Name: enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Detta arbete finansieras av R00 ES024806 (nationella institut för hälsa), DMS-1761320 (National Science Foundation) och start medel från Michigan State University. Författarna vill tacka Dr jun Yang (University of California på Davis) och Lalitha Karchalla (Michigan State University) för att få hjälp med optimering av enzymatiska reaktionen, och Dr. Tony Schilmiller (MSU masspektrometri och metabolomics Facility) för hjälp med data insamling för HRMS.

Var försiktig: konsultera alla relevanta material säkerhets data blad (MSDS) innan du använder de listade kemikalierna.
1. uttryck av vildtyps BM3
<ol><li>Inokulera pBS-BM3 transfekterade DH5α E. coli (en generös donation från Dr. F. Ann Walker) i 5 ml steril lb-buljong med 0,5 mg ampicillin tillsatt i en 20 ml kultur tub.</li>
	<li>Inkubera cell kulturen i en shaker vid 37 ° c i 24 timmar vid 200 RPM. Tillsätt natten förrätt kultur (5 mL) och 100 mg ampicillin till 1 L st...

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li><li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension.">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li><li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels.">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li><li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids,+hypertension,+and+kidney+injury.">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li><li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation.">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211 (2016).</li><li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K(+)-channel+activity.">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li><li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators.">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li><li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).</li><li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease.">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li><li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters.">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li><li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins:+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-,+dihydroxy-,+and+epoxy-fatty+acids.">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food &amp; Function. 8, 2355-2367 (2017).</li><li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method for the synthesis of DHA. , (2012).</li><li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+synthesis+of+17,18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium.">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li><li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids.">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li><li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical,+enantiospecific+syntheses+of+14,15-EET+and+leukotoxin+B+(vernolic+acid).">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li><li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium.">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li><li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3.">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li><li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450.">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li><li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase.">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li><li>. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019)</li><li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+site+substitution,+F87V,+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+(14S,+15R)-arachidonic+acid+epoxygenase.">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li></ol>

Här presenterar vi en operationellt enkel och kostnads effektiv metod för beredning av de två vanligast förekommande epoximetaboliterna av DHA-19, 20 och 16, 17-EDP. Dessa epoxi fett syror kan framställas i mycket enantiopure (som deras S, R-isomerer) form med VILDTYPS BM3 enzym. Flera kritiska punkter som kan användas för fel sökning, och förlängningen av vår metod för att förbereda enantiopure epoximetaboliter av AA och EPA, beskrivs nedan.
BM3 lagring rikt linj...

Som intresse för den roll som fleromättade fett syror (särskilt Omega-3 och Omega-6 fleromättade fett syror) spelar i människans biologi har vuxit under de senaste åren har forskarna tagit notis om det stora utbudet av tilltalande fördelar som deras metaboliter Utställning. I synnerhet, epoxy fett syra metaboliter som produceras av cytokrom P450 klass av enzymer har varit en stor punkt i fokus. Till exempel, många PUFA epoxider, inklusive epoxyeicosatrienoic syror (Eets), epoxydocosapentaenoic syror (EDPs) och epoxyeicosatetraenoic syror (eeqs), spelar en avgörande roll i regleringen av blod tryck och inflammation1,2 , 3 för att , 4 för att , 5. intressant, de specifika enantiomererna och lägesisomererna av AA och EPA epoxider är kända för att ha varierande effekter på vasokonstriktion6,7. Medan de fysiologiska effekterna av enantiomererna och regioisomerer av EETs och EEQs har dokumenterats, är lite känt om effekten av den analoga epoxydocosapentaenoic syror (EDPs) bildas från DHA. Utbredd användning av fiskolja8, som är rik på både EPA och DHA, har också väckt intresse i Europeiska data tillsyns mannen9. Fördelarna med dessa tillskott tros vara delvis på grund av nedströms DHA metaboliter (16, 17-EDP och 19, 20-EDP är den vanligast förekommande) eftersom in vivo nivåer av data tillsyns mannen samordna mycket väl med mängden DHA i kosten10, med 11.
Att studera mekanismerna och målen för dessa epoxifettsyror genom metabolomik, kemisk biologi och andra metoder har visat sig vara utmanande, delvis på grund av att de existerar som blandningar av Regio-och stereo-isomerer, och en metod för att erhålla rena mängder av enantiomerer och regioisomerer krävs. Konventionella medel för kemiskt syntetisera dessa föreningar har visat sig vara ineffektiva. Användning av peroxisyror som meta-kloroperoxybensoesyra för epoxidering har många nack delar, särskilt bristen på epoxidering selektivitet, vilket nödvändiggör dyra och mödosamt rening av enskilda regioisomerer och enantiomerer. Total syntes av DHA och EPA metaboliter är möjligt, men också lider av nack delar som gör det opraktiskt för storskalig syntes såsom höga kostnader och låga avkastningar12,13. Effektiv total produktion kan åstadkommas med enzymatisk syntes, eftersom enzymatiska reaktioner är Regio-och stereoselektiva14. Studier visar att enzymatisk epoxidering av AA och EPA (med BM3) är både regioselektiv och enantioselective15,16,17,18, men detta förfarande har inte testats med DHA, eller på en stor Skala. Det övergripande målet med vår metod var att skala upp och optimera denna kemoenzymatiska epoxidering för att snabbt producera betydande mängder av rena epoxifettsyror som deras individuella enantiomerer. Med hjälp av den metod som presenteras här har forskarna till gång till en enkel och kostnads effektiv strategi för syntes av data tillsyns mannen och andra PUFA epoximetaboliter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:916px;" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">9830</td>
			<td style="width:339px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td>A30125</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">M65-3</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous methanol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">322515</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S421-500</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anhydrous toluene</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">244511</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Arachidonic Acid (AA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-71A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">296082</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">D8418</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Docosahexaenoic Acid (DHA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">U-84A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:150px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:150px;">15576028</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Eicosapentaenoic Acid (EPA)</td>
			<td style="width:150px;">Nu-Chek Prep</td>
			<td style="width:150px;">&#160;U-99A</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:150px;">34858</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">145170203, 145154064, 5170200</td>
			<td>Alternatively, conventional column chromatography can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Formic acid (HPLC Grade)</td>
			<td style="width:150px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:150px;">0128-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Hexanes</td>
			<td style="width:150px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">BDH24575</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">LB Broth</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lithium hydroxide</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">442410</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">2444-01</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Methanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:150px;">34860-41-R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NADPH Tetrasodium Salt</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">481973</td>
			<td>Air-sensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Oxalic acid</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">194131</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">pBS-BM3 transfected DH5&#945; E. coli</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td style="width:150px;">NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">P7626</td>
			<td>Toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium Permanganate</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">223468</td>
			<td>For TLC staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795496</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">795488</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)</td>
			<td style="width:150px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">17-0515-01</td>
			<td>For anion exchange purification of enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:150px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:150px;">71376</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tetrahydrofuran, anhydrous</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">186562</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)</td>
			<td style="width:150px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:150px;">362832</td>
			<td>Very toxic.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:279px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:150px;">GoldBio</td>
			<td style="width:150px;">T-400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Also necessary:</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>
			<td style="width:150px;">Agilent</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Centrifuge capable of 10,000 x g</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 &#181;M, 1000 &#197;)</td>
			<td style="width:150px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:279px;">General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector</td>
			<td style="width:150px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Nanodrop 2000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:150px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:279px;">NMR</td>
			<td style="width:150px;">NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:150px;">Buchi</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:150px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:150px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic synthesis of epoxidized metabolites of docosahexaenoic, eicosapentaenoic, and arachidonic acids

Den epoxidiserade metaboliter av olika fleromättade fett syror (PUFAs), kallas epoxi fett syror, har ett brett spektrum av roller i människans fysiologi. Dessa metaboliter produceras endogent av cytokrom P450 klass av enzymer. På grund av deras varierande och potenta biologiska effekter, det finns ett stort intresse för att studera dessa metaboliter. Att bestämma de unika rollerna för dessa metaboliter i kroppen är en svår uppgift, eftersom epoxifettsyror först måste erhållas i betydande mängder och med hög renhet. Att erhålla föreningar från naturliga källor är ofta arbets intensiva, och lösliga epoxihartser glukosidhydrolaser (Seh) hydrolysera snabbt metaboliterna. Å andra sidan, att få dessa metaboliter via kemiska reaktioner är mycket ineffektiv, på grund av svårigheten att få rena regioisomerer och enantiomerer, låg avkastning, och omfattande (och dyra) rening. Här presenterar vi en effektiv enzymatisk syntes av 19 (s), 20 (r)-och 16 (s), 17 (r)-epoxydokosapentaenoic-syror (EDPs) från DHA via EPOXIDERING med BM3, ett bakteriellt CYP450-enzym isolerat ursprungligen från Bacillus megaterium (som lätt uttrycks i Escherichia coli). Karakterisering och bestämning av renhet utförs med kärnmagnetisk resonanspektroskopi (NMR), högeffektiv vätskekromatografi (HPLC), och masspektrometri (MS). Detta förfarande illustrerar fördelarna med enzymatisk syntes av PUFA epoximetaboliter, och är tillämplig på epoxidering av andra fett syror, inklusive arakidonsyra (AA) och eikosapentaenoic syra (EPA) för att producera den analoga epoxyeicosatrienoic syror (EETs) och epoxyeicosatetraenoic syror (EEQs).

Blixt kolonnkromatogrammet (utfört med hjälp av ett automatiserat system för blixt rening enligt beskrivningen nedan) som erhålls vid rening av den råa blandningen från enzymatisk epoxidering visas i figur 1. Efter esterifiering och separation av regioisomerer erhölls rena 16 (s), 17 (r)-EDP och 19 (s), 20 (r)-EDP-metylestrar. Typiskt, de är närvarande i en ungefärlig 1:4 till 1:5 förhållande, med den största p...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids at JoVE.com

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatisk syntes av Epoxidiserade metaboliter av Dokosahexaenoic, Eikosapentaenoic och Arakidonsyror

Vi presenterar en metod som är användbar för storskalig enzymatisk syntes och rening av specifika enantiomerer och regioisomerer av epoxider av arakidonic Acid (AA), dokosahexaensyra (DHA), och eikosapentaenoic syra (EPA) med användning av en bakteriell cytokrom P450-enzymet (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Så vårt protokoll tillåter oss att förbereda enantiopure epoxi fettsyror, och denna metod kan bidra till att främja forskning om de mekanismer genom vilka dessa metaboliter verkar i kroppen. Historiskt sett är rena epoxifettsyror mycket svåra att få tag på. Så vårt protokoll är enkelt, snabbt, kostnadseffektivt, och det gör det möjligt för oss att förbereda betydande mängder av dessa metaboliter.Ja, vi utvecklade ett protokoll för DHA, men det fungerar också mycket bra för EPA och arakidonsyra. Arbeta snabbt, eftersom några av reagenserna är luftkänsliga, specifikt DHA och NADPH, och se till att para ihop allt i förväg så att installationen är enkel. Också, vara medveten om de faror.Vårt protokoll använder tekniker inom både enzymologi och organisk kemi. Visualisering är avgörande för att hjälpa läsare och tittare som inte är bekanta med de specialiserade teknikerna inom dessa områden. Att inokulera, använd en steril slinga eller pipett doppad i glycerol lager av pBS-BM3 transfekterade DH5-alpha E.coli i fem milliliter steril LB buljong kompletteras med 0,5 milligram ampicillin.Inkubera cellkulturen i en shaker vid 37 grader Celsius i 24 timmar vid 200 rpm. Tillsätt sedan fem-milliliter starter kultur och 100 milligram ampicillin till en liter steril LB buljong i en Erlenmeyer kolv. Skaka vid 37 grader Celsius i sex timmar vid 200 rpm, sedan vid 30 grader Celsius i 18 timmar vid 200 rpm.Efter det, samla cellkulturen i centrifugrör, och centrifug cellkulturen vid fyra grader Celsius i 10 minuter vid 1, 000 gånger g. Häll av supernatanten i en annan kolv. Dekontaminera med blekmedel eller använda autoklaven, och förvara cellpelletsen vid minus 78 grader Celsius tills enzymrening.För att utföra celllys, först tina cellpelletsen på is, och resuspend i 40 milliliter iskall solubilisering buffert som innehåller Tris, PMSF, och EDTA. Även på is, sonikera cellerna i en minut med en ultraljud homogenisator, med en utgående effekt inställning av 10 och tull på 100, följt av en minut paus på isen för att lysa cellerna. Upprepa den här proceduren sex gånger.Centrifugera cellen lysate vid fyra grader Celsius i 30 minuter vid 11.000 gånger g att pellet cellen skräp. För att utföra affinitetskromatografi, i ett kylrum eller kylskåp med en skjutdörr, vid fyra grader Celsius, först förbereda en stark anjon utbyte kromatografi kolumn genom att tvätta hartset med fem kolonnvolymer av buffert A av 10-millimolar Tris vid pH 7,8. Lägg därefter till supernatanten för cellens lysater till den ekvilonde kolumnen och tvätta kolonnen med tre kolonnvolymer av kallbuffert A.Därefter, elute BM3 genom att tvätta kolonnen med sex kolonnvolymer av kallbuffert B av 10-millimolar Tris och 600-millimolar natriumklorid.Samla den rödbruna eluentfraktionen. Om proteinet inte används omedelbart, blanda det med en lika stor volym av glycerol, och flash-frysa med flytande kväve. Förvara den frusna lösningen på minus 78 grader Celsius.För att utföra epoxidation av DHA, först bestämma koncentrationen av den tinade BM3 enzymet, enligt kolmonoxid dithionit spektrala assay metoden. Sedan, i en bägare som innehåller två liter reaktionsbuffert som rörs på en magnetisk rörplatta, tillsätt 0,94 millimol av DHA utspädd i 18,8 milliliter DMSO och BM3-enzymet utspädd till 20 nanomolar. Medan lösningen rör om, påbörja epoxidationsreaktionen genom att tillsätta 8,7 milliliter reaktionsbuffert innehållande 0,94 millimol nadph.Rör om reaktionen i 30 minuter medan du bubblar in luft i reaktionsblandningen med en luftfylld ballong som är fäst vid en spruta och nålen tejpad på insidan av bägaren. Efter det, dra upp en mikroliter av reaktionsblandningen, och lägg den i en NanoDrop-spektrofotometer för att mäta absorbansen vid 340 nanometer. Använd vatten som tomt.Om det inte finns någon återstående absorbans, vilket indikerar nadph har förbrukats, är reaktionen fullständig. Släck reaktionsblandningen genom att långsamt tillsätta en-molar oxalsyra droppvis, tills lösningens pH når ungefär fyra. Nu, extrahera den släckta buffertlösningen med två liter vattenfri, peroxidfri diethyleter.Använd en separatortratt för att skaka och separera lagren, och samla upp etern i en Erlenmeyerkolv. Upprepa två ytterligare gånger, och tillsätt cirka 50 gram vattenfri magnesiumsulfat för att torka eter. På en vakuumfiltertratt, häll den torkade eter för att filtrera magnesiumsulfat, och överföra det filtrerade eterskiktet till en rund-botten kolv av rotationsförångaren.Justera rotationshastigheten till medium, och starta vakuumet för att koncentrera vätskan för att ge rå EDP-rester. Ladda återstoden i en 40-grams kiselpatron för att utföra flashkolonnkromatografi med hjälp av en automatiserad blixtreningsmaskin. Börja vid 10%etylacetat i hexaner, och ramp upp till 60%etylacetat i hexaner under 22 minuter.Fraktionerna samlas automatiskt i rör. Sedan, kombinera fraktionerna från varje topp i en rund-botten kolv, sätta på rotationsförångaren, och starta avdunstning. Tre fraktioner erhålls, DHA, EDP isomerer, och diepoxide.För att esterifiera erhållna 0,151 gram epoxid, i en rund bottenkolv eller liten injektionsflaska, tillsätt två milliliter vattenfri metanol och tre milliliter vattenfri toluen och tillsätt en rörstång. Anslut kolven med en ballong fylld med argon genom en gummiskildret och en nål, och tillsätt 0,26 milliliter av två-molar TMS-diazometan genom en spruta under omrörning. Vänta 10 minuter, och lägg till ytterligare 05 milliliter TMS-diazometan tills en blekgul färg visas.Efter 30 minuter koncentrerar du försiktigt blandningen med hjälp av rotationsförångaren, och använd en 40-grams kiselgelkolonnpatron på flashkromatografimaskinen för att rena rester. Elute med en isokratisk koncentration på 4%etylacetat i hexaner under 22 minuter. Samla de fraktioner som innehåller den renade 19S, 20R-EDP metyl ester eluats först, följt av 16S, 17R-EDP metylester.Nu, bedöma fraktionerna genom tunnskiktskromatografi i en åtta-till-en hexan-till-etyl-acetat blandning. Fläck med kaliumpermanganat för att kontrollera eventuella blandade fraktioner som innehåller båda isomererna. Koncentrera de fraktioner som motsvarar varje topp på en roterande förångare, och väg sedan på en balans för att bestämma mängden EDP-estrar som erhålls.Om blandade fraktioner kvarstår, återkromatografera dem med samma lösningsmedelssystem som tidigare använts. Koncentrera varje fraktion som innehåller den enskilda regioisomern på en rotationsförångare. För att omvandla enskilda EDP-metylesterreoisomer till sina syraformer, späd EDP-estern i en liten injektionsflaska med cirka 0,7 milliliter THF per 0,1 millimoles ester, tillsammans med 0,175 milliliter vatten.Kyl injektionsflaskan till noll grader Celsius i ett isbad, tillsätt tre motsvarigheter till litiumhydroxidlösning, och rör om på en rörplatta under argon över natten medan uppvärmningen till rumstemperatur. På morgonen, släcka reaktionen genom att långsamt tillsätta myrsyra, tills pH-värdet i blandningen når tre till fyra. Tillsätt sedan vatten och två milliliter etylacetat för att separera skikten.Extrahera vattenskiktet med 10 milliliter etylacetat tre gånger, tvätta med 20 milliliter mättad saltlösning, och tillsätt flera gram vattenfritt natriumsulfat i lösningen för att torka etylacetatskiktet. Koncentrera etylacetatlösningen med hjälp av rotationsförångaren, tillsätt 10 milliliter hexaner och koncentrera dig igen. Upprepa två gånger för att azeotropically avlägsna kvarvarande myrsyra.Rena återstoden genom blixtkolumnkromatografi, elutering med 10 till 30%etylacetat över 15 minuter. Koncentrera de önskade fraktionerna i rotationsförångaren, och torka i vacuo för att ha råd med den renade syran. Blixtkolumnen kromatogram som erhålls vid rening av råblandningen från enzymatisk epoxidation visas här.Tre stora toppar erhölls, eluting i storleksordningen, första, oreagerad DHA, andra, blandning av EDP isomerer, och, tredje, diepoxide, som är normala över-oxidation produkter. Efter esterifiering och separation av regioisomerna indikerar protonen NMR spectra att högrenhet 16S, 17R-EDP och 19S, erhölls 20R-EDP-metylester. Chiral HPLC bekräftade enantiomeric renhet av de sura formerna av de europeiska europeiska styrpinnena.Var noga med att hålla din buljong steril vid hantering och inokturerande för att undvika kontaminering. Epoxideringen kan användas för andra fettsyror. Så vi försökte också det med arakidoniska och eicosapentaenoic syror, och vi fick bra avkastning av dessa enantiopure epoxides, så 14, 15-EET och 17, 18-EEQ.Så ett protokoll som tillåter forskare att få tillgång till epoxi fettsyror kan stöd i forskning om de biologiska funktionerna i dessa föreningar, vilket kan leda till deras användning som drog leder. De farliga kemikalierna är PMSF, som är farligt vid kontakt, och TMS-diazometan, som är mycket giftigt vid kontakt och inandning. Så den senare bör användas i en rök huva och med korrekt personlig skyddsutrustning.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

Seeded Syntes av CdSe / CdS Rod och tetrapod nanokristaller

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Kvalitativ Identifiering av karboxylsyror, boronsyror och aminer Använda Cruciform Fluoroforer

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntes och karakterisering av funktionaliserad metal-organic frame

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

Syntes och reaktionskemi av nanostorlek Mono Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Ljusdriven Enzymatisk Dekarboxylering

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Hydrokinon baserad syntes av guld nanostavar

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Kemo-enzymatisk syntes av N- glycans för Array utveckling och HIV-antikroppar profilering

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzymatisk Cascade reaktioner för syntesen av kirala Amino alkoholer från L-lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...