Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Dette arbeidet er finansiert av r00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) og oppstart midler fra Michigan State University. Forfatterne ønsker å takke Dr. jun Yang (University of California på Davis) og Lalitha Karchalla (Michigan State University) for å få hjelp med optimalisering av enzymatisk reaksjon, og Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass massespektrometri og Plantemetabolomikk Facility) for hjelp med HRMS datainnsamling.

FORSIKTIG: ta kontakt med alle relevante Material sikkerhetsdatablad (muskel-og skjelettlidelser) før du bruker de oppførte kjemikaliene.
1. uttrykk for vill-type BM3
<ol><li>Vaksinere pBS-BM3 transfekterte DH5α E. coli (en generøs donasjon fra Dr. F. Ann Walker) i 5 ml steril lb buljong med 0,5 mg Ampicillin lagt inn i en 20 ml kultur tube.</li>
	<li>Ruge celle kulturen i en shaker ved 37 ° c i 24 timer ved 200 rpm. Tilsett natten starter kulturen (5 mL) og 100 mg Ampicillin t...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

Vi presenterer her en operativt enkel og kostnadseffektiv metode for å forberede de to mest tallrike epoxy metabolitter av DHA-19, 20 og 16, 17-EDP. Disse epoxy fettsyrer kan tilberedes i svært enantiopure (som sin S, R-isomerene) form med vill-type BM3 enzym. Flere kritiske punkter som kan brukes til feilsøking, og forlengelsen av vår metode for å forberede enantiopure epoxy metabolitter av AA og EPA, er beskrevet nedenfor.
BM3 lagring retningslinjer
<p clas...

Som interesse i rollen som flerumettede fettsyrer (spesielt Omega-3 og Omega-6 flerumettede fettsyrer) spille i menneskets biologi har vokst de siste årene, har forskerne tatt notis av det store utvalget av tiltalende fordeler at deres metabolitter Utstillingen. Spesielt, epoxy fettsyrer metabolitter produsert av cytokrom P450 klasse av enzymer har vært et stort fokuspunkt. For eksempel, mange PUFA epoksider, inkludert epoxyeicosatrienoic syrer (EETs), epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) og epoxyeicosatetraenoic syrer (EEQs), spille en avgjørende rolle i regulering av blodtrykk og betennelse1,2 , 3 andre priser , 4 andre priser , 5. interessant, den spesifikke enantiomerer og regioisomers av AA og EPA epoksider er kjent for å ha varierende effekt på vasokonstriksjon6,7. Mens fysiologiske effekter av enantiomerer og regioisomers av EETs og EEQs har blitt dokumentert, er lite kjent om effekten av den analoge epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) dannet fra DHA. Utbredt bruk av fiskeolje8, som er rik på både EPA og DHA, har også rørt interesse for EDPs9. Fordelene med disse kosttilskudd antas å være delvis på grunn av nedstrøms DHA metabolitter (16, 17-EDP og 19, 20-EDP er den mest tallrike) fordi in vivo nivåer av EDPs koordinere veldig godt med mengden av DHA i dietten10, 11i.
Å studere mekanismene og målene til disse epoxy fettsyrene ved Plantemetabolomikk, kjemisk biologi og andre metoder har vist seg å være utfordrende, delvis fordi de eksisterer som blandinger av Regio-og stereo-isomerene, og en metode for å oppnå rene mengder enantiomerer og regioisomers er nødvendig. Konvensjonelle midler for kjemisk syntetisere disse forbindelsene har vist seg ineffektive. Bruk av peroksysyrer som meta-chloroperoxybenzoic acid for epoxidation har mange ulemper, særlig mangelen på epoxidation selektivitet, som nødvendiggjør dyrt og omhyggelig rensing av individuelle regioisomers og enantiomerer. Total syntese av DHA og EPA metabolitter er mulig, men også lider av ulemper som gjør det upraktisk for stor skala syntese som høye kostnader og lav avkastning12,13. Effektiv total produksjon kan oppnås med enzymatisk syntese, som enzymatisk reaksjoner er Regio-og stereoselektiv14. Studier viser at enzymatisk epoxidation av AA og EPA (med BM3) er både regioselektive og enantioselective15,16,17,18, men denne prosedyren har ikke blitt testet med DHA, eller på en stor Skala. Det overordnede målet med vår metode var å skalere opp og optimalisere denne chemoenzymatic epoxidation til raskt å produsere betydelige mengder ren epoxy fettsyrer som deres individuelle enantiomerer. Ved hjelp av metoden som presenteres her, har forskerne tilgang til en enkel og kostnadseffektiv strategi for syntese av EDPs og andre PUFA epoxy metabolitter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

De epoxidized metabolitter av ulike flerumettede fettsyrer (Fuf), kalt epoxy fettsyrer, har et bredt spekter av roller i menneskets fysiologi. Disse metabolitter produseres endogenously av cytokrom P450 klasse av enzymer. På grunn av deres mangfoldige og potente biologiske virkninger, er det stor interesse for å studere disse metabolitter. Fastsettelse av de unike rollene til disse metabolitter i kroppen er en vanskelig oppgave, som epoxy fettsyrer må først fås i betydelige mengder og med høy renhet. Innhenting av forbindelser fra naturlige kilder er ofte arbeidsintensiv, og løselig epoxide hydrolases (sEH) raskt hydrolyserer metabolitter. På den annen side er innhenting av disse metabolitter via kjemiske reaksjoner svært ineffektiv, på grunn av vanskelighetene med å skaffe ren regioisomers og enantiomerer, lav avkastning, og omfattende (og dyre) rensing. Her presenterer vi en effektiv enzymatisk syntese av 19 (s), 20 (r)-og 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) fra DHA via epoxidation med BM3, en bakteriell CYP450 enzym isolert opprinnelig fra Bacillus megaterium (som er lett uttrykt i Escherichia coli). Karakterisering og bestemmelse av renhet er utført med kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi (NMR), høy ytelse flytende kromatografi (HPLC), og masse massespektrometri (MS). Denne prosedyren illustrerer fordelene ved enzymatisk syntese av PUFA epoxy metabolitter, og gjelder for epoxidation av andre fettsyrer, inkludert arachidonic syre (AA) og eikosapentaensyre acid (EPA) til å produsere den analoge epoxyeicosatrienoic syrer (EETs) og epoxyeicosatetraenoic syrer (EEQs), henholdsvis.

Glimtet søylen kromatogram (utført benytter en automatisert glimtet rensing system idet beskrevet neden) oppnådd på rensing av det grov blanding fra enzymatisk epoxidation er vist inne skikkelsen 1. Etter esterification og separasjon av regioisomers, ren 16 (s), 17 (r)-EDP og 19 (s), 20 (r)-EDP methyl estere ble innhentet. Vanligvis er de til stede i en omtrentlig 1:4 til 1:5 ratio, med hovedproduktet er 19 (S)...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatisk syntese av Epoxidized metabolitter av dokosaheksaensyre, eikosapentaensyre, og arachidonic syrer

Vi presenterer en metode nyttig for storstilt enzymatisk syntese og rensing av spesifikke enantiomerer og regioisomers av epoksider av arachidonic syre (AA), dokosaheksaensyre syre (DHA), og eikosapentaensyre acid (EPA) med bruk av en bakteriell cytokrom P450 enzym (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Så vår protokoll tillater oss å forberede enantiopure epoxy fettsyrer, og denne metoden kan bidra til å fremme forskning på mekanismene som disse metabolitter handle i kroppen. Historisk er rene epoksyfettsyrer svært vanskelig å få tak i. Så vår protokoll er enkel, rask, kostnadseffektiv, og det tillater oss å forberede betydelige mengder av disse metabolittene.Ja, vi utviklet en protokoll for DHA, men det fungerer også veldig bra for EPA og arakidonsyre. Arbeid raskt, da noen av reagensene er luftfølsomme, spesielt DHA og NADPH, og sørg for å pare alt på forhånd slik at oppsettet er enkelt. Vær også oppmerksom på farene.Vår protokoll bruker teknikker i både enzymologi og organisk kjemi. Visualisering er avgjørende for å hjelpe lesere og seere som ikke er kjent med de spesialiserte teknikkene på disse feltene. For å inokulere, bruk en steril sløyfe eller pipette dyppet i glyserol lager av pBS-BM3 transfected DH5-alfa E.coli i fem milliliter steril LB kjøttkraft supplert med 0,5 milligram ampicillin.Inkuber cellekulturen i en shaker ved 37 grader Celsius i 24 timer ved 200 o/min. Deretter legger du til fem milliliter startkultur og 100 milligram ampicillin til en liter steril LB kjøttkraft i en Erlenmeyer kolbe. Rist ved 37 grader Celsius i seks timer ved 200 rpm, deretter ved 30 grader Celsius i 18 timer ved 200 rpm.Deretter samler du cellekulturen i sentrifugerør, og sentrifuger cellekulturen ved fire grader Celsius i 10 minutter ved 1000 ganger g. Hell av supernatanten i en annen kolbe. Dekontaminer med blekemiddel eller bruk autoklaven, og lagre cellepellet ved minus 78 grader Celsius til enzymrensing.For å utføre cellelys, først tine cellepellet på is, og resuspend i 40 milliliter iskalde solubilisering buffer som inneholder Tris, PMSF, og EDTA. Mens du er på is, sonikere cellene i ett minutt med en ultralyd homogenisator, med en utgangseffektinnstilling på 10 og plikt på 100, etterfulgt av en ett minutters pause på is for å lyse cellene. Gjenta denne prosedyren seks ganger.Sentrifuger cellen lysate ved fire grader Celsius i 30 minutter ved 11,000 ganger g å pellet cellen rusk. For å utføre affinitetkromatografi, i et kaldt rom eller kjøleskap med skyvedør, ved fire grader Celsius, forbereder du først en sterk anionutvekslingskromatografikolonne ved å vaske harpiksen med fem kolonnevolumer buffer A på 10-millimolar Tris ved pH 7,8. Deretter legger du til supernatanten til cellelylatene i den likevektskolonnen, og vasker kolonnen med tre kolonnevolumer kald buffer A.Deretter elutrer du BM3 ved å vaske kolonnen med seks kolonnevolumer kald buffer B på 10-millimolar Tris og 600-millimolar natriumklorid.Samle den rødbrune eluentfraksjonen. Hvis proteinet ikke brukes umiddelbart, bland det med like mye glyserol og blits med flytende nitrogen. Oppbevar den frosne oppløsningen ved minus 78 grader Celsius.For å utføre epoksidasjon av DHA, må du først bestemme konsentrasjonen av det tinte BM3-enzymet, i henhold til karbonmonoksiddithionite spektralanalysemetoden. Deretter, i et beger som inneholder to liter reaksjonsbuffer som omrøres på en magnetisk røreplate, tilsett 0,94 millimol DHA fortynnet i 18,8 milliliter DMSO og BM3-enzymet fortynnet til 20 nanomolar. Mens løsningen rører, begynner epoxidation reaksjonen ved å legge til 8,7 milliliter reaksjonsbuffer som inneholder 0,94 millimol nadph.Rør reaksjonen i 30 minutter mens boblende luft inn i reaksjonsblandingen med en luftfylt ballong festet til en sprøyte og nål teipet til innsiden av begeret. Deretter trekker du opp en mikroliter av reaksjonsblandingen, og legger den inn i et NanoDrop-spektrofotometer for å måle absorbansen ved 340 nanometer. Bruk vann som blank.Hvis det ikke er gjenværende absorbans, noe som indikerer at NADPH er konsumert, er reaksjonen fullført. Slukke reaksjonsblandingen ved sakte å tilsette en-molar oksalsyre dråpevis, til pH av løsningen når ca fire. Nå trekker du ut den slukkede bufferløsningen med to liter vannfri, peroksidfri dietyliser.Bruk en separatory trakt til å riste og skille lagene, og samle eteren i en Erlenmeyer kolbe. Gjenta to ekstra ganger, og tilsett ca 50 gram vannfri magnesiumsulfat for å tørke eteren. På en vakuumfiltertrakt, hell den tørkede eteren for å filtrere magnesiumsulfatet, og overfør det filtrerte eterlaget til en rund bunnkolbe av den roterende fordamperen.Juster rotasjonshastigheten til middels, og start vakuumet for å konsentrere væsken for å gi rå EDP-rester. Legg rester i en 40-gram silikakassett for å utføre flash-kolonnekromatografi ved hjelp av en automatisert blitsrensemaskin. Start på 10% etylacetat i hexanes, og rampe opp til 60% etylacetat i hexanes over 22 minutter.Fraksjonene samles automatisk inn i rør. Deretter kombinerer du fraksjonene fra hver topp til en rund bunnkolbe, legger på den roterende fordamperen og starter fordampningen. Tre fraksjoner oppnås, DHA, EDP isomers, og diepoxide.For å forestre de oppnådde 0,151 gram epoksid, i en rund bunnkolbe eller lite hetteglass, legg til to milliliter vannfri metanol og tre milliliter vannfri toluen, og legg til en rørestang. Koble kolben med en ballong fylt med argon gjennom en gummisepum og en nål, og tilsett 0,26 milliliter to-molar TMS-diazomethane gjennom en sprøyte under omrøring. Vent i 10 minutter, og legg til ytterligere 05 milliliter TMS-diazomethane til en blek gul farge vises.Etter 30 minutter, konsentrat blandingen forsiktig ved hjelp av den roterende fordamperen, og bruk en 40-gram silikagelkolonnepatron på flashkromatografimaskinen for å rense rester. Elute med en isokratisk konsentrasjon på 4% etylacetat i hexanes over 22 minutter. Samle fraksjoner som inneholder renset 19S, 20R-EDP metyl ester eluates først, etterfulgt av 16S, 17R-EDP metyl ester.Nå vurdere fraksjonene ved tynnlags kromatografi i en åtte-til-en heksan-til-etyl-acetat blanding. Flekk med kaliumpermanganat for å se etter blandede fraksjoner som inneholder begge isomers. Konsentrer brøkene som tilsvarer hver topp på en roterende fordamper, og vei deretter på en balanse for å bestemme mengden EDP-estere oppnådd.Hvis blandede fraksjoner forblir, re-kromatografi dem med samme løsemiddel system som tidligere brukt. Konsentrer hver brøkdel som inneholder den enkelte regioisomer på en roterende fordamper. For å konvertere individuelle EDP metyl ester regioisomers til sine syreformer, fortynne EDP ester i et lite hetteglass med ca 0,7 milliliter THF per 0,1 millimoles ester, sammen med 0,175 milliliter vann.Avkjøl hetteglasset til null grader Celsius i et isbad, tilsett tre ekvivalenter av litiumhydroksidløsning, og rør på en røreplate under argon over natten mens du varmer opp til romtemperatur. Om morgenen slukker du reaksjonen ved sakte å tilsette maursyre, til pH av blandingen når tre til fire. Deretter legger du til vann og to milliliter etylacetat for å skille lagene.Trekk ut vannlaget med 10 milliliter etylacetat tre ganger, vask med 20 milliliter mettet saltlakeløsning, og tilsett flere gram vannfri natriumsulfat i løsningen for å tørke etylacetatlaget. Konsentrer etylacetatløsningen ved hjelp av roterende fordamper, tilsett 10 milliliter heksaner og konsentrer igjen. Gjenta to ganger for å azeotropisk fjerne gjenværende maursyre.Rens rester med blitskolonnekromatografi, eluting med 10 til 30% etylacetat over 15 minutter. Konsentrer de ønskede fraksjonene i den roterende fordamperen, og tørk i vacuo for å ha råd til renset syre. Blitskolonnekromatrammet oppnådd ved rensing av råoljeblandingen fra enzymatisk epoksidasjon er vist her.Tre store topper ble oppnådd, eluting i rekkefølge av, først, unreacted DHA, andre, blanding av EDP isomers, og, tredje, diepoxide, som er normale over-oksidasjonsprodukter. Etter esterifisering og separasjon av regioisomers, proton NMR spektra indikerer at høy renhet 16S, 17R-EDP og 19S, 20R-EDP metyl estere ble oppnådd. Chiral HPLC bekreftet enantiomerisk renhet av syreformene til EDPs.Sørg for å holde kjøttkraft steril under håndtering og inokulering for å unngå kontaminering. Epoksidasjonen kan brukes til andre fettsyrer. Så vi prøvde det også med arakidoniske og eicosapentaenoic syrer, og vi fikk gode utbytter av disse enantiopure epoxides, så 14, 15-EET og 17, 18-EEQ.Så en protokoll som tillater forskere å få tilgang til epoxy fettsyrer kan hjelpe i forskning på biologiske funksjoner av disse forbindelsene, noe som kan føre til deres bruk som narkotika fører. De farlige kjemikaliene er PMSF, som er farlig ved kontakt, og TMS-diazomethane, som er svært giftig ved kontakt og innånding. Så sistnevnte skal brukes i en røykhette og med riktig personlig verneutstyr.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

Last Syntese av CdSe / CDer Rod og tetrapoder nanokrystaller

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Kvalitativ Identifikasjon av karboksylsyrer, boronsyrer, og aminer hjelp Cruciform fluorophores

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering av funksjon Metal-organisk Rammeverk

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

Syntese og reaksjon Kjemi til nanosize Monosodium titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Lys-drevet Enzymatisk dekarboksylering

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Hydrokinon Basert Syntese av gull nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatisk syntese av N- glykaner for matrisen utvikling og HIV antistoff profilering

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzymatisk Cascade reaksjoner for syntese av Chiral Amino alkoholer fra L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...