Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Эта работа финансируется R00 ES024806 (Национальные институты здравоохранения), DMS-1761320 (Национальный научный фонд) и стартап-фонды из Мичиганского государственного университета. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джун Яна (Калифорнийский университет в Дэвисе) и Лалиту Каршаллу (Мичиганский государственный университет) за помощь в оптимизации ферментативной реакции, и д-ра Тони Шилмиллера (МГУ Масс-спектрометрии и метаболомики) для помощи в получении данных HRMS.

ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием перечисленных химических веществ.
1. Выражение дикого типа BM3
<ol><li>Привить pBS-BM3 трансfected DH5 "E. coli (щедрое пожертвование от доктора ?...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

Мы представляем здесь оперативно простой и экономически эффективный метод подготовки двух наиболее распространенных эпоксидных метаболитов ДГК - 19,20 и 16,17-EDP. Эти эпоксидные жирные кислоты могут быть подготовлены в высоко энантиочисты (как их S,R-изомеры) форме с использованием фермента...

Поскольку интерес к роли, которую полиненасыщенные жирные кислоты (в частности, омега-3 и омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты) играют в биологии человека, в последние годы вырос интерес, исследователи обратили внимание на широкий спектр привлекательных преимуществ, которые их метаболиты Выставка. В частности, значительной точкой внимания были метаболиты эпоксидной жирной кислоты, вырабатываемые цитохромом класса P450. Например, многие эпоксидные паоксиды PUFA, в том числе эпоксикозатриноиновые кислоты (EET), эпоксидокозапентаеновые кислоты (EDPs) и эпоксикозатететрееновые кислоты (Экэ), играют важную роль в регуляции артериального давления и воспаления1,2 , 3 , 4 , 5. Интересно, что конкретные энантиомеры и региоисомеры АА и ЭПК эпоксиды, как известно, имеют различное влияние на сосудосуживание6,7. В то время как физиологические эффекты энантиомеры и региоизомы EETs и EE's были задокументированы, мало что известно о влиянии аналогичных эпоксидокосапентаевных кислот (ЭДП), образованных из ДГК. Широкое использование рыбьего жира8, который богат как EPA и ДГК, также вызвал интерес к EDPs9. Преимущества этих добавок, как полагают, отчасти из-за вниз по течению ДГК метаболитов (16,17-EDP и 19,20-EDP является наиболее распространенным), потому что в ививо уровни EDPs координировать очень хорошо с количеством ДГК в диете10, 11.
Изучение механизмов и целей этих эпоксидных жирных кислот метаболомией, химической биологией и другими методами оказалось сложным, отчасти потому, что они существуют как смеси реджио- и стерео-изомеров, и метод получения чистого количества enantiomers и regioisomers не требуется. Обычные средства для химического синтеза этих соединений оказались неэффективными. Использование пероксикислот, таких как мета-хлоропероксибензоиновая кислота для эпоксидации, имеет много недостатков, в частности, отсутствие селективности эпоксидации, что требует дорогостоящей и кропотливой очистки отдельных региоизомеров и энантиомеров. Тотальный синтез метаболитов ДГК и ЭПК возможен, но также страдает от недостатков, которые делают его нецелесообразным для крупномасштабного синтеза, таких как высокие затраты и низкие урожаи12,13. Эффективное общее производство может быть достигнуто с помощью ферментативного синтеза, так как ферментативные реакции режио- и стереоселекционные14. Исследования показывают, что ферментативная эпоксидация АА и EPA (с BM3) является регипоцитивным и энантиоселективным15,16,17,18, но эта процедура не была протестирована с ДГК, или на большом Масштаб. Общая цель нашего метода заключалась в расширении и оптимизации этой хемоэнсиматической эпоксидации, чтобы быстро производить значительное количество чистых эпоксидных жирных кислот в качестве их отдельных энантиомимов. Используя представленный здесь метод, исследователи имеют доступ к простой и экономичнейой стратегии синтеза ЭДП и других эпоксидных метаболитов PUFA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

Эпоксидированные метаболиты различных полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА), именуемые эпоксидными жирными кислотами, играют широкий спектр ролей в физиологии человека. Эти метаболиты производятся эндогенно цитохромом класса P450 ферментов. Из-за их разнообразных и мощных биологических эффектов, существует значительный интерес к изучению этих метаболитов. Определение уникальной роли этих метаболитов в организме является трудной задачей, так как эпоксидные жирные кислоты сначала должны быть получены в значительных количествах и с высокой чистотой. Получение соединений из природных источников часто является трудоемким, а растворимые эпоксидные гидролазы (sEH) быстро гидролизуются метаболиты. С другой стороны, получение этих метаболитов с помощью химических реакций является очень неэффективным, из-за трудностей получения чистых региоисомеров и энантиомеров, низких урожаев и обширной (и дорогостоящей) очистки. Здесь мы представляем эффективный ферментатическийсинтез 19 (S), 20 ( R)- и 16 (S), 17 (R)-эпоксидокосапентаевские кислоты (EDPs) из ДГК через эпоксидацию с BM3, бактериальный фермент CYP450, изолированный первоначально из Bacillus megaterium (что легко выражается в Escherichia coli). Характеристика и определение чистоты осуществляется с помощью ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР), высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) и масс-спектрометрии (МС). Эта процедура иллюстрирует преимущества ферментативного синтеза эпоксидных метаболитов PUFA, и применима к эпоксидации других жирных кислот, включая арахидоновая кислота (АА) и eicosapentaenoic кислоты (EPA) для производства аналогичных эпоксикозасатрино кислоты (EET) и эпоксикозатетененоии кислоты (EE), соответственно.

Хроматограмма флэш-колонки (выполненная с использованием автоматизированной системы очистки вспышки, как описано ниже), полученная при очищении сырой смеси от ферментатической эпоксидации показана на рисунке 1. После эстерификации и разделения regioisome...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Ферментативный синтез эпоксидированных метаболитов докосахексаеноа, Эйкозапентаэноии и Арахидоновых кислот

Представляем полезный для крупномасштабного ферментативного синтеза и очистки специфических энантиомеров и региоисомеров эпоксидов арахидоновой кислоты (АА), докозагексаеновой кислоты (ДГК) и эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) с использованием бактериального цитохрома Фермент P450 (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Таким образом, наш протокол позволяет нам подготовить энантиопуры эпоксидной жирных кислот, и этот метод может помочь продвинуть исследования механизмов, с помощью которых эти метаболиты действуют в организме. Исторически сложилось так, что чистые эпоксидные жирные кислоты очень трудно получить. Таким образом, наш протокол прост, быстр, рентабельн, и позволяет нам подготовить значительное количество этих метаболитов.Да, мы разработали протокол для ДГК, но он также работает очень хорошо для EPA и арахидоновой кислоты. Работа быстро, так как некоторые из реагентов чувствительны к воздуху, в частности DHA и NADPH, и не забудьте спарить все заранее, так что установка проста. Кроме того, быть в курсе опасностей.Наш протокол использует методы как в энзимологии, так и в органической химии. Визуализация имеет решающее значение для оказания помощи читателям и зрителям, которые не знакомы со специализированными методами в этих областях. Чтобы привить, используйте стерильную петлю или пипетку, смоченной в запасе глицерола pBS-BM3, трансфицированного DH5-альфа E.coli в пять миллилитров стерильного бульона LB, дополненного 0,5 миллиграммами ампициллина.Инкубировать клеточной культуры в шейкер при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов при 200 об/мин. Затем добавьте пятимиллилитровую культуру стартера и 100 миллиграммов ампициллина в один литр стерильного бульона LB в колбе Эрленмейера. Встряхните при 37 градусах по Цельсию в течение шести часов при 200 об/мин, затем при 30 градусах по Цельсию в течение 18 часов при 200 об/мин.После этого соберите культуру клеток в центрифуги трубы, и центрифуга клеточной культуры при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут при 1000 раз г. Слейте супернатант в другую колбу. Обеззараживать отбеливателем или с помощью автоклава, и хранить гранулы клетки при температуре минус 78 градусов по Цельсию до очистки ферментов.Для выполнения клеточного лиза сначала оттаивать клеточные гранулы на льду и повторно использовать 40 миллилитров ледяного буфера solubilization, содержащего Tris, PMSF и EDTA. Находясь на льду, sonicate клеток в течение одной минуты с ультразвуковым гомогенизатором, с выходной мощности настройки 10 и долг 100, а затем одну минуту перерыва на льду, с тем чтобы подонизить клетки. Повторите эту процедуру шесть раз.Центрифуга клетки лисировать при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут при 11000 раз г гранулировать клеточный мусор. Для выполнения сродства хроматографии, в холодной комнате или холодильнике с раздвижной дверью, при четырех градусах Цельсия, сначала подготовьте сильный анионный обмен хроматографической колонкой путем мытья смолы с пятью объемами колонки буфера А 10-миллимолярной трис при рН 7.8. Далее добавьте супернатант клетки лизирует к уравновешенной колонке и вымойте колонку тремя объемами столбца холодного буфера A.Then, утешайте BM3, промыв колонку шестью объемами столбца холодного буфера B 10-миллимоляонных три и 600-миллимолярского хлорида натрия.Соберите красновато-коричневую элюентную фракцию. Если белок используется не сразу, смешайте его с равным объемом глицерола и заморозьте жидкостью. Храните замороженный раствор при температуре минус 78 градусов по Цельсию.Для выполнения эпоксидации ДГК, сначала определить концентрацию оттаявого фермента BM3, в соответствии с дитионитом угарного газа спектрального метода анализа. Затем в стакан, содержащий два литра реакционной буфера, перемешиваемой на магнитной пластине перемешивания, добавьте 0,94 миллимолета ДГК, разбавленного в 18,8 миллилитров DMSO, и фермент BM3, разбавленный до 20 наномолярных. Пока раствор шевелится, начните реакцию эпоксидации, добавив 8,7 миллилитров буфера реакции, содержащего 0,94 миллимоля NADPH.Перемешать реакцию в течение 30 минут, в то время как восходящей воздуха в реакционной смеси с воздуха заполненные воздушный шар прилагается к шприцу и иглы приклеены к внутренней части стакана. После этого нарисуйте один микролитер реакционной смеси и поместите его в спектрофотометр NanoDrop для измерения поглощения на 340 нанометров. Используйте воду в качестве пробела.Если нет оставшегося поглощения, что указывает на то, что NADPH был поглощен, реакция завершена. Утолить реакционной смеси, медленно добавляя одномолярной щавелевой кислоты dropwise, пока рН раствора достигает примерно четырех. Теперь добыть затухаемый буферный раствор с двумя литрами ангидроуса, без перекиси дитил эфира.Используйте сепараторную воронку, чтобы встряхнуть и отделить слои, и собрать эфир в колбу Эрленмайера. Повторите еще два раза, и добавить около 50 граммов сульфата ангидроза магния, чтобы высушить эфир. На воронку вакуумного фильтра вылейте высушенный эфир для фильтрации сульфата магния и перенесите фильтрованный слой эфира в круглую нижнюю колбу роторного испарителя.Отрегулируйте скорость вращения до средней и запустите вакуум, чтобы сконцентрировать жидкость, чтобы дать сырой остаток EDP. Загрузите остаток в 40-граммовый кремнеземный картридж для выполнения хроматографии флэш-колонки с помощью автоматизированной машины для очистки вспышки. Начните с 10%этилового ацетата в гексанах, и нарастить до 60% этилового ацетата в гексанах в течение 22 минут.Фракции автоматически собираются в трубках. Затем объединить фракции с каждого пика в колбу круглого дна, положить на роторный испаритель, и начать испарение. Три фракции получены, DHA, EDP изомеры, и диэпоксид.Чтобы вылмить полученный 0,151 грамма эпоксида, в колбу с круглым дном или небольшой флакон, добавить два миллилитров метанола ангидроуса и три миллилитров толюола, и добавить перемешать бар. Соедините колбу с шариком, наполненным аргоном через резиновую перегородку и иглу, и добавьте 0,26 миллилитров двухмяльного TMS-диазометан через шприц, помешивая. Подождите 10 минут и добавьте еще 05 миллилитров ТМС-диазометан до тех пор, пока не появится бледно-желтый цвет.Через 30 минут, тщательно сконцентрировать смесь с помощью роторного испарителя, и использовать 40-граммовый кремнезем гель колонки картриджа на флэш хроматографии машины для очистки остатков. Элют с изократической концентрацией 4%этилового ацетата в гексанах в течение 22 минут. Соберите фракции, содержащие очищенные 19S, 20R-EDP метиловый эстер элуаты первый, а затем 16S, 17R-EDP метиловый эстер.Теперь оцените фракции по тонкослойной хроматографии в смеси шести-к-одному шестиугольник-этил-ацетат. Пятно с перманганатом калия, чтобы проверить на наличие смешанных фракций, содержащих оба изомеров. Сосредоточьте фракции, соответствующие каждому пику, на вращающемся испарительном средстве, а затем взвесь на балансе, чтобы определить количество полученных эфиров EDP.Если смешанные фракции остаются, повторно хроматограф их с той же системой растворителя, как ранее использовали. Сосредоточьте каждую фракцию, содержащую отдельный ретиоизомер, на роторном испарительном. Для преобразования отдельных EDP метилэстр regioisomers в их кислотных форм, разбавить эстер EDP в небольшой флакон с примерно 0,7 миллилитров THF на 0,1 миллимолей эстера, а также 0,175 миллилитров воды.Охладить флакон до нуля градусов по Цельсию в ледяной ванне, добавить три эквивалента раствора гидроксида лития, и перемешать на пластине перемешать под аргоном на ночь при потеплении до комнатной температуры. Утром, утолить реакцию, медленно добавляя фамическую кислоту, пока рН смеси достигает трех-четырех. Затем добавьте воду и два миллилитров этилового ацетата, чтобы отделить слои.Извлекайте слой воды с 10 миллилитров этилового ацетата три раза, промойте 20 миллилитров насыщенного раствора рассола и добавьте несколько граммов ангидроса сульфата натрия в раствор для высыхания этилового ацетата слоя. Сосредоточьте раствор этилового ацетата с помощью роторного испарителя, добавьте 10 миллилитров гексан и снова сосредоточьтесь. Повторите дважды, чтобы азеотропно удалить остаточную formic кислоты.Очистить остатки с помощью флэш-колонки хроматографии, eluting с 10 до 30% этилового ацетата в течение 15 минут. Сосредоточьте нужные фракции в роторном испарительном и высушите в вакуо, чтобы позволить себе очищенную кислоту. Здесь показана хроматограмма флеш-столба, полученная при очистке сырой смеси от энзиматической эпоксидации.Три основных пика были получены, eluting в порядке, во-первых, нереактированных ДГК, во-вторых, смесь изомеров ЭДП, и, в-третьих, диэпоксид, которые являются нормальными продуктами чрезмерного окисления. После эфирификации и разделения ретиоизомеров, протонные спектры ЯМР указывают на то, что были получены метиловые эфиры высокой чистоты 16S, 17R-EDP и 19S, 20R-EDP метиловые эфиры. Чирал HPLC подтвердил энантиометрической чистоты кислотных форм ЭАП.Будьте уверены, чтобы сохранить ваш бульон стерильным при обработке и инокуляции, чтобы избежать загрязнения. Эпоксидирование может быть использовано для других жирных кислот. Таким образом, мы также попробовали его с арахидоновой и эйкозапентаеноидных кислот, и мы получили хорошие урожаи этих энантиопуре эпоксидов, так что 14, 15-EET и 17, 18-EE.Таким образом, протокол, который позволяет исследователям получить доступ к эпоксидной жирных кислот может помочь в исследовании биологических функций этих соединений, которые могут привести к их использованию в качестве наркотиков приводит. Опасными химическими веществами являются ПМСФ, которые опасны при контакте, и ТМС-диазометан, который очень токсичен при контакте и вдыхании. Таким образом, последний должен быть использован в дым капот и с надлежащей личной защиты оборудования.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Качественная идентификация карбоновые кислоты, борной кислоты и аминов с использованием крестообразных Флуорофоры

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Синтеза и характеристики функционализированным Металл-органические каркасы

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

Синтез и реакции химии наноразмерных Monosodium титаната

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Легкий управляемый Ферментативный Декарбоксилирование

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Синтез и характеристика супрамолекулярных коллоидов

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Гидрохинон основе Синтез наностержней золота

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Химио ферментативного синтеза N- гликанов массив развития и антител ВИЧ профилирования

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Каскад ферментативных реакций синтеза аминокислот хиральных спиртов от L-лизин

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...