Name: rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level
Uploaded: 2019-05-19T15:00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level at JoVE.com

نود ان نشكر الدكتور يان دونغ لخلايا أورام البروستاتا DU145. نود ان نشكر الدكتور ناثان Ungerleider لتوجيهاته والمشورة في إنشاء مخطوطات الكمبيوتر الفائق. تم تمويل بعض من هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01 GM121812 إلى PD ، R01 AG057597 إلى VPB ، و 5TL1TR001418 إلى المعارف التقليدية. ونود أيضا ان نعترف بالدعم من الصليبيين السرطان ومركز Tulane للسرطان المعلوماتية الحيوية الاساسيه.

<ol>
	<li>International Human Genome Sequencing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860 (2001).</li><li>Brouha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+L1s+account+for+the+bulk+of+retrotransposition+in+the+human+population.">Hot L1s account for the bulk of retrotransposition in the human population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).</li><li>Dombroski, B. A., Mathias, S. L., Nanthakumar, E., Scott, A. F., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+active+human+transposable+element.">Isolation of an active human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1805 (1991).</li><li>Swergold, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+characterization,+and+cell+specificity+of+a+human+LINE-1+promoter.">Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (12), 6718-6729 (1990).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Deininger, L., Batzer, M. A., Hutchison, C. A., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+genes+in+mammalian+repetitive+DNA+amplification.">Master genes in mammalian repetitive DNA amplification.</a> Trends in Genetics. 8 (9), 307-311 (1992).</li><li>Boissinot, S., Chevret, P., Furano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+(LINE-1)+Retrotransposon+Evolution+and+Amplification+in+Recent+Human+History.">L1 (LINE-1) Retrotransposon Evolution and Amplification in Recent Human History.</a> Molecular Biology and Evolution. 17 (6), 915-918 (2000).</li><li>Khazina, E., Weichenrieder, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LTR+retrotransposons+encode+noncanonical+RRM+domains+in+their+first+open+reading+frame.">Non-LTR retrotransposons encode noncanonical RRM domains in their first open reading frame.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (3), 731-736 (2009).</li><li>Martin, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+chaperone+activity+of+the+ORF1+protein+from+the+mouse+LINE-1+retrotransposon.">Nucleic acid chaperone activity of the ORF1 protein from the mouse LINE-1 retrotransposon.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (2), 467-475 (2001).</li><li>Feng, Q., Moran, M. H., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+Retrotransposon+Encodes+a+Conserved+Endonuclease+Required+for+Retrotransposition.">Human L1 Retrotransposon Encodes a Conserved Endonuclease Required for Retrotransposition.</a> Cell. 87 (5), 905-916 (1996).</li><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1808 (1991).</li><li>Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+R2Bm+RNA+is+primed+by+a+nick+at+the+chromosomal+target+site:+A+mechanism+for+non-LTR+retrotransposition.">Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: A mechanism for non-LTR retrotransposition.</a> Cell. 72 (4), 595-605 (1993).</li><li>van den Hurk, J. A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+types+of+mutation+in+the+choroideremia+(CHM)+gene:+a+full-length+L1+insertion+and+an+intronic+mutation+activating+a+cryptic+exon.">Novel types of mutation in the choroideremia (CHM) gene: a full-length L1 insertion and an intronic mutation activating a cryptic exon.</a> Human Genetics. 113 (3), 268-275 (2003).</li><li>Min&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genomic+deletion+in+the+PDHX+gene+caused+by+the+retrotranspositional+insertion+of+a+full-length+LINE-1+element.">A large genomic deletion in the PDHX gene caused by the retrotranspositional insertion of a full-length LINE-1 element.</a> Human Mutation. 28 (2), 137-142 (2007).</li><li>Solyom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+orphan+transduction+created+by+a+nonreference+LINE-1+retrotransposon.">Pathogenic orphan transduction created by a nonreference LINE-1 retrotransposon.</a> Human Mutation. 33 (2), 369-371 (2012).</li><li>Hancks, D. C., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+retrotransposon+insertions+in+human+disease.+Mobile+DNA.">Roles for retrotransposon insertions in human disease. Mobile DNA.</a> Mobile DNA. 7, 9-9 (2016).</li><li>Tubio, J. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DNA+in+cancer.+Extensive+transduction+of+nonrepetitive+DNA+mediated+by+L1+retrotransposition+in+cancer+genomes.">Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes.</a> Science. 345 (6196), 1251343-1251343 (2014).</li><li>Ewing, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+somatic+L1+retrotransposition+occurs+early+during+gastrointestinal+cancer+evolution.">Widespread somatic L1 retrotransposition occurs early during gastrointestinal cancer evolution.</a> Genome Research. 25 (10), 1536-1545 (2015).</li><li>Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+elements+in+structural+variation+and+disease.">LINE-1 elements in structural variation and disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).</li><li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+individual+L1+retrotransposon+instances+is+restricted+to+cell-type+dependent+permissive+loci.">Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci.</a> eLife. 5, e13926 (2016).</li><li>Deininger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+expression+of+L1+loci.">A comprehensive approach to expression of L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 45 (5), e31-e31 (2017).</li><li>Jin, Y., Tam, O. H., Paniagua, E., Hammell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEtranscripts:+a+package+for+including+transposable+elements+in+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+datasets.">TEtranscripts: a package for including transposable elements in differential expression analysis of RNA-seq datasets.</a> Bioinformatics. 31 (22), 3593-3599 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , (2017).</li><li>Mueller, O. L., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Integrity Number (RIN) &#8211;Standardization of RNA Quality Control. , (2016).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29, 24 (2011).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97-97 (2009).</li><li>Iskow, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Mutagenesis+of+Human+Genomes+by+Endogenous+Retrotransposons.">Natural Mutagenesis of Human Genomes by Endogenous Retrotransposons.</a> Cell. 141 (7), 1253-1261 (2010).</li><li>Scott, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hot+L1+retrotransposon+evades+somatic+repression+and+initiates+human+colorectal+cancer.">A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer.</a> Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).</li><li>Kines, K. J., Sokolowski, M., deHaro, D. L., Christian, C. M., Belancio, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+genomic+instability+associated+with+retrotranspositionally-incompetent+L1+loci.">Potential for genomic instability associated with retrotranspositionally-incompetent L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 42 (16), 10488-10502 (2014).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وقد ثبت ان النشاط L1 يسبب الضرر الوراثي وعدم الاستقرار المساهمة في المرض27,28,29. من ال تقريبا 5,000 [فول-لنغث] [L1] نسخ, فقط [ا فو] اثنا عشر [رتنايشنريلي] شباب L1s حساب للاغلبيه من [ريتروريبل] نشاط2. ومع ذلك ، هناك أدله علي انه حتى بعض كبار السن ، ريتروترانسبوسيتيونالي-incompentent L1s لا تزال قادره علي إنتاج الحمض النووي الضار البروتينات30. لنقدر تماما دور L1s في عدم الاستقرار الجينوم والمرض ، يجب فهم التعبير L1 علي مستوي محدد الموضع. ومع ذلك ، فان الخلفية العالية للتسلسلات ذات الصلة بالمستوي L1 المدمجة في RNAs الأخرى غير المرتبطة بالتبديل العكسي لل l1 تشكل تحديا كبيرا في تفسير التعبير L1 الأصلي. تحدي آخر في تحديد التالي فهم أنماط التعبير من الفردية L1 مكاني يحدث بسبب طبيعتها المتكررة التي لا تسمح العديد من تسلسل قراءه قصيرة للخريطة إلى موضع فريد واحد. للتغلب علي هذه التحديات ، قمنا بتطوير النهج الموصوف أعلاه في تحديد التعبير عن الفردية L1 مكاني باستخدام البيانات المتسلسلة RNA.
نهجنا مرشحات المستوي العالي (أكثر من 99 ٪) من الضوضاء المتحولة المتولدة من متواليات L1 التي لا علاقة لها بالتبديل العكسي L1 عن طريق اتخاذ عدد من الخطوات. الخطوة الاولي تنطوي علي اعداد الحمض الخلوي الريبي السيتوبلازمي. عن طريق اختيار ل RNA سيتوبلازمي ، القراءات ذات الصلة L1 وجدت داخل التعبير عن mRNA في النواة والمنضب إلى حد كبير. في اعداد مكتبه التسلسل ، خطوه أخرى اتخذت للحد من الضوضاء التبادلية لا علاقة لها L1s تشمل اختيار النصوص polyadenylated. وهذا يزيل الضوضاء المرتبطة بالنص L1 الموجودة في الأنواع غير mRNA. وتشمل الخطوة الأخرى التسلسل الخاص بالحبل من أجل تحديد وأزاله النصوص ذات الصلة بالاستشعار من النوع L1. استخدام تعليق توضيحي لL1s كامل الطول مع مناطق المروج الوظيفية عند تحديد عدد النسخ المتسلسلة الحمض الريبي النيبالي التي الخريطة إلى L1s أيضا يلغي الضوضاء الخلفية التي تنشا خلاف ذلك من L1s المقتطعة. وأخيرا ، فان الخطوة الحاسمة الاخيره في القضاء علي الضوضاء العابرة لمتواليات L1 غير المرتبطة بالتبديل العكسي L1 هي التحويل اليدوي لL1s الكاملة الطول التي تم تحديدها لتعيين النسخ المتسلسلة لل RNA. وينطوي الاعتماد اليدوي علي تصور لكل موضع من المواقع التي تم التعرف عليها بطريقه المعلوماتية الاحيائيه في سياق بيئتها الجينية المحيطة بها لتاكيد ان التعبير ينبع من المروج L1. تم تطبيق هذا النهج علي DU145 ، وهو خط خليه ورم البروستاتا. وحتى مع جميع الخطوات المتعلقة بالاعداد المتخذة للحد من الضجيج في الخلفية ، تم رفض ما يقرب من 50 في المائة من النسبة المئوية لل L1 التي تم تحديدها بيولوجيا في DU145 باعتبارها ضوضاء خلفيه L1 منشؤها مصادر أخرى للتحويل (الشكل 4) ، التاكيد علي الصرامة المطلوبة لتحقيق نتائج موثوق بها. هذا النهج باستخدام التشغيل اليدوي هو العمل المكثف ، ولكن الضرورية في تطوير هذا الخط لتقييم وفهم البيئة الجينية المحيطة L1 كامل الطول. وتشمل الخطوات التالية الحد من كميه العمليات اليدوية اللازمة من خلال أتمته بعض قواعد الكرايشن ، علي الرغم من نظرا لطبيعة لا تزال غير معروفه تماما من التعبير الجينوم ، ومصادر الأمم المتحدة المشروحة للتعبير في الجينوم المرجعي ، ومناطق منخفضه mappability ، وحتى تعقيد العوامل التي تنطوي عليها مع بناء الجينوم المرجعي فانه لا يكون من الممكن أتمته L1 بالبالكامل في هذا الوقت.
التحدي الثاني في تحديد التعبير عن الفردية l1 مكاني مع التسلسل يتعلق برسم الخرائط من المستنسخات l1 المتكررة. في هذه الاستراتيجية المحاذاة ، فانه من المطلوب ان النص يجب ان تتوافق بشكل فريد والتعاون خطيا إلى الجينوم المرجعي من أجل ان يتم تعيينها. من خلال تحديد التسلسلات المقترنة التي يتم تعيينها بشكل متطابق ، فان مقدار النصوص التي يتم محاذاتها بصوره فريدة إلى L1 مكاني الموجود في الجينوم المرجعي يزيد. وتوفر هذه الاستراتيجية الفريدة لرسم الخرائط الثقة في استدعاء الخرائط المقروءة تحديدا إلى موضع واحد من النوع L1 ، علي الرغم من انه من المحتمل ان يقلل من تقدير كميه التعبير التي تم التعرف عليها بشكل أصلي ومعبر عنها ، والمكررة ، L1. إلى صحيحه تقريبا ل هذا بخس, طورت "[مسبيليتي]" درجه لكل [1] موضع يؤسس علي [مسبيليتي] ه كان وطبقت إلى الرقم من فريد يعين نص يقرا (شكل 6). ومن الجدير بالذكر انه من الناحية المثالية ، يجب ان يكون سجل القدرة علي التغطية الكاملة يقرا عبر L1 كامل الطول وفقا لعينه WGS المتطابقة. هنا ، ونحن نستخدم wgs من الخلايا هيلا لتحديد عشرات mappability من كل l1 مكاني من أجل تضخيم أو انكماش يقرا تعيين إلى l1 مكاني في DU145 خطوط الخلايا السرطانية البروستاتا. هذا الحساب mappability هو درجه تصحيح الخام ، ولكن تم تحديد المختارة ' التغطية الكاملة mappability ' من 400 يقرا مع الطبيعة الديناميكية لخطوط الخلايا السرطانية في الاعتبار. ويمكن ملاحظه ذلك في الشكل التكميلي 1، ان هناك عدد قليل من المواقع L1 مع Wgs هيلا مع ارتفاع كبير للغاية من القراءات المعينة. هذه من المرجح ان تاتي من متواليات الكروموسومات المكررة داخل هيلا التي ليست ضمن الجينوم المرجعي ، وهذا هو السبب في تلك المواقع لم يتم اختيارها لتكون ممثله للتغطية كامله القدرة. بدلا من ذلك حددت هو كان ان المعدل من 100% يقرا تغطيه يحدث حول 400 يقرا وفقا ل اضافيه شكل 1 وكان بعد ذلك افترضت ان هذا معدل يطبق إلى ال DU145 ورم بروستاتا خليه خط أيضا.
هذه الاستراتيجية المحاذاة مع 100-200 bp يقرا من تكنولوجيا RNA-Seq أيضا يختار بشكل تفضيلي لL1s القديمة التطورية داخل الجينوم المرجعي كما تراكمت L1s القديمة علي مر الزمن طفرات فريدة من نوعها التي تجعلها أكثر قابل للتعيين. هذا النهج ، التالي ، لديه حساسية محدوده عندما يتعلق الأمر بتحديد أصغر من L1s ، فضلا عن عدم المرجعية ، L1s متعدد الوجوه. لتحديد أصغر من L1s ، نقترح استخدام 5 ' سباق الاختيار من النصوص L1 والتكنولوجيا التسلسل مثل PacBio التي تجعل استخدام أطول يقرا21. هذا يسمح رسم خرائط أكثر فريدة من نوعها ، التالي التعرف علي ثقة من L1s الشباب المعرب عنها. استخدام الحمض الريبي النيبالي-Seq ونهج PacBio معا يمكن ان يؤدي إلى قائمه أكثر شمولا من التعبير عنها بشكل أصلي L1s. ولتحديد الL1s متعددة الوجوه المعرب عنها أصليا ، تشمل الخطوات التالية الاولي بناء وادراج متواليات متعددة الوجوه في الجينوم المرجعي.
التحديات البيولوجية والتقنية في دراسة تكرار متواليات كبيره ، علي الرغم من الإجراءات الصارمة المذكورة أعلاه لأزاله الضوضاء التبادلية من تسلسل L1 الأمم المتحدة المتعلقة باعاده التحديث باستخدام تكنولوجيا التسلسل RNA ، نبدا في التدقيق من خلال المستويات الكبيرة للضوضاء الخلفية المتحولة والتعرف بثقة وصرامة علي أنماط التعبير L1 وكميتها علي مستوي الموضع الفردي.

ريتروترانسسونز هي عناصر الحمض النووي المتكررة التي يمكن "القفز" في الجينوم في اليه النسخ واللصق عبر وسيطه RNA. ومن المعروف مجموعه فرعيه واحده من الرجعية العناصر الطويلة تتخللها-1 (خطوط/L1s) ويشكل سدس الجينوم البشري مع أكثر من 500, 0000 نسخ1. علي الرغم من وفره, معظم هذه النسخ هي معيبه واقتطاعها مع ما يقدر فقط 80-120 العناصر L1 يعتقد ان تكون نشطه2. A L1 كامل طول حوالي 6 كيلو بايت في الطول مع 5 ' و 3 ' المناطق غير المترجمة, المروج الداخلية والمرتبطة المضادة للشعور المروج, اثنين غير متداخلة إطارات القراءة المفتوحة (orfs), واشاره والذيل polya3,4,5 . في البشر ، تتكون L1s من الأسر الفرعية التي تتميز بالعمر التطوري مع الأسر الأكبر سنا التي تراكمت طفرات تسلسل أكثر تفردا مع مرور الوقت مقارنه مع أصغر عائله فرعيه ، L1HS6،7. L1s هي الوحيدة المستقلة ، والرجعية البشرية و ORFs ترميز النسخ العكسي ، والكريات ، و RNPs مع الجيش النيبالي للربط والانشطه المرافقة المطلوبة لتغيير المسار وادراجها في الجينوم في عمليه المشار اليها باسم الهدف-تستعد عكس النسخ8،9،10،11،12.
وقد أفيد بان التبديل التحديثي لL1s يسبب امراض الإنسان الجرثومية البشرية من خلال مجموعه متنوعة من أليات بما في ذلك الطفرات الذهنية ، وحذف المواقع المستهدفة ، وأعاده الترتيب13و14و15و 16. في الاونه الاخيره تم الافتراض ان L1s قد تلعب دورا في اونكوجينيسيس و/أو تطور الورم كما لوحظ زيادة التعبير واحداث الادراج من هذا العنصر الطفرات في مجموعه متنوعة من السرطانات الظهاريه17,18 . ويقدر ان هناك واحده جديده L1 الادراج في كل 200 الولادات19. ولذلك ، فمن المحتم ان نفهم بشكل أفضل بيولوجيا التعبير عن L1s بنشاط. وقد جعلت الطبيعة المتكررة ووفره النسخ المعيبة الموجودة ضمن نصوص الجينات الأخرى هذا المستوي من التحليل تحديا.
لحسن الحظ ، مع ظهور تقنيات التسلسل الانتاجيه العالية ، تم اجراء خطوات واسعه لتحليل وتحديد التعبير الأصلي L1s علي مستوي محدد الموضع. هناك الفلسفات المختلفة حول كيفيه تحديد أفضل التعبير عن L1s باستخدام RNA الجيل التالي التسلسل. ولم يقترح سوي نهجين معقولين لرسم خرائط المحاضر الحرفية L1 علي المستوي الخاص بالمقر. واحده يركز فقط علي النسخ محتمله ان يقرا من خلال ال [1] [بولدتيلايشن] اشاره وداخل [فلكينغ] تسلسل20. نهجنا يستفيد من الاختلافات تسلسل الصغيرة بين العناصر L1 والخرائط فقط تلك التي الحمض الريبي النيبالي-Seq يقرا ان خريطة فريدة من نوعها لأحد الموضع21. كل من هذه الطرق لديها قيود من حيث كميات من مستويات النص. يمكن تحسين كميات من المحتمل من خلال أضافه تصحيح ل ' mappability فريدة ' من كل الموضع L121، أو استخدام خوارزميات أكثر تعقيدا ان أعاده توزيع القراءات متعددة الخرائط التي لا يمكن تعيينها بشكل فريد إلى موضع معين22. هنا ، سنقوم بالتفصيل في خطوه بخطوه طريقه استخراج RNA والجيل التالي من التسلسل وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحديد العناصر التي تم التعبير عنها L1 علي مستوي محدد الموضع. نهجنا ياخذ الاستفادة القصوى من معرفتنا بيولوجيا العناصر الوظيفية L1. وهذا يشمل معرفه ان العناصر الوظيفية L1 يجب ان تتولد من المروج L1 ، التي بدات في بداية العنصر L1 ، يجب ان تترجم في السيتوبلاسما وان النسخ الخاصة بهم يجب ان تكون مشتركه الخطي مع الجينوم. لفتره وجيزة ، ونحن نجمع الطازجة ، الحمض الريبي الخلوي الجديد ، حدد للنصوص polyadenylated ، والاستفادة من التحليلات الخاصة حبلا الحمض الريبي النيبالي-Seq لخريطة فريد يقرا إلى L1 مكاني في الجينوم المرجعي البشري. يقرا هذا يحاذي بعد ذلك بعد بعد موسعه يدوية [كرايشن] ان يحدد ان نص يقرا ينشا من ال [L1] مروج قبل يعين موضع كاصليه عبر عن [L1]. نحن نطبق هذا النهج علي DU145 عينه خط خليه ورم البروستاتا لتوضيح كيف انه يحدد عدد قليل نسبيا من الأعضاء المستنسخين بنشاط من كتله النسخ غير النشطة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bedtools.26.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/installation.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bowtie-0.12.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/0.12.8/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>BBI-8541906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV 2.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mac2unix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/cs-cmdtools/files/mac2unix/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse later solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>samtools-1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/samtools/files/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sratoolkit.2.9.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level

عناصر طويلة تتخللها-1 (خطوط/L1s) هي العناصر المتكررة التي يمكن نسخ وادراج عشوائيا في الجينوم مما ادي إلى عدم الاستقرار الجينوم والطفرات. فهم أنماط التعبير من L1 مكاني علي المستوي الفردي وسوف تقرض لفهم بيولوجيا هذا العنصر الطفرة. هذا العنصر المستقل يشكل جزءا كبيرا من الجينوم البشري مع أكثر من 500,000 نسخه ، علي الرغم من ان 99 ٪ يتم اقتطاعها ومعيبه. ومع ذلك ، فان وفره النسخ المعيبة وعددها المهيمن يجعل من الصعب تحديد الL1s المعرب عنها بشكل أصلي من المتواليات ذات الصلة بالرقم L1 المعبر عنها كجزء من جينات أخرى. ومن الصعب أيضا تحديد الموضع L1 المحدد الذي يعبر عنه بسبب الطبيعة المتكررة للعناصر. التغلب علي هذه التحديات ، نقدم نهج المعلوماتية البيولوجية المتسلسلة لتحديد التعبير L1 عند مستوي معين. وباختصار ، ونحن نجمع الحمض الريبي الخلوي rna ، حدد للنصوص polyadenylated ، والاستفادة من التحليلات الخاصة حبلا الحمض الريبي النيبالي-Seq لخريطة فريد يقرا إلى L1 مكاني في الجينوم المرجعي البشري. نحن الاشراف بصريا كل موضع L1 مع يقرا المعينة بشكل فريد لتاكيد النسخ من المروج الخاصة بها وضبط النص المعين يقرا لحساب القدرة علي كل موضع L1 الفردية. تم تطبيق هذا النهج علي خط خليه ورم البروستاتا ، DU145 ، لإثبات قدره هذا البروتوكول للكشف عن التعبير من عدد صغير من العناصر L1 بالطول الكامل.

تم تطبيق الخطوات الموضحة أعلاه والموصوفة بيانيا في الشكل 1 علي خط خليه ورم البروستاتا البشرية DU145. عينت ال [رنا] عينه كان [سيتوبلاسميكالي] وكان [أين-جن] متسلسلة في [بولي-ا] ينتقي, [ستراند-ول], يقترن-نهاية بروتوكول. وباستخدام Bowtie ، تمت محاذاة ملفات التسلسل المزدوج التي تسمح بالمطابقة الفريدة التي تتطابق فيها القراءة المزدوجة مع الموقع الجيني بالمقارنة مع اي موقع جيني آخر. تم محاذاة ملفات تسلسل DU145 إلى الجينوم المرجعي البشري إنشاء ملف bam ، الذي يتوفر عند طلب الكاتب. باستخدام أدوات السرير ، تم استخراج البيانات من ملفات bam المفصولة DU145 علي عدد القراءات التي تم تعيينها إلى الطول الكامل L1s. وتم فرز تلك القراءات في جدول بيانات من الأكبر إلى الأصغر وبتنسيق يدوي من خلال فحص البيئة الجينية حول كل موضع من المحور L1 في IGV لتاكيد صحتها (الجدول التكميلي 1). إذا تم تنسيق العينة ليتم التعبير عنها بشكل أصلي ، فقد تم تلوينها باللون الأخضر مع شرح لقبولها في العمود الأيمن. وترد في الشكل 2الف-باءأمثله علي المبادئ التوجيهية L1 التي قبلت ان يتم التعبير عنها بشكل أصلي بعد الإرشادات الموصوفة في قسم الأساليب. إذا تم رفض عينه ليتم التعبير عنها بشكل أصلي ، فانه تم تلوينها باللون الأحمر مع سبب الرفض علي اليمين معظم العمود. وترد بالتفصيل في الشكل 2جيم-هاء أمثله علي المواقع التي رفضتها المادة L1 بسبب التعبير عن مروج آخر غير المبادئ التوجيهية التالية الوارد وصفها في قسم الأساليب.
هنا ، تمت دراسة L1s كامله الطول فقط مع منطقه مروج سليمه. إذا لم يتم اجراء هذا التمييز ، يتم إدخال مصدر كبير من الضوضاء التي تنشا من الL1s المقتطعة. وترد أمثله لL1s المقتطعة في DU145 في الشكل 3الف-باء حيث تم تحديدها علي انها تتضمن القراءات المتسلسلة الخاصة ب RNA التي تم تعيينها بصوره فريدة. في IGV ، ومع ذلك ، فمن الواضح ان هذه النصوص لم تبدا من L1 المقتطعة ، ولكن من ادراج تسلسل L1 في الجينات أو المصب من الجينات المعرب عنها.
عموما في DU145 ، والنسبة المئوية لكامل طول l1 مكاني ويقرا التي تم رفضها كما أعرب أصلي L1s بعد الكرايشن اليدوي هو تقريبا 50 ٪ (الجدول التكميلي 2) مما يدل علي مستوي عال من النص الذي تم تعيينه l1 يقرا التي من شانها ان والا يتم تسجيلها علي انها إيجابيات كاذبه دون الcuration اليدوي. علي وجه التحديد ، في DU145 كانت هناك 114 إجمالي الطول الكامل لل L1 مكاني ان يكون المعين يقرا بشكل فريد في اتجاه الشعور مع ما مجموعه 3,152 يقرا ، ولكن كان هناك فقط 60 مكاني المحددة ليتم التعبير عنها من المروج الخاصة بهم بعد الكرايشن اليدوي مع 1,879 يقرا ( الجدول التكميلي 1). وهذا هو الحال حتى عندما اتخذت خطوات للحد من التعبير لا علاقة لها البيولوجيا L1 عن طريق اختيار mRNA سيتوبلازمي. لاحظ انه تم رفض الموضع مع اعلي مستوي من النصوص المعينة في DU145 لأنه لم يكن التعبير الأصلي L1 (الشكل 4). وبشكل عام ، فان عدد النصوص المعينة إلى نطاقات L1 المحددة يتراوح بين المقبولة والمرفوضة من النوع L1 علي النحو المعرب عنه بعد التجعيد اليدوي (الشكل 4).
بعد الcuration اليدوي ، وعدد من يقرا ان خريطة فريدة من نوعها بشكل أصلي وأعرب محدده L1 مكاني في DU145 نطاق من 175 يقرا إلى الحد الأدنى المختار تعسفا قطع من 10 يقرا (الشكل 5). هذا النهج لتحديد النص الذي تم تعيينه بشكل فريد يقرا إلى L1s يحد من القدرة علي قياس التعبير بدقه. لحساب هذا الأمر ، تم إنشاء عامل تصحيح لكل موضع استنادا إلى قابليه التشغيل الخاصة به. لإنشاء عامل التصحيح هذا ، تم استخدام أدوات السرير الاولي لاستخراج عدد القراءات المعينة بشكل فريد من ملف الجينوم الجيني في هيلا الذي تمت محاذاته لكل الطول الكامل ل L1 مكاني و بياني تلك مكاني من اعلي إلى ادني نص معين يقرا (تكميلي الشكل 1). عينت هو كان تعسفا ان L1s مع 400 يقرا تلقي يشبع تغطيه [اببيليتي]. تم تحجيم عدد القراءات القادرة علي الخريطة إلى موضع L1 في نموذج التسلسل الجيني هيلا بالنسبة إلى 400 قراءه وانه تم ضرب العدد الذي تم تحجيمه إلى عدد القراءات التي تم تعيينها إلى كل التعبيرات الاصليه l1 مكاني في DU145 (الجدول التكميلي 2) . وكما هو متوقع ، جاءت العناصر L1 التي كانت لها درجات تصحيح أكبر لقابليه النفاذ من الأسر الفرعية الأصغر سنا مثل L1PA2 (الجدول التكميلي 2). وبمجرد تعديل القراءات لدرجات القدرة علي التحمل في كل موضع ، زادت كميه التعبير بالنسبة لمعظم المواضع (الشكل 6). وتراوح عدد القراءات التي تم تعيينها بشكل فريد إلى التعبير الأصلي المحدد L1 مكاني مع تصحيحات mappability في DU145 من 612 إلى 4 يقرا وكان هناك أعاده ترتيب من اعلي إلى ادني التعبير عن مكاني (الشكل 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig01v2.jpg"> الشكل 1: تخطيط سير العمل. وصفت بيانيا الخطوات ان يعين L1s يعبر في عينه انسانيه. لاحظ ان الخطوتين 1 و 2 لا تحتاج إلى تكرار إذا كانت الملفات المناسبة متوفرة بالفعل. قد يتم تحميل هذه الملفات المناسبة من ملف الملحق 1a-b وملحق ملف 2. تشير المربعات باللون الأحمر إلى الخطوات التي يستخدم فيها برنامج تغطيه أدوات السرير لحساب عدد القراءات التي يتم تعيينها إلى L1s في نفس اتجاه الإحساس. هذه مكاني مع رسم الخرائط المنحى المعني يقرا هي L1s التي ينبغي ان يتم تنسيقها يدويا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig02v2.jpg"> الشكل 2: أمثله من المواقع التي تم تنسيقها في DU145. تحميلها في IGV هي الجينوم المرجعي ، ملف التعليق التوضيحي الكامل الطول L1 gff مطابقه الإصدار الجينوم المرجعي (ملف الملحق 1) ، وملف DU145 bam ، وأخيرا الجينوم هيلا بأم ملف لتقييم القدرة ، والتي هي كل ما هو متاح علي المؤلف طلب. وقد أضيفت أسهم للمساعدة في التصور من اتجاه L1 المشروح. وتوجه السهام ويقرا باللون الأحمر في تسلسل من اليمين إلى اليسار. وتوجه السهام ويقرا باللون الأزرق في تسلسل من اليسار إلى اليمين. ا) في igv ، يظهر هذا الموضع L1 ليتم التعبير عنه من المروج الخاصة به كما ان هناك لا يقرا المنبع من L1 في اتجاه الشعور لأكثر من 5 كيلوبايت. هذا L1 لديه قدره منخفضه ، فانه ليس في الجينات ، ولديه أدله علي النشاط المتوقع المروج انتيسنس26. ب) في igv ، يبدو هذا الموضع L1 ان يعبر عن المروج الخاصة به كما انه لا توجد قراءه المنبع l1 في اتجاه الشعور لأكثر من 5 كيلوبايت. هذا L1 لديه قدره منخفضه وهو داخل جين من الاتجاه المعاكس. ج) في igv ، تم رفض هذا الموضع l1 باعتباره l1 المعرب عنها كما ان هناك يقرا المنبع في نفس الاتجاه في غضون 5 كيلوبايت. هذا L1 داخل مورثه من ال نفسه اتجاه لذلك النص يقرا يكون علي الأرجح أتيت من المروج من ال يعبر مورثه. d) في igv ، تم رفض هذا الموضع l1 كما المعلنة l1 كما ان هناك يقرا المنبع في نفس الاتجاه في غضون 5 كيلوبايت. هذا L1 هو المصب من الجينات التي أعرب عنها بشده في نفس الاتجاه التالي فان النص يقرا هي علي الأرجح الناشئة من المروج لذلك الجين المعرب عنها وتمتد إلى ما بعد الجينات الطبيعية المنهي. ه) في igv ، تم رفض هذا الموضع l1 كما التعبير عن l1 كما ان هناك يقرا المنبع في نفس الاتجاه في غضون 5 كيلوبايت. هذا L1 ليست داخل أو بالقرب من الجينات المشروحة في الجينات المرجعية التالي فان أصل هذه النصوص داخل والمنبع من عنصر L1 توحي الأمم المتحدة-المشروح المروج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig03v2.jpg"> الشكل 3: ينشا ضجيج الخلفية من L1s المقتطعة أيضا. لا يتضمن التعليق التوضيحي L1 L1s المقتطعة لأنها مصدر رئيسي للضوضاء في الخلفية. وقد أضيفت أسهم للمساعدة في التصور من اتجاه L1 المشروح. وتوجه السهام ويقرا باللون الأزرق في تسلسل من اليسار إلى اليمين. ا) الموضح هو مثال علي L1 المقتطعة في L1MB5 sufamily الذي هو 2706 bps. في [ايغف] هو واضحة ان اليقرا يتكون من امتداد مجري النهر من مورثه يعبر. ب) المعروض هو مثال آخر علي L1 المقتطعة. هذا L1 هو L1PA11 الذي هو 4767 bps طويلة. في [ايغف] هو واضحة ان ال يقرا تعيين بشكل فريد إلى ال [L1] يتكون من ال عبر عن [اكسن], اي ال [L1] ضمنت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig04v2.jpg"> الشكل 4: يقرا النص تلك الخريطة بشكل فريد لكل الطول الكامل لL1s السليمة في الجينوم البشري المعرب عنه في DU145 خط خلايا أورام البروستاتا. باللون الأسود هي المواقع المحددة التي يمكن التعرف عليها بشكل أصلي بعد التجعيد اليدوي اللون الأحمر هي المواقع المحددة التي سيتم رفضها كما تم التعبير عنها بشكل أصلي بعد القيام بعمليه التجعيد اليدوي. في الرمادي هي مكاني مع اقل من عشره يقرا تعيين لكل منهما. وحيث ان هذه المواقع تمثل جزءا صغيرا من النص يقرا ، لم يتم الاشراف عليها يدويا. علامات القراد x-محور دلاله علي كل 100 كامله الطول ، L1s سليمه. تقريبا 4,500 لا يتم عرضها بشكل رسومي كما كان لديهم صفر القراءة المعينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig05v2.jpg"> الشكل 5: يقرا النص ان الخريطة فريدة من نوعها ليعبر عن كامل طول سليمه L1s في DU145 البروستاتا خط الخلية الورم. تظهر أرقام النص يقرا تلك الخريطة إلى مكاني محدده في خلايا DU145 بعد التجعيد اليدوي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig06v2.jpg"> الشكل 6: يقرا الرسم البياني ليتم التعبير عنه بشكل أصلي عند تعديله بواسطة القابلية للتعديل. تظهر أرقام القراءة النصية التي تم تعديلها بواسطة درجات mappability الخاصة بالمواقع المحددة التي تم تعيينها ليتم تنسيقها يدويا في L1 مكاني في خلايا DU145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1: شروح لL1s البشرية الكاملة الطول والسليمة وفقا للتوجيه. (ا) FL-L1-BLAST_RM_minus. ب) FL-L1-BLAST_RM_plus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile1.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: مخطوطات الحاسوب الفائق المستخدمة لاتمته خط أنابيب المعلوماتية الحيوية المفصل في القسم 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile_2.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي 1: عينه الجينات الجينية المستخدمة لتحديد قابليه الاستخدام L1. يظهر عدد من النصوص الجينية يقرا من نموذج خط الخلية هيلا ان الخريطة فريدة من نوعها لجميع 5,000 الطول الكامل L1 مكاني في الجينوم. تم تعيين ان L1 لديه التغطية الكاملة mappability عندما 400 يقرا الخريطة إلى L1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFigure_1.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
الجدول التكميلي 1: العملية اليدوية لL1s في DU145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول 2 التكميلي: الL1s المنسق في DU145 مع تعديل قابليه الاستخدام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level at JoVE.com

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

الجيش النيبالي الجديد الجيل التالي التسلسل وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحديد خط التعبير-1s في مستوي محدد الموضع

هنا ، نقدم نهج المعلوماتية الحيوية وتحليلات لتحديد خط-1 التعبير علي مستوي معين.

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

العناصر المتنقلة هي أحد المصادر الرئيسية لعدم الاستقرار الوراثي البشري. فهم التعبير في الأنسجة والظروف المختلفة أمر بالغ الأهمية لفهم تأثيرها على الجينوم. إن النصوص الواسعة من L1 هي نتيجة لتضمين سلبي للتسلسلات ذات الصلة L1 في النصوص الأخرى التي ليس لها دور في دورة حياة L1.نهجنا يلغي هذه الخلفية غير ذات الصلة. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع دراسات أي عنصر متنقل، أو حتى الفيروسات في أي تسلسل الجينوم. يجب أن يكون هناك على الأقل بعض الاختلاف في التسلسل للسماح بالتمييز بين loci.إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية في توضيح الصرامة والرعاية المطلوبة لتحديد العناصر المتكررة التي تم التعبير عنها بدقة L1 على المستوى المحدد للوُوَس. ابدأ هذا الإجراء باستخراج الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي وتسلسل الجيل التالي كما هو موضح في بروتوكول النص. عن طريق اختيار للRNA cytoplasmic، L1 ذات الصلة يقرأ وجدت داخل الميرنا intronic أعرب في النواة نضبت بشكل كبير.في إعداد مكتبة التسلسل خطوة أخرى اتخذت للحد من الضوضاء النسخية لا علاقة لها L1s يتضمن اختيار النصوص polyadenylated. وهذا يزيل الضوضاء نسخة L1 ذات الصلة وجدت في الأنواع غير مرنا. تشغيل نموذج محاذاة تسلسل الملفات FASTQ مع عينة RNA seq من الفائدة باستخدام bowtie1 بكتابة سطر الأوامر في محطة لينكس.وتتطلب استراتيجية المحاذاة هذه أن تكون النصوص متوافقة بشكل فريد وتداخلي مع بحث مُجمومي شامل. توفر هذه الاستراتيجية الثقة في استدعاء رسم الخرائط القراءة على وجه التحديد إلى مكان L1 واحد. Strand فصل إخراج ملفات BAM باستخدام أوامر SAMtools و Linux لتحديد حبلا العلوي و حبلا أسفل.لاحظ أن قيم العلامة الفعلية قد تختلف إذا كان أحد لا يستخدم بروتوكولات تسلسل الجيل التالي القياسية. تعمل خطوة الفصل هذه على تصفية الضوضاء النسخية التي تم إنشاؤها داخل تسلسلات L1 التي لا علاقة لها بالتبرت L1 عن طريق القضاء على القراءات المعينة المحتملة المتعلقة بـ L1 antisense. إنشاء عدد القراءة مقابل التعليقات التوضيحية لL1 loci باستخدام أدوات السرير.أولاً اكتب سطر الأوامر لإنشاء عدد القراءة لـ L1s في اتجاه الإحساس على حبل العلوي ثم اكتب سطر الأوامر لإنشاء عدد القراءة لـ L1s في اتجاه الإحساس على حبل القاع. تشير التعليقات التوضيحية المستخدمة لتحديد L1s إلى الطول الكامل L1 مع مناطق المروج الوظيفية التي تعمل على إزالة الضوضاء الخلفية التي تنشأ بخلاف ذلك من L1s مبتورة.نسخ على عدد القراءة التي تم إنشاؤها عدد الملفات النصية التي تم إنشاؤها من أجل حبلا أسفل وتسمية الصفحة minus_bottom. فرز كافة الأعمدة استناداً إلى أعلى إلى أقل عدد من القراءات العثور على في العمود J.Copy على ملف نصي عدد القراءات التي تم إنشاؤها من أجل خيط العلوي. فرز كافة الأعمدة استناداً إلى أعلى إلى أقل عدد من القراءات العثور في العمود J.And تسمية الصفحة top_plus.إنشاء صفحة ثالثة تسمى كما دمج وإضافة كافة loci مع 10 أو أكثر من القراءات من minus_bottom وصفحات plus_top. فرز جميع الأعمدة على أساس أعلى إلى أدنى عدد من القراءات الموجودة في العمود J.To تساعد على تعيين المناطق الجينومية، وتحديدا في L1 أو بالقرب loci، تم تحميل الجينوم بأكمله الاقتران وتسلسل الملفات من الأنواع ذات الأهمية من NCBI وتحويلها إلى ملفات FASTQ كما هو موضح في بروتوكول النص. الآن ، فهرسة ملفات BAM لجعلها قابلة للعرض في عارض الجينوم التكاملي ، مختصر IGV ، قبل تحميل الملفات.في تحميل IGV الجينوم المرجعي من الفائدة لتصور الجينات المشروحة. أيضا تحميل ملف التعليقات التوضيحية لكامل طول L1 العناصر لتصور التعليق L1، وملف BAM للتعبير RNA الإنسان، لتصور النصوص المعينة من عينة من الفائدة وملف BAM لإمكانية تعيين الجينوم البشري لتقييم قابلية تعيين المناطق الجينومية. إزالة تغطية وتقاطع الصفوف المرتبطة بكل ملف BAM.ضغط ملفات BAM للتعبير RNA الإنسان وحتمية تعيين الجينوم البشري بحيث تناسب جميع المسارات IGV على شاشة واحدة. الخطوة الحاسمة الأخيرة في القضاء على الضوضاء النسخية لتسلسلات L1 لا علاقة لها بـ L1 إعادة التحول الرجعية هي الإنشاء اليدوي لـ L1s كاملة الطول التي تم تحديدها على أنها قد رسمت خرائط لـ RNA للحصول على نسخ من النصوص. يتضمن المعالجة اليدوية تصور كل مكان L1 يعبر عنه في سياق بيئته الجينية المحيطة لتأكيد أن التعبير ينبع من المروج L1.باستخدام إحداثيات من L1 loci المدرجة في صفحة جدول البيانات مجتمعة، تنظيم يدويا كل مكان L1 مع نسخ معينة بشكل فريد من خلال دراسة البيئة الجينوم المحيطة بها في IGV. قم بـتهيّئ مكان للإعراب عنه بشكل أصلي إذا لم يكن هناك قراءات في اتجاه L1 يصل إلى خمسة كيلوباسس. تسمية الصف الأخضر في اللون وملاحظة لماذا هو L1 أعرب عن أصيلة. يوجد استثناء لهذه القاعدة إذا كانت المنطقة upstream من L1 غير قابل للتعيّن.إذا كانت هذه هي الحالة، فصنف الصف باللون الأحمر ولاحظ أنه لا يمكن تقييم التعبير عن المنطقة في المنبع لمروج L1 وبالتالي لا يمكن تحديد تعبير L1 بثقة. الخوري مكان لا يمكن التعبير عنها بشكل أصيل قبالة المروج الخاصة بها إذا كان هناك قراءات المنبع تصل إلى خمسة كيلوباسيس. تسمية الصف الأحمر في اللون وملاحظة لماذا هو ليس L1 أعرب عن أصيلة. ارعى مكانًا كـي كاذب إذا تم التعبير عنه داخل intron من جين مُعبّر عنه في نفس الاتجاه ، مع قراءة المنبع لـ L1 ، إذا كان مصبًا لجين مُعبَّر عنه في نفس الاتجاه مع قراءة المنبع لـ L1 ، أو لأنماط التعبير غير المشروحة مع القراءات المنبع لـ L1. يتم تطبيق استثناء لهذه القاعدة عند وجود الحد الأدنى من القراءات المتداخلة مباشرة موقع بدء المروج L1، ولكن قليلاً upstream من L1. إذا لم يكن هناك أي قراءة أخرى من المنبع من حالة L1 مثل هذا، النظر في هذا L1 أن يتم التعبير عنها بشكل أصلي.تسمية الصف الأخضر وملاحظة لماذا هو L1 أعرب عن أصيلة. قم بـإصلاح مكان L1 كما هو المحتمل أن يكون زائفاً إذا لم يرتبط نمط القراءة المعينة إلى موضع الاستخدام بمناطق L1 المعينة الخاصة بالقابلية لإمكانية تعيينها. إذا كان L1 هو قابل للتمّين بشكل كبير، ولكن لديه فقط كومة من القراءات في منطقة مكثفة داخل L1، فمن غير المحتمل أن تكون مرتبطة بتعبير L1 قبالة المروج الخاص به ومن المرجح أن تكون من مصادر غير مشروحة مثل exons أو LTRs. في مثل هذه الحالات، تنظيم loci كما البرتقالي وملاحظة لماذا هو موضع مشبوه.تحقق من مصادر التراكمات المشبوهة عن طريق التحقق من موقع L1 في متصفح الجينوم UCSC. 1- يحرس موضعاً لا يمكن التعبير عنه بشكل حقيقي إذا كان داخل بيئة جينومية في مناطق غير مشروحة بشكل متقطع. يمكن التعبير عن القراءة 10 كيلو بيس أعلى المصب من L1. ولكن كل 10 كيلوباسس أو نحو ذلك ، هناك قراءات معينة وبعض تلك القراءات تتماشى مع L1. ومن المرجح أن تكون هذه L1s قد تم تعيينها بسبب أنماط غير مشروحة للتعبير الجينومي.في مثل هذه الحالات، تنظيم loci كما الحمراء وملاحظة لماذا هو موضع مشبوه. للمساعدة في تعيين كل L1 loci تحديد عدد من قراءات معين بشكل فريد L1 loci باستخدام برنامج bedtools، والتعليق FL-L1 والبيانات تسلسل الجينوم الانحياز. تعيين مكان L1 للحصول على قابلية تعيين التغطية الكاملة عند محاذاة 400 قراءة فريدة إليه.تحديد العامل المطلوب لتوسيع نطاق أو خفض الحمض النووي الجينومي الانحياز يقرأ إلى 400 لكل L1 الفردية. للحصول على مقياس تحجيم للتعبير وفقا لL1 الفردية تعيين موضع، مضاعفة العامل بعدد من رنا نص يقرأ التي محاذاة إلى L1s الفردية أعرب عن أصيلة. يتم استخدام كل خطوة لتسليط الضوء على الاختلافات بين عناصر L1 التي تم التعبير عنها من المروج الخاصة بهم، وجميع الطرق التي يمكن تضمينها عناصر L1 في النصوص الأخرى التي لا علاقة لها بدورة حياة L1. يظهر هنا هي نص يقرأ أن خريطة فريدة من نوعها لجميع طول كامل L1s سليمة في الجينوم البشري أعرب عنها في خط خلية ورم البروستاتا DU145.في الأسود هي loci محددة كما أعرب عن أصيلة بعد المعالجة اليدوية. وفي الأحمر هي loci محددة رفض كما يقرأ المعبر عنها بشكل أصيل بعد المعالجة اليدوية. في الرمادي هي loci مع أقل من 10 يقرأ التعيين إلى كل.وبما أن هذه الوُرَب تمثل جزءاً صغيراً من قراءة النص، فإنها لم تكن منسقة يدوياً. تقريبا 4500 loci لا تظهر رسوميا، كما كان لديهم صفر القراءات المعينة. بعد المعالجة اليدوية، عدد القراءات التي خريطة فريد إلى أصيلة أعرب L1 loci محددة في DU145 تتراوح بين 175 يقرأ إلى الحد الأدنى المختار بشكل تعسفي من 10 يقرأ.مرة واحدة تم ضبط القراءة لدرجات قابلية تعيين في كل موضع، زيادة كمية للتعبير عن معظم loci. عدد القراءات التي تم تعيينها بشكل فريد إلى L1 loci محددة مع تصحيحات قابلية التخطيط في DU145 تراوحت بين 612 إلى أربعة عمليات قراءة وكان هناك إعادة ترتيب من أعلى إلى أدنى loci التعبير. تلعب كل خطوة دورًا حاسمًا في تقليل المستوى العالي للضوضاء في الخلفية النسخية.ومع ذلك ، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي المعالجة اليدوية لكل مكان L1 لتأكيد نسخها من المروج الخاص بها. تم رفض ما يقرب من 50٪ من L1 loci التي تم تحديدها بيولوجيًا في خلايا DU145 كضوضاء خلفية L1 مصدرها مصادر نسخ أخرى ، مما يؤكد على الصرامة المطلوبة لتحقيق نتائج موثوقة. لتحديد أصغر من L1s، نقترح استخدام اختيار سباق خمسة رئيس من النصوص L1 وتسلسل التكنولوجيا مثل PacBio التي تستفيد من قراءات أطول ويسمح خرائط أكثر فريدة من نوعها.مع هذا النهج، يمكننا تحديد بدقة وثقة وتحديد أنماط التعبير L1. وهذا يمهد الطريق نحو فهم أفضل لتنظيم L1 الفردية loci والأثر المحتمل.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA Repair and Recombination

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

استكشاف مساحة التسلسل لتحديد مواقع الربط للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التنظيمية

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بدقه وكفاءه الناسخ ميكرورنا في النباتات

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...