pH-Wert der Mischung drei bis vier erreicht. Dann wasser und zwei Milliliter Ethylacetat hinzufügen, um die Schichten zu trennen.Die Wasserschicht dreimal mit 10 MilliliterEthylacetat abziehen, mit 20 Millilitern gesättigter Solelösung waschen und mehrere Gramm wasserfreies Natriumsulfat in die Lösung zum Trocknen der Ethylacetatschicht geben. Konzentrieren Sie die Ethylacetatlösung mit dem Rotationsverdampfer, fügen Sie 10 Milliliter Hexane hinzu und konzentrieren Sie sich erneut. Zweimal wiederholen, um azeotropisch Restameisensäure zu entfernen.Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie, Elumitieren mit 10 bis 30%Ethylacetat über 15 Minuten. Konzentrieren Sie die gewünschten Fraktionen im Rotationsverdampfer und trocknen Sie im Vakuum, um sich die gereinigte Säure zu leisten. Das Beikochromatogramm der Blitzsäule, das bei der Reinigung des Rohgemisches aus enzymatischer Epoxidation gewonnen wird, wird hier gezeigt.Es wurden drei haupthebespitzen erreicht, die in der Reihenfolge der erstens unreagierten DHA, der zweiten Mischung von EDV-Isomen und drittens Derpoxid, die normale Überoxidationsprodukte sind, elutierend. Nach veresterter und abgetrennter Regioisomer deuten die Proton-NMR-Spektren darauf hin, dass hochreine 16S, 17R-EDP und 19S, 20R-EDP-Methylester erhalten wurden. Chiral HPLC bestätigte enantiomere Reinheit der sauren Formen der EDP.Achten Sie darauf, Ihre Brühe während der Handhabung und Impfung steril zu halten, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Epoxidation kann für andere Fettsäuren verwendet werden. Also probierten wir es auch mit arachiiden und eicosapentaennoic Säuren, und wir erhielten gute Erträge dieser enantiopure Epoxide, so 14, 15-EET und 17, 18-EEQ.So könnte ein Protokoll, das Forschern den Zugang zu Epoxid-Fettsäuren ermöglicht, bei der Erforschung der biologischen Funktionen dieser Verbindungen helfen, was zu ihrer Verwendung als Arzneimittel-Leads führen könnte. Die gefährlichen Chemikalien sind PMSF, das durch Kontakt gefährlich ist, und TMS-Diazomeme, das durch Kontakt und Einatmen sehr giftig ist. Letzteres sollte also in einer Dunstabzugshaube und mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung verwendet werden.

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Chemistry

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