Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

この研究は、R00 ES024806(国立衛生研究所)、DMS-1761320(国立科学財団)、ミシガン州立大学からのスタートアップファンドによって資金提供されています。著者らは、ジャンジー反応の最適化を支援するジャン・ヤン博士(カリフォルニア大学デイビス校)とラリタ・カルチャラ博士(ミシガン州立大学)とトニー・シルミラー博士(MSU質量分析・メタボロミクス施設)に感謝したいと考えています。HRMSデータ取得の支援のために。

注意:記載されている化学物質を使用する前に、関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。
1. 野生型BM3の発現
<ol><li>pBS-BM3を接種したDH5α大腸菌(F.アン・ウォーカー博士からの寛大な寄付)を20mL培養管に0.5mgのアンピシリンを加えた無菌LBブロスの5mLに入れた。</li>
	<li>200 rpmで24時間37°Cでシェーカーで細胞培養をインキュベートする。フェル?...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

ここでは、DHAの2つの最も豊富なエポキシ代謝産物を調製するための運用上のシンプルで費用対効果の高い方法を提示します - 19,20および16,17-EDP。これらのエポキシ脂肪酸は、野生型BM3酵素を用いて高エナンチオプル(S,R-isomersとして)形態で調製することができる。トラブルシューティングに使用できるいくつかの重要なポイントと、AAおよびEPAのエナンチオピュアエポキシ代謝物を調製?...

多価不飽和脂肪酸(特にオメガ3およびオメガ-6多価不飽和脂肪酸)がヒト生物学で果たす役割への関心が近年高まっており、研究者は代謝産物が魅力的な利点の広い範囲に注目しています。展示。特に、シトクロムP450クラスの酵素によって産生されるエポキシ脂肪酸代謝産物が大きな注目点となっている。例えば、エポキシエイコサトリエノール酸(EAT)、エポキシコサペンタエイン酸(EDP)およびエポキシエイコサテトレーヌ酸(EQ)を含む多くのPUFAエポキシドは、血圧および炎症の調節において重要な役割を果たす1、2,3,4,5.興味深いことに、AAおよびEPAエポキシドの特定のエナンチオマーおよびレジオソーマーは、血管収縮6、7に対して様々な効果を持つことが知られている。ETおよびEQのエナンチオマーおよびレジオダイマーの生理的効果は文書化されているが、DHAから形成された類似性エポキシドコサペンタエン酸(EDP)の効果についてはほとんど知られていない。EPAとDHAの両方に富む魚油8の広範な使用はまた、EDP9への関心をかき立てている。これらのサプリメントの利点は、EDPの生体内レベルが食事10のDHAの量と非常によく調整するので、下流のDHA代謝物(16,17-EDPと19,20-EDPが最も豊富である)に部分的に起因すると考えられています,11.
メタボロミクス、化学生物学、およびその他の方法によってこれらのエポキシ脂肪酸のメカニズムと標的を研究することは、レジオとステレオ異性体の混合物として存在し、純粋な量を得る方法が困難であることが証明されています。エナンチオマーとレジオソーマーが必要です。これらの化合物を化学的に合成するための従来の手段は効果がないことが証明されている。エポキシ化のためのメタ-クロロペルオキシ安息香酸のようなペルオキシ酸の使用は、多くの欠点を有し、特にエポキシ化選択性の欠如は、個々のレジオソーマーおよびエナンチオマーの高価で骨の折れる精製を必要とする。DHAおよびEPA代謝産物の全合成は可能であるが、高コストおよび低収率12、13などの大規模合成には実用的ではないという欠点にも苦しんでいる。酵素反応がレジオおよびステレオ選択的14であるとして、効率的な全体的な生産は、酵素合成で達成することができる。研究は、AAとEPA(BM3を用いて)の酵素エポキシ化が直腸選択的およびエナンチオ選択的15、16、17、18の両方であることを示しているが、この手順はDHAでテストされていない、または大規模なスケール。我々の方法の全体的な目標は、スケールアップし、この化学酵素エポキシ化を最適化し、個々のエナンチオマーとして大量の純粋なエポキシ脂肪酸を迅速に生成することです。ここで提示された方法を使用して, 研究者は、EDPや他のPUFAエポキシ代謝物の合成のためのシンプルで費用対効果の高い戦略へのアクセスを持っています.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

エポキシ脂肪酸と呼ばれる様々な多価不飽和脂肪酸(PUF)のエポキシ化代謝物は、ヒト生理学において幅広い役割を有する。これらの代謝産物は、酵素のシトクロムP450クラスによって内因性に産生される。その多様で強力な生物学的効果のために, これらの代謝産物を研究することにかなりの関心があります。.エポキシ脂肪酸は、最初にかなりの量と高純度で取得する必要があるため、体内でこれらの代謝産物のユニークな役割を決定することは困難な作業です。天然源から化合物を得ることは多くの場合、労働集約的であり、可溶性エポキシドヒドロラーゼ(sEH)は代謝産物を急速に加水分解する。一方、化学反応を介してこれらの代謝産物を得ることは非常に非効率的であり、純粋なレジオソーマーおよびエナンチオマー、低収率、および広範な(そして高価な)精製を得ることの難しさに起因する。ここでは、バチルス由来の細菌CYP450酵素であるBM3を用いたエポキシ化によるDHAからの19(S)、20(R)-および16(S)、17(R)-エポキシドコサペンタエン酸(EDP)の効率的な酵素合成を提示する。 メガテリウム(それは大腸菌で容易に発現される)。核磁気共鳴分光法(NMR)、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)を用いて、純度の特性評価と決定を行います。この手順は、PUFAエポキシ代謝産物の酵素合成の利点を示し、類似性エポキシエポキシサトリエノICを産生するアラキドン酸(AA)およびエイコサペンタエン酸(EPA)を含む他の脂肪酸のエポキシ化に適用可能である。酸(E):エポキシアイコサテトレーネイン酸(EQ)。

酵素エポキシ化から粗混合物を精製する際に得られるフラッシュカラムクロマトグラム(以下に説明するように自動フラッシュ精製システムを用いて行う)を図1に示す。レジジオソーマーのエステル化および分離に続いて、純16(S)、17(R)-EDPおよび19(S)、20(R)-EDPメチルエステルが得られた。通常、それらはおよそ1:4から1:5の...

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Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

ドコサヘキサエノイ酸、エイコサペンタエノイック、アラキドイン酸のエポキシ化代謝産物の酵素合成

細菌シトクロムを用いたアラキドン酸(AA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)のエポキシドの特異的なエナンチオマーおよびレジオソームの大規模な酵素合成および精製に有用な方法を提示する。P450酵素(BM3)。

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

したがって、私たちのプロトコルは、エアンチオピュールエポキシ脂肪酸を調製することができ、この方法は、これらの代謝産物が体内で作用するメカニズムに関する研究を進めるのに役立つかもしれません。歴史的に、純粋なエポキシ脂肪酸は非常に入手が困難である。したがって、私たちのプロトコルはシンプルで迅速で費用対効果が高く、大量の代謝物を準備することができます。はい、DHAのプロトコルを開発しましたが、EPAやアラキドン酸にも非常にうまく機能します。試薬の一部は空気に敏感で、具体的にはDHAとNADPHであるため、セットアップが簡単になるように事前にペアリングしてください。また、危険に注意してください。私たちのプロトコルは、酵素学と有機化学の両方の技術を使用しています。視覚化は、これらの分野の特殊な手法に精通していない読者や視聴者を支援するために重要です。接種するには、0.5ミリグラムのアンピシリンを補充した無菌LBスープの5ミリリットルにpBS-BM3トランスフェクションDH5アルファ大腸菌のグリセロールストックに浸した無菌ループまたはピペットを使用してください。200rpmで24時間37°Cのシェーカーで細胞培養をインキュベートする。その後、5ミリリットルのスターター培養と100ミリグラムのアンピシリンを、エルレンマイヤーフラスコの無菌LBスープ1リットルに加えます。摂氏37度で200rpmで6時間振り、200rpmで摂氏30度で18時間振ります。その後、遠心分離チューブに細胞培養物を集め、1,000倍gで10分間摂氏4度で遠心分離する。上清を別のフラスコに注ぎます。漂白剤で除染するか、オートクレーブを使用し、酵素精製まで細胞ペレットをマイナス78°Cで保存します。細胞溶解を行うために、まず氷上の細胞ペレットを解凍し、トリス、PMSF、およびEDTAを含む氷冷可溶化バッファーの40ミリリットルで再懸濁する。氷の上で、超音波ホモジナイザーで1分間細胞を超音波処理し、出力電力設定は10、デューティは100で、続いて細胞をライスするために氷の上で1分間の休憩を取ります。この手順を 6 回繰り返します。細胞の残骸をペレットに11,000倍gで30分間摂氏4度で遠心分離する。アフィニティクロマトグラフィーを行うために、冷たい部屋または冷蔵庫に、摂氏4度で、まずpH 7.8で10ミリモルトリスのバッファーAの5カラム体積の樹脂を洗浄することによって強力なアニオン交換クロマトグラフィーカラムを準備する。次に、細胞ライゼートの上清を平衡カラムに加え、冷たい緩衝液Aの3カラム体積でカラムを洗浄し、10ミリモルトリスと600ミリモル塩化ナトリウムの6カラム量のコールドバッファーBでカラムを洗浄してBM3を溶出させる。赤褐色の溶出分率を収集します。すぐに使用されていない場合は、グリセロールの等量と混合し、液体窒素とフラッシュフリーズします。凍結した溶液をマイナス78°Cで保存します。DHAのエポキシ化を行うために、まず解凍されたBM3酵素の濃度を決定し、一酸化炭素ジチオン酸スペクトルアッセイ法に従う。次に、磁気攪拌板上で撹拌される2リットルの反応バッファーを含むビーカーに、DMSOの18.8ミリリットルに希釈したDHAの0.94ミリモルを加え、BM3酵素を20ナノモルに希釈した。溶液が攪拌している間に、NADPHの0.94ミリモルを含む反応バッファーの8.7ミリリットルを加えることによってエポキシ化反応を開始する。シリンジに取り付けられた空気で満たされた風船とビーカーの内側にテーピングされた針で反応混合物に空気を泡立てながら、反応を30分間かき混ぜます。その後、反応混合物の1マイクロリットルを引き上げ、340ナノメートルで吸光度を測定するためにNanoDrop分光光度計に入れます。水をブランクとして使用します。残りの吸光度が存在しない場合は、NADPH が消費されたことを示す、反応が完了します。反応混合物を滴下してゆっくりと1モルのシュウ酸を加えることによって、溶液のpHが約4に達するまで焼入れる。次に、2リットルの無水、過酸化物を含まないジエチルエーテルでクエンチバッファー溶液を抽出します。セパレート漏斗を使用して層を振り、分離し、エーテルをエルレンマイヤーフラスコに集めます。さらに2回繰り返し、約50グラムの無水硫酸マグネシウムを加えてエーテルを乾燥させます。真空フィルター漏斗上で、乾燥したエーテルを注ぎ、硫酸マグネシウムを濾過し、濾過したエーテル層をロータリーエバポレーターの丸底フラスコに移します。回転速度を中型に調整し、液体を濃縮して粗いEDP残渣を得るように真空を開始します。残渣を40グラムのシリカカートリッジにロードし、自動フラッシュ精製機を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーを実行します。ヘキサンで酢酸エチル10%から開始し、22分間にわたってヘキサンで60%酢酸エチルまでランプアップします。分数はチューブに自動的に集められます。次に、各ピークからの分数を丸底フラスコに組み合わせ、ロータリーエバポレーターに乗せて、蒸発を開始します。3つの画分が得られる、DHA、EDP異性体、及びジポキシド。得られた0.151グラムのエポキシドをエステル化するには、丸底フラスコまたは小さなバイアルに、無水メタノール2ミリリットルと無水トルエン3ミリリットルを加え、攪拌棒を加える。ゴム中隔と針を通してアルゴンで満たされた風船とフラスコを接続し、攪拌しながら注射器を介して2モルTMSジアゾメタンの0.26ミリリットルを追加します。10分間待ち、淡い黄色が表示されるまでTMS-ジアゾメタンを05ミリリットル追加します。30分後、ロータリーエバポレーターを使用して慎重に混合物を濃縮し、40グラムのシリカゲルカラムカートリッジをフラッシュクロマトグラフィーマシンに使用して残渣を精製します。22分間にわたってヘキサン中に4%酢酸エチルのイソクラティック濃度を有するエルテ。精製した19S、20R-EDPメチルエステルを含む画分を最初に集め、続いて16S、17R-EDPメチルエステルを回収する。さて、8対1のヘキサン対エチル酢酸混合物中の薄層クロマトグラフィーによる分数を評価する。過マンガン酸カリウムを含む染色物は、両方の異性体を含む任意の混合分画をチェックする。各ピークに対応する分率をロータリーエバポレーターに濃縮し、次いでバランスをとって得られるEDPエステルの量を求めます。混合画分が残っている場合は、以前使用したのと同じ溶媒系でそれらを再クロマトグラフ化します。個々のレジオイソーマーを含む各分画をロータリーエバポレーターに濃縮する。個々のEDPメチルエステルレジオアイマーを酸形態に変換するには、EDPエステルを0.1ミリモルあたり約0.7ミリリットルのTHFで小さなバイアルで希釈し、0.175ミリリットルの水と一緒に希釈します。氷浴でバイアルを摂氏0度に冷却し、水酸化リチウム溶液の3つの同等物を加え、室温に温めながら一晩アルゴンの下でかき混ぜる。朝、酸性ギ酸を徐々に加えて反応を焼き付け、混合物のpHが3~4に達するまで。その後、水と酢酸エチル2ミリリットルを加え、層を分離する。10ミリリットルの酢酸エチルで水層を3回抽出し、20ミリリットルの飽和塩水溶液で洗浄し、溶液中に数グラムの無水硫酸ナトリウムを加えて酢酸エチル層を乾燥させる。ロータリーエバポレーターを使用して酢酸エチル溶液を濃縮し、ヘキサンを10ミリリットル加え、再び濃縮します。残留ギ酸を熱帯に除去するために2回繰り返す。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、15分間にわたって酢酸エチルを10~30%溶出する。目的の分画をロータリーエバポレーターに濃縮し、真空中で乾燥させて精製された酸を得る。酵素的エポキシ化から粗混合物を精製した際に得られたフラッシュカラムクロマトグラムをここに示す。3つの主要なピークが得られた、第1、未反応のDHA、第2、EDP異性体の混合物、及び、第3に、正常過酸化生成物であるジエポキシドの順に溶出する。レギオアイソームのエステル化および分離後、プロトンNMRスペクトルは、高純度16S、17R-EDPおよび19S、20R-EDPメチルが得られたことを示す。キラルHPLCは、EDPの酸形態のエノミオマー純度を確認した。汚染を避けるために取り扱い、接種しながら、あなたのスープを滅菌保つようにしてください。エポキシ化は、他の脂肪酸に使用することができる。そこで、アラキドン酸とエイコサペンタエン酸を使用して試し、エヌチオピュアエポキシドの収量が良くなったため、14、15-EET、17、18-EEQになりました。したがって、研究者がエポキシ脂肪酸にアクセスすることを可能にするプロトコルは、これらの化合物の生物学的機能の研究に役立つ可能性があり、薬物リードとしての使用につながる可能性があります。有害な化学物質は接触によって危険なPMSFとTMS-ジアゾメタンであり、接触および吸入によって非常に有毒である。だから後者は、ヒュームフードと適切な個人的な保護具で使用する必要があります。

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