Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

이 작품은 R00 ES024806 (건강의 국가 학회), DMS-1761320 (국립 과학 재단) 및 미시간 주립 대학에서 시작 기금에 의해 지원됩니다. 저자는 준 양 박사 (데이비스 캘리포니아 대학)와 라리타 Karchalla (미시간 주립 대학) 효소 반응의 최적화에 대한 도움을 감사하고 자, 박사 토니 쉴밀러 (MSU 질량 분광및 Metabolomics 시설) HRMS 데이터 수집에 대한 지원을 제공합니다.

주의: 나열된 화학물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오.
1. 야생형 BM3의 식
<ol><li>접종 pBS-BM3 DH5α 대장균 (박사 F. 앤 워커의 관대 한 기부) 5 mL의 멸균 LB 국물 0.5 mg의 암피실린을 20 mL 배양 튜브에 첨가했습니다.</li>
	<li>200 rpm에서 24 시간 동안 37 °C에서 셰이커에서 세포 배양을 배양합니다. 펀바흐 또는 에를렌마이어 플라스크에 ?...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

우리는 DHA의 두 가지 가장 풍부한 에폭시 대사 산물을 준비하기위한 운영적으로 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시 - 19,20 및 16,17-EDP. 이러한 에폭시 지방산은 야생형 BM3 효소를 사용하여 고도로 에난티오퓨어(S,R-이솜) 형태로 제조될 수 있다. 문제 해결에 사용될 수 있는 몇 가지 중요한 점과 AA 및 EPA의 enantiopure 에폭시 대사 산물을 준비하는 우리의 방법의 확장은 아래에 설명되어 있습니...

고도 불포화 지방산 (특히 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산)이 인간 생물학에서 재생하는 역할에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가함에 따라, 연구자들은 자신의 대사 산물이 매력적인 혜택의 넓은 범위의 주의를 촬영하고있다 전시. 특히, 효소의 시토크롬 P450 클래스에 의해 생성된 에폭시 지방산 대사산물은 큰 초점포인트가 되어 왔다. 예를 들어, 에폭시에코사트리노산(EETs), 에폭시도코사펜타에노산(EDPs) 및 에폭시코사테라에노산(EEQs)을 포함한 많은 PUFA 에폭산화물은 혈압 및 염증조절에 중요한 역할을 합니다 1,2 , 3개 , 4개 , 5. 흥미롭게도, AA 및 EPA 에폭사이드의 특정 상체및 레지오머는 혈관 수축에 다양한효과를 가지는 것으로 알려져 있다 6,7. EET및 EEQs의 상체및 레지오좀의 생리학적 효과는 문서화되었지만, DHA로부터 형성된 유사한 에폭시도코사펜타에노산(EDPs)의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. EPA와 DHA가 풍부한 피시 오일8의광범위한 사용은 EDP9에대한 관심을 불러 일으켰습니다. 이러한 보충제의 혜택은 부분적으로 다운스트림 DHA 대사 산물로 인해 것으로 추정된다 (16,17-EDP 와 19,20-EDP는 가장 풍부한 되는) EDP의 생체 내 수준은 다이어트에 DHA의 양과 아주 잘 조정하기 때문에10, 11.
대사체학, 화학 생물학 및 기타 방법에 의한 이러한 에폭시 지방산의 메커니즘과 표적을 연구하는 것은 레지오-및 스테레오 이성물질의 혼합물로 존재하기 때문에 부분적으로 도전적인 것으로 입증되었으며, 순수한 양의 지방을 얻는 방법 적분자 및 레지아이좀이 필요합니다. 화학적으로 이러한 화합물을 합성 하기 위한 전통적인 수단 효과가 입증 되었습니다. 에폭시화를 위한 메타-클로로페록시벤조산과 같은 페록시산의 사용은 많은 단점, 특히 개별 레지오이좀제와 상각체의 고가의 고된 정제를 필요로 하는 에폭시화 선택성의 부족이 있다. DHA 및 EPA 대사산물의 총 합성이 가능하지만, 또한 높은 비용과 낮은 수율12,13과같은 대규모 합성에 비실용적만드는 단점을 앓고 있다. 효소 반응이 레지오-및 스테레오셀렉티브(14)이기 때문에 효소합성으로 효율적인 전체 생산을 달성할 수 있다. 연구 결과에 따르면 AA와 EPA(BM3)의 효소 에피시형성은 재지오선택적 및 enantioselective15,16,17,18,그러나 이 절차는 DHA로 시험되지 않았거나 큰 규모. 우리의 방법의 전반적인 목표는 그들의 개별 enantiomers로 순수한 에폭시 지방산의 상당한 양을 급속하게 생성하기 위하여 이 화학 요법 에폭시를 확장하고 낙관하는 것이었습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용하여, 연구원은 EDP 및 기타 PUFA 에폭시 대사 산물의 합성을위한 간단하고 비용 효율적인 전략에 액세스 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

다양한 불포화 지방산 (PUFAs)의 에폭시화 대사 산물은 에폭시 지방산이라고 불리우며 인간 생리학에서 광범위한 역할을 합니다. 이 대사 산물은 효소의 시토 크롬 P450 클래스에 의해 내인성으로 생산됩니다. 그들의 다양 하 고 강력한 생물학적 효과 때문에, 이러한 대사 산물 공부에 상당한 관심이 있다. 에폭시 지방산이 먼저 상당한 양과 높은 순도로 얻어져야하기 때문에 신체에서 이러한 대사 산물의 독특한 역할을 결정하는 것은 어려운 작업입니다. 천연 공급원으로부터 화합물을 얻는 것은 종종 노동 집약적이며 수용성 에폭사이드 하이드로 라제 (sEH)는 대사 산물을 빠르게 가수 분해합니다. 다른 한편으로는, 화학 반응을 통해 이러한 대사 산물을 얻는 것은 매우 비효율적입니다, 순수한 regioisomers 및 상체 물질을 얻기의 어려움으로 인해, 낮은 수율, 광범위한 (고가의) 정제. 여기에서, 우리는 BM3를 가진 에폭시를통해 DHA에서 19(S),20(R)-및 16(S),17(R)-에폭시도코펜타에노산(EDPs)의 효율적인 효소 합성을 제시합니다, 원래 바실러스에서 분리된 세균 CYP450 효소 megaterium (즉, 쉽게 대장균에표현된다). 순도의 특성화 및 측정은 핵 자기 공명 분광법 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분석법 (MS)으로 수행됩니다. 이 절차는 PUFA 에폭시 대사 산물의 효소 합성의 이점을 설명하고, 유사한 에폭시에이코사이코노레이노어를 생성하는 아라키돈산(AA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 포함한 다른 지방산의 에폭시화에 적용가능하다. 산 (EETs) 및 에폭시에이코에테라에노산(EEQs).

효소 에폭시화로부터 원유 혼합물의 정제시 얻어진 플래시 컬럼 크로마토그램(아래와 같이 자동화된 플래시 정제 시스템을 사용하여 수행됨)은 도1에 나타내었다. 레지오이머의 에스테르화 및 분리에 이어,순수한 16(S),17(R)-EDP 및 19(S),20(R)-EDYl 에스테르를 수득하였다. 전형적으로, 이들은 대략 1:4 대 1:5 비율로 존재하며, 주?...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

도코사헥사에노믹, 에이코사펜타에노믹, 아라키돈산의 에폭시화된 대사산물의 효소 합성

우리는 세균성 시토크롬을 사용하여 아라키돈산(AA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜테노산(EPA)의 특정 상악제 및 레지오이좀의 대규모 효소 합성 및 정제에 유용한 방법을 제시합니다. P450 효소 (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

그래서 우리의 프로토콜은 우리가 enantiopure 에폭시 지방산을 준비하는 것을 허용하고, 이 방법은 이 대사 산물이 바디에서 작용하는 기계장치에 대한 연구를 진행하는 것을 도울 수 있습니다. 역사적으로 순수 에폭시 지방산을 얻기가 매우 어렵습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 간단하고 빠르며 비용 효율적이며 이러한 대사 산물의 상당한 양을 준비할 수 있습니다.예, 우리는 DHA에 대한 프로토콜을 개발, 하지만 그것은 또한 EPA와 아라키도니아산에 대 한 아주 잘 작동. 시약의 일부는 공기에 민감한, 특히 DHA와 NADPH이기 때문에 신속하게 작업하고 설정이 간단하도록 모든 것을 미리 페어링해야합니다. 또한, 위험을 주의하십시오.우리의 프로토콜은 효소학과 유기 화학 모두에서 기술을 사용합니다. 시각화는 이러한 분야의 특수 기술에 익숙하지 않은 독자와 시청자를 돕기 위해 매우 중요합니다. 접종을 하려면 pBS-BM3 의 글리세롤 스톡에 담근 멸균 루프 또는 파이펫을 0.5 밀리그램의 암피실린으로 보충한 멸균 LB 국물의 5밀리리터에 담근 멸균 루프 또는 파이펫을 사용하십시오.200 rpm에서 24 시간 동안 섭씨 37도에서 셰이커로 세포 배양을 배양하십시오. 그런 다음, 5 밀리리터 스타터 배양과 100 밀리그램의 암피실린을 Erlenmeyer 플라스크에 멸균 LB 국물에 1리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 6시간 동안 200rpm에서, 섭씨 30도에서 200rpm에서 18시간 동안 흔들어 보겠습니다.그 후, 원심분리기 튜브로 세포 배양을 수집하고, 1, 000g에서 10분 동안 섭씨 4도에서 세포 배양을 원심분리한다. 상체를 다른 플라스크에 붓습니다. 표백제또는 오토클레이브를 사용하여 오염을 제거하고 효소가 정화될 때까지 세포 펠릿을 섭씨 영하 78도에 보관합니다.세포 용해를 수행하기 위해 먼저 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 Tris, PMSF 및 EDTA를 포함하는 얼음 차가운 용용화 버퍼40 밀리리터에서 다시 중단하십시오. 얼음에 있는 동안, 초음파 균질화로 1 분 동안 세포를 초음파 처리, 출력 전원 설정 10 및 100의 의무, 세포를 lyse하기 위해 얼음에 1 분 휴식. 이 절차를 여섯 번 반복합니다.원심분리기세포는 세포 잔해를 11, 000배에서 30분 동안 섭씨 4도에서 흘린다. 친화도 크로마토그래피를 수행하기 위해, 슬라이딩 도어가있는 차가운 방이나 냉장고에서 섭씨 4도에서 먼저 pH 7.8에서 10 밀리알러 트리스의 5 개의 열 볼륨으로 수지를 세척하여 강력한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 다음으로, 셀 용액의 상체를 평형 컬럼에 추가하고, 차가운 완충제 A.Then의 3개의 컬럼 부피로 컬럼을 세척하고, 10밀리머 트리스의 6개의 컬럼 부피와 600밀리알라 나트륨염화로 컬럼을 세척하여 BM3를 엘테한다.붉은 갈색 용액 분획을 수집합니다. 단백질이 즉시 사용되지 않는 경우 동일한 양의 글리세롤과 혼합하고 액체 질소와 플래시 프리즈를 넣습니다. 냉동 용액을 영하 78도에 보관하십시오.DHA의 편광을 수행하기 위해, 일산화탄소 디티온인테 스펙트럼 분석 방법에 따라 먼저 해동 된 BM3 효소의 농도를 결정한다. 그런 다음, 자기 교반 판에 교반되는 반응 버퍼의 두 리터를 포함하는 비커에서, DMSO의 18.8 밀리리터와 BM3 효소가 20 나노 몰라로 희석된 DHA의 0.94 밀리몰을 추가합니다. 용액이 교반하는 동안 NADPH의 0.94 밀리몰을 함유한 반응 버퍼8.7 밀리리터를 추가하여 편산화 반응을 시작합니다.반응에 30분 동안 저어주사기에 부착된 공기가 채워진 풍선과 비커 내부에 바늘이 부착되어 반응 혼합물에 공기를 부적시세요. 그 후, 반응 혼합물의 마이크로리터 1개를 끌어서 나노드롭 분광광계에 넣어 340 나노미터에서 흡광도를 측정한다. 물을 빈 칸으로 사용하십시오.NADPH가 소비되었음을 나타내는 남은 흡광도가 없는 경우 반응이 완료됩니다. 용액의 pH가 약 4에 도달할 때까지 1-어금다 옥살산을 드롭와이즈로 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 담급니다. 이제 담금질 버퍼 용액을 과산화수소가 없는 디틸 에테르 2리터로 추출합니다.분리 깔때기를 사용하여 레이어를 흔들고 분리하고 에테르를 Erlenmeyer 플라스크로 수집합니다. 두 번 더 반복하고 약 50 그램의 무수 마그네슘 황산염을 추가하여 에테르를 건조시킵니다. 진공 필터 깔때기에 말린 에테르를 부어 황산 마그네슘을 걸러내고 여과 된 에테르 층을 회전 증발기의 둥근 바닥 플라스크로 옮춥니다.회전 속도를 중간 크기로 조정하고 진공을 시작하여 액체를 농축하여 원유 EDP 잔류물을 산출합니다. 잔류물을 40그램의 실리카 카트리지에 적재하여 자동화된 플래시 정화 기를 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피를 수행합니다. 헥산에서 10%에틸 아세테이트에서 시작하여 22분 동안 헥산에서 최대 60%의 아세테이트를 장착할 수 있습니다.분수는 자동으로 튜브에서 수집됩니다. 그런 다음 각 피크의 분획을 둥근 바닥 플라스크에 결합하고 회전 증발기에 넣고 증발을 시작합니다. 3개의 분획, DHA, EDP 이소마, 및 디옥사이드를 얻습니다.얻은 0.151 그램의 에폭료를 원형 플라스크 또는 작은 유리병에 에스로티화하려면 무수성 메탄올 2 밀리리터와 무수 성 톨루엔 3 밀리리터를 추가하고 저어바를 추가합니다. 플라스크를 고무 중격과 바늘을 통해 아르곤으로 채워진 풍선으로 연결하고 교반하는 동안 주사기를 통해 2 개의 어금니 TMS-diazomethane0의 0.26 밀리리터를 추가하십시오. 10분간 기다린 후 TMS-diazo메탄의 05 밀리리터를 추가하여 옅은 노란색이 나타날 때까지 기다립니다.30분 후, 회전 증발기를 사용하여 혼합물을 조심스럽게 농축하고, 플래시 크로마토그래피 기계에 40그램 실리카 젤 컬럼 카트리지를 사용하여 잔류물을 정화한다. 22분 동안 헥산에서 4%에틸 아세테이트의 동위 층 농도를 가진 엘루트. 정제된 19S, 20R-EDP 메틸 에스테르를 함유한 분획을 먼저 수집하고, 그 다음으로 16S, 17R-EDP 메틸 에스테르가 그 뒤를 이다.지금, 8 대 1 헥산 -에틸 아세테이트 혼합물에서 얇은 층 크로마토그래피에 의해 분획을 평가합니다. 과만가네이트 칼륨을 가진 얼룩은 두 이소마를 포함하는 혼합 분획을 확인합니다. 회전 증발기에 각 피크에 해당하는 분획을 농축한 다음 균형에 무게를 두어 얻은 EDP 에스테르의 양을 결정합니다.혼합 분획이 남아 있으면 이전에 사용했던 것과 동일한 용매 시스템으로 다시 크로마토그래프를 다시 사용합니다. 개별 혈관성자를 포함하는 각 분획을 회전 증발기에 농축합니다. 개별 EDP 메틸 에스테르 regioisomers를 그들의 산 형태로 변환하려면, 물 0.1밀리리터와 함께 에스테르의 0.1 밀리몰당 THF의 약 0.7 밀리리터와 작은 유리병에 EDP 에스테르를 희석.유리병을 얼음 욕조에서 섭씨 0도까지 식히고, 수산화 리튬 용액 3개 상당을 추가하고, 실온으로 따뜻해지는 동안 밤새 아르곤 아래 의욕판을 저어줍니다. 아침에, 혼합물의 pH가 3 ~ 4에 도달 할 때까지 천천히 포믹 산을 추가하여 반응을 담금질. 그런 다음, 층을 분리하기 위해 물과 에틸 아세테이트의 두 밀리리터를 추가합니다.에틸 아세테이트 10밀리리터를 3회 추출하고, 포화염수 액액 20밀리리터로 세척하고, 에틸 아세테이트 층을 건조시키기 위해 용액에 여러 그램의 무수성 나트륨 황산염을 첨가한다. 회전 증발기를 사용하여 에틸 아세테이트 솔루션을 농축하고, 육사 10밀리리터를 추가하고, 다시 농축한다. 잔류 포믹 산을 제거하기 위해 두 번 반복하십시오.플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화하여 15분 동안 10~30%의 아세테이트로 희석합니다. 회전 증발기에 원하는 분획을 농축하고, 정제산을 감당하기 위해 바쿠오에서 건조한다. 효소 에편화로부터 조분 혼합물의 정화 시 얻은 플래시 컬럼 크로마토그램이 여기에 나와 있다.세 가지 주요 피크를 얻어, 첫 번째, 비반응 DHA, 두 번째, EDP 이소마의 혼합물, 그리고, 세 번째, 디옥사이드의 순서로 청례, 이는 정상적인 과산화 제품입니다. 혈관성모의 에스테르화 및 분리에 이어, 양성자 NMR 스펙트럼은 고순도 16S, 17R-EDP 및 19S, 20R-EDP 메틸 에스테르를 획득했음을 나타낸다. 키랄 HPLC는 EDP의 산 형태의 내황 순도를 확인했습니다.오염을 피하기 위해 처리 하고 접종하는 동안 국물을 멸균하십시오. 편산화는 다른 지방산에 사용될 수 있다. 그래서 우리는 또한 아라키도닉과 에이코사펜타테노산으로 시도했고, 우리는 그 enantiopure 에산화물의 좋은 수확량을 얻었기 때문에 14, 15-EET 및 17, 18-EEQ.그래서 연구원이 에폭시 지방산에 접근할 수 있게 하는 프로토콜은 이 화합물의 생물학 기능에 대한 연구에 도움이 될 수 있습니다, 이는 약물 리드로 그들의 사용으로 이어질 수 있습니다. 유해 화학물질은 접촉에 의해 유해한 PMSF와 접촉 및 흡입에 의해 매우 독성이 있는 TMS-diazo메탄입니다. 그래서 후자는 연기 후드와 적절한 개인 보호 장비에 사용해야합니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

연구

화학

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

카르 복실 산, 붕소 산, 그리고 아민의 정성 식별 십자형 형광체를 사용하여

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

기능화의 합성 및 특성 금속 - 유기 프레임 워크

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

라이트 기반 효소 탈 카르 복 실화

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

금 나노 막대의 하이드로 퀴논 기반 합성

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

N-glycans 배열 개발 및 HIV 항 체의 항 암 치료 효소 합성 프로 파일링

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...