Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי R00 ES024806 (המכון הלאומי לבריאות), DMS-1761320 (הקרן הלאומית למדע) וכספי הפעלה מאוניברסיטת מישיגן סטייט. המחברים מבקשים להודות לד ר ג'ון יאנג (אוניברסיטת קליפורניה בדיוויס) ולליתה קראלה (אונ' מישיגן) לסיוע במיטוב התגובה האנזימטית, וד ר טוני שילמילר (MSU טבולומיקס מאסה ספקטרומטר מתקן ומיתקן) לקבלת סיוע ברכישת נתונים HRMS.

התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים המפורטים.
1. ביטוי מסוג פראי BM3
<ol><li>איחסן pBS-BM3 מDH5α E. coli (תרומה נדיבה של ד ר פ. אן ווקר) ב 5 מ ל של מרק LB סטרילי עם 0.5 מ"ג של אמפיצילין נוסף לתוך שפופרת תרבות 20 מ ל.</li>
	<li>מודטה את תרבו?...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

אנו מציגים כאן שיטה פשוטה וחסכונית עבור הכנת שני מטבוליטים אפוקסי השפע ביותר של DHA-19, 20 ו 16, 17-EDP. חומצות שומן אפוקסי אלה ניתן להכין ב enantiopure מאוד (כמו S שלהם , R-איזוers) טופס באמצעות האנזים BM3 סוג פראי. כמה נקודות קריטיות שניתן להשתמש בהם לפתרון בעיות, ואת השלוחה של השיטה שלנו להכנת אפוקסי אנ?...

כעניין התפקיד כי חומצות שומן רב בלתי רווי (במיוחד אומגה 3 ו אומגה 6 חומצות שומן רב בלתי רווי) לשחק בביולוגיה אנושית גדל בשנים האחרונות, החוקרים הבחינו של מגוון רחב של הטבות מושך כי מטבוליטים שלהם תערוכה. במיוחד, שומן אפוקסי חומצת מטבוליטים המיוצר על ידי מחלקה P450 ציטוכרום של אנזימים היו נקודת גדול של מיקוד. לדוגמה, באפופא רבים, כולל חומצות שונות (eets), חומצות שמנת (edps) וחומצות אפוקסי (eeqs), משחקים תפקיד קריטי בוויסות לחץ הדם ודלקת1,2 ....... , מיכל שלוש , ד , 5. מעניין, enantiomers ספציפיים ו regioisomers של AA ו-EPA ואפוקסידס ידועים יש השפעות שונות על הצומת6,7. בעוד ההשפעות הפיזיולוגיות של enantiomers ו regioisomers של EETs ו-EEQs תועדו, מעט ידוע על ההשפעה של חומצות האפוקסי מקבילה ביותר (EDPs) נוצר מ DHA. שימוש נרחב של שמן דגים8, אשר עשיר הן EPA ו-DHA, גם עוררה עניין ב-edps9. היתרונות של תוספי מזון אלה הם האמינו בחלקו בשל הזרם מטבוליטים DHA (16, 17-EDP ו 19, 20-EDP להיות הנפוץ ביותר) כי ברמות vivo של הקואורדינטות Edp טוב מאוד עם כמות של DHA בדיאטה10, . בסדר, 11
לימוד המנגנונים והיעדים של חומצות שומן אפוקסי אלה על ידי טבולומיקס, ביולוגיה כימית, ושיטות אחרות הוכיחו מאתגרת, בין השאר כי הם קיימים כתערובות של regio-ו-מערכת סטריאו, ושיטה להשיג כמויות טהורות של המלון מחויב ליחידים ולמבודדים. אמצעים קונבנציונליים לסינתזה תרכובות אלה הוכחו ללא יעילים. שימוש בחומצות הפראוקסיטציה כמו חומצה מטה-כלורמטומית לאפוקסי בעלי חסרונות רבים, ובראשם העדר סלקטיביות, הדורשת טיהור יקר ומדקדק של המוני ואנאנטינים בודדים. סינתזה הכולל של DHA ו-EPA מטבוליטים אפשרי, אבל גם סובל מחסרונות שעושים את זה מעשי סינתזה בקנה מידה גדול כגון עלויות גבוהות תשואה נמוכה12,13. הייצור הכולל יעיל ניתן להשיג עם סינתזה אנזימטית, כמו תגובות אנזימטיות הם regio-ו סטריאוסלקטיבית14. מחקרים מראים כי מגוון אנזימטית של AA ו-EPA (עם BM3) הוא שניהם regioselective ו enantioselective15,16,17,18, אבל הליך זה לא נבדק עם DHA, או על גדול ידה. המטרה הכללית של השיטה שלנו היתה לשנות את היקף ולייעל את האפוקסי כימוזציה זו כדי לייצר במהירות כמויות משמעותיות של חומצות שומן באפוקסי טהור כמו enantiomers הפרט שלהם. באמצעות השיטה המוצגת כאן, החוקרים יש גישה אסטרטגיה פשוטה וחסכונית לסינתזה של EDPs ו-PUFA אחרים אפוקסי מטבוליטים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

האפוקסי מטבוליטים של חומצות שומן רב בלתי רוויות שונות (PUFAs), הנקראת חומצות שומן אפוקסי, יש מגוון רחב של תפקידים בפיזיולוגיה של האדם. אלה מטבוליטים מיוצרים באופן שורש על ידי מחלקת P450 ציטוכרום של אנזימים. בגלל השפעות ביולוגיות מגוונות וחזקות שלהם, יש עניין רב בלמידה אלה מטבוליטים. קביעת התפקידים הייחודיים של מטבוליטים אלה בגוף היא משימה קשה, כמו חומצות שומן אפוקסי יש לקבל תחילה בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוהה. קבלת תרכובות ממקורות טבעיים היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, ו לייף hydrolases מסיסים הידרו במהירות את מטבוליטים. מצד שני, קבלת אלה מטבוליטים באמצעות תגובות כימיות הוא מאוד לא יעיל, בשל הקושי של קבלת regisomers טהור, enantiomers, תשואות נמוכות, ונרחב (ויקר) טיהור. כאן, אנו מציגים סינתזה אנזימטית יעיל של 19 (s), 20 (r)-ו-16 (s), 17 (r)-האפוקסי חומצות (edps) מ-DHA באמצעות אפוקסי עם BM3, אנזים CYP450 חיידקי מבודד במקור ממלוס מקרתגו megaterium (המתבטא בקלות באסאנכיה קולי). אפיון וקביעת טוהר מתבצעים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וספקטרומטר מסה (MS). הליך זה ממחיש את היתרונות של סינתזה אנזימטית של PUFA אפוקסי מטבוליטים, והוא חל על האפוקסי של חומצות שומן אחרות, כולל חומצה ארכידונית (AA) וחומצה eאיסאופנטקאנומית (EPA) כדי לייצר את האפוקסי האנלוגי חומצות (EETs) ומוצרי אפוקסי (EEQs), בהתאמה.

כרומאטוגרמה הבזק (מבוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית כפי שמתואר להלן) שהושג על ידי טיהור התערובת הגולמי מתוך מראה של אפוקסי אנזימטי מוצג באיור 1. לאחר הפרדת המוני והפרדה של האריאוינים הטהורים 16 (s), 17 (r)-Edp ו -19 (s), 20 (r)-אסטרים של מתיל edp ...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

אנו מציגים שיטה מועילה לסינתזה אנזימטית וטיהור של אנאנטימרים ספציפיים ובעלי מגוון רחב של חומצה ארכידונית (AA), חומצה docosahexaenoic (DHA), וחומצה eicosapentaenoic (EPA) עם שימוש של ציטוכרום בקטריאלי אנזים P450 (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

אז הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו להכין חומצות שומן אפוקסי enantiopure, שיטה זו עשויה לעזור לקדם מחקר על המנגנונים שבהם מטבוליטים אלה פועלים בגוף. מבחינה היסטורית, חומצות שומן אפוקסי טהור קשה מאוד להשיג. אז הפרוטוקול שלנו הוא פשוט, מהיר, חסכוני, וזה מאפשר לנו להכין כמויות משמעותיות של מטבוליטים אלה.כן, פיתחנו פרוטוקול עבור DHA, אבל זה גם עובד טוב מאוד עבור המשרד לאיכות הסביבה וחומצה רחידונית. עבוד במהירות, מכיוון שחלק מהרהגנטים רגישים לאוויר, במיוחד DHA ו- NADPH, ו הקפד לשייך הכל מראש כך שההגדרה תהיה פשוטה. כמו כן, להיות מודעים לסכנות.הפרוטוקול שלנו משתמש בטכניקות הן באנזימולוגיה והן בכימיה אורגנית. הדמיה היא קריטית כדי לסייע לקוראים וצופים שאינם מכירים את הטכניקות המיוחדות בתחומים אלה. כדי לחסן, להשתמש בלולאה סטרילית או פיפטה טבול במלאי גליצרול של pBS-BM3 הפך DH5-אלפא E.coli לתוך חמישה מיליליטר של מרק LB סטרילי בתוספת 0.5 מיליגרם של אמפיצילין.הדגירה את תרבות התא בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ב 200 סל"ד. לאחר מכן, מוסיפים את תרבות המתנע של חמישה מיליליטר ו -100 מיליגרם של אמפיצילין לליטר אחד של מרק LB סטרילי בבקבוק ארלנפייר. לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות ב 200 סל"ד, ולאחר מכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות ב 200 סל"ד.לאחר מכן, לאסוף את תרבות התא לתוך צינורות צנטריפוגה, צנטריפוגה את תרבות התא בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 1, 000 פעמים g. יוצקים את העל-טבעי לתוך בקבוקון אחר. לטהר עם אקונומיקה או באמצעות autoclave, ולאחסן את גלולת התא במינוס 78 מעלות צלזיוס עד טיהור אנזים.כדי לבצע תזה תא, תחילה להפשיר את גלולת התא על קרח, ולתלות מחדש 40 מיליליטר של חיץ מסיסות קר כקרח המכיל טריס, PMSF, ו EDTA. בעוד על קרח, sonicate התאים במשך דקה אחת עם homogenizer קולי, עם הגדרת כוח פלט של 10 וחובת 100, ואחריו הפסקה של דקה אחת על הקרח על מנת ללטף את התאים. חזור על הליך זה שש פעמים.צנטריפוגה התא lysate בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 11, 000 פעמים g כדי גלולה פסולת התא. כדי לבצע כרומטוגרפיה של זיקה, בחדר קר או במקרר עם דלת הזזה, בארבע מעלות צלזיוס, הכינו תחילה עמוד כרומטוגרפיה חזק של חילופי אניון על ידי שטיפת השרף עם חמישה כרכים של חיץ A של טריס 10 מילימולר ב- pH 7.8. לאחר מכן, הוסף את העל-טבעי של lysates התא לעמודה שיווי משקל, ולשטוף את העמודה עם שלושה כרכים עמודה של מאגר קר A.Then, להשתיק את BM3 על ידי שטיפת העמודה עם שישה כרכים עמודה של מאגר קר B של טריס 10-מילימולר ו 600 מילימולר נתרן כלוריד.לאסוף את שבר אלונט אדמדם-חום. אם החלבון אינו בשימוש מיידי, מערבבים אותו עם נפח שווה של גליצרול, והבזק להקפיא עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא במינוס 78 מעלות צלזיוס.כדי לבצע אפוקסידציה של DHA, תחילה לקבוע את הריכוז של אנזים BM3 מופשר, על פי שיטת בדיקה ספקטרלית חד תחמוצת הפחמן dithionite. לאחר מכן, ב beaker המכיל שני ליטרים של חיץ תגובה להיות מעורבב על צלחת ערבוב מגנטי, להוסיף 0.94 מילימולים של DHA מדולל 18.8 מיליליטר של DMSO ואת האנזים BM3 מדולל 20 nanomolar. בעוד הפתרון הוא ערבוב, להתחיל את תגובת אפוקסידציה על ידי הוספת 8.7 מיליליטר של חיץ התגובה המכיל 0.94 מילימולים של NADPH.מערבבים את התגובה במשך 30 דקות תוך מבעבע אוויר לתוך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מחובר מזרק ומחט מודבק לתוך הקנומה. לאחר מכן, לצייר מיקרוליטר אחד של תערובת התגובה, ולשים אותו לתוך ספקטרופוטומטר NanoDrop כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר. השתמש במים כריק.אם אין ספיגה שנותרה, מה שמצביע על NADPH כבר נצרך, התגובה הושלמה. מרווה את תערובת התגובה על ידי הוספה איטית של חומצה אוקסלית טוחנית אחת dropwise, עד pH של הפתרון מגיע כארבעה. עכשיו, לחלץ את פתרון חיץ מרווה עם שני ליטרים של אתר דיתיל נטול חמצן נטול חמצן.השתמש משפך הפרדה לנער ולהפריד את השכבות, ולאסוף את האתר לתוך בקבוק Erlenmeyer. חוזרים על הפעולה פעמיים נוספות ומוסיפים כ-50 גרם מגנזיום גופרתי נטול מים לייבוש האתר. על משפך מסנן ואקום, יוצקים את האתר המיובש כדי לסנן את המגנזיום גופרתי, ומעבירים את שכבת האתר המסוננת לבקבוק תחתון עגול של האידוי הסיבובי.כוונן את מהירות הסיבוב לבינונית, והתחל את הוואקום כדי לרכז את הנוזל להניב שאריות EDP גולמיות. טען את השאריות במחסנית סיליקה של 40 גרם כדי לבצע כרומטוגרפיה של עמודת הבזק באמצעות מכונת טיהור פלאש אוטומטית. התחל ב- 10%ethyl אצטט בהקסאן והגדל עד 60% אתיל אצטט בהקסאן במשך 22 דקות.השברים נאספים באופן אוטומטי בצינורות. לאחר מכן, לשלב את השברים מכל שיא לתוך בקבוקון עגול למטה, לשים על אידוי סיבובי, ולהתחיל את האידוי. שלושה שברים מתקבלים, DHA, אייסומרים EDP, ו diepoxide.כדי להבליט את 0.151 גרם של אפוקסיד, בבקבוקון עגול למטה או בקבוקון קטן, להוסיף שני מיליליטר של מתנול נטול מים ושלושה מיליליטר של טולואן נטול מים, ולהוסיף בר ערבוב. חבר את הבקבוק עם בלון מלא ארגון דרך מחיצת גומי ומחט, ולהוסיף 0.26 מיליליטר של שני טוחנת TMS-diazomethane דרך מזרק תוך ערבוב. המתן 10 דקות והוסף 05 מיליליטר נוספים של TMS-diazomethane עד שיופיע צבע צהוב חיוור.לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות אידוי סיבובי, ולהשתמש 40 גרם ג'ל סיליקה עמוד מחסנית על מכונת כרומטוגרפיה פלאש כדי לטהר את השאריות. אלוט עם ריכוז isocratic של 4% אתיל אצטט בהקסאן מעל 22 דקות. לאסוף את השברים המכילים את מטוהרים 19S, 20R-EDP מתיל אסתר מרומם הראשון, ואחריו 16S, 17R-EDP מתיל אסתר.עכשיו, להעריך את השברים על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה בתערובת הקסאן-לאתיל-אצטט שמונה לאחד. כתם עם אשלגן פרמנganate כדי לבדוק אם יש שברים מעורבים המכילים את שני האיזומרים. לרכז את השברים המתאימים לכל שיא על אידוי סיבובי, ולאחר מכן לשקול איזון כדי לקבוע את כמות ESTERS EDP שהושגו.אם נשארים שברים מעורבים, יש להפוך אותם מחדש לאותה מערכת ממסים כפי שהיה בשימוש בעבר. לרכז כל שבר המכיל את regioisomer בודדים על אידוי סיבובי. כדי להמיר regioisomers מתיל אסתר EDP בודדים לצורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP בבקבוקון קטן עם כ 0.7 מיליליטר של THF לכל 0.1 מילימולים של אסתר, יחד עם 0.175 מיליליטר של מים.מקררים את הבקבוקון לאפס מעלות צלזיוס באמבט קרח, מוסיפים שלוש שוות ערך לתסכול ליתיום הידרוקסידי, ומערבבים על צלחת ערבוב מתחת לארגון במהלך הלילה תוך התחממות לטמפרטורת החדר. בבוקר, מרווה את התגובה על ידי הוספה איטית של חומצה פורמית, עד שה- pH של התערובת מגיע לשלוש עד ארבע. לאחר מכן, מוסיפים מים ושני מיליליטר של אתיל אצטט כדי להפריד את השכבות.מוציאים את שכבת המים עם 10 מיליליטר של אתיל אצטט שלוש פעמים, לשטוף עם 20 מיליליטר של תווי מלח רוויים, ולהוסיף כמה גרם של נתרן גופרתי נטול מים בתסומה לייבוש שכבת האתיל אצטט. לרכז את פתרון האתיל אצטט באמצעות אידוי סיבובי, להוסיף 10 מיליליטר של הקסנים, ולהתרכז שוב. חזור פעמיים כדי להסיר azeotropically חומצה פורמית שיורית.לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה של עמודת פלאש, eluting עם 10 עד 30% אתיל אצטט על פני 15 דקות. לרכז את השברים הרצויים מאייד סיבובי, ויבש vacuo כדי להרשות לעצמם את החומצה המטוהרת. הכרומטוגרמה של עמודת הפלאש המתקבלת עם טיהור התערובת הגולמית מאפסידציה אנזימטית מוצגת כאן.שלוש פסגות עיקריות הושגו, eluting בסדר של, הראשון, DHA unreacted, השני, תערובת של איזומרים EDP, ושלישית, diepoxide, שהם מוצרי חמצון יתר נורמלי. לאחר אסתריות והפרדה של regioisomers, ספקטרום NMR פרוטון עולה כי טוהר גבוה 16S, 17R-EDP ו 19S, אסטרים מתיל 20R-EDP הושגו. כיראל HPLC אישר טוהר אננטיומרי של צורות החומצה של EDPs.הקפד לשמור על המרק שלך סטרילי תוך כדי טיפול וחינוך כדי למנוע זיהום. אפוקסידציה יכול לשמש חומצות שומן אחרות. אז ניסינו את זה גם עם חומצות ארכואידיות ואיקוספנטאנואיות, והשגנו תשואות טובות של אפוקסידים enantiopure אלה, כך 14, 15-EET ו 17, 18-EEQ.אז פרוטוקול המאפשר לחוקרים לגשת חומצות שומן אפוקסי עשוי לסייע במחקר על הפונקציות הביולוגיות של תרכובות אלה, אשר יכול להוביל את השימוש בהם כמוביל סמים. הכימיקלים המסוכנים הם PMSF, אשר מסוכן על ידי מגע, ו TMS-diazomethane, אשר רעיל מאוד על ידי מגע שאיפה. אז האחרון צריך לשמש ברדס אדים עם ציוד מגן אישי נאות.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

זיהוי איכותי של חומצות קרבוקסיליות, חומצות boronic, ואמיני שימוש fluorophores הצלב

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

כימית סינתזת תגובה של nanosize מונוסודיום Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

סינתזה הידרוקינון המבוססת של Nanorods הזהב

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...