Name: rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level
Uploaded: 2019-05-19T15:00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות לד ר יאן דונג. על תאי גידול הערמונית DU145 ברצוני להודות לד ר נתן אונגרלדר על הדרכתו ועצתו ביצירת סקריפטים של מחשב-על. חלק מהעבודה הזאת ממומנת על ידי NIH מענקים R01 GM121812 למשטרה, R01 AG057597 ל VPB, ו 5TL1TR001418 ל-TK. היינו גם רוצים להכיר את התמיכה של הצלבנים הסרטן ומרכז הסרטן Tulane בביואינפורמטיקה הליבה.

<ol>
	<li>International Human Genome Sequencing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860 (2001).</li><li>Brouha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+L1s+account+for+the+bulk+of+retrotransposition+in+the+human+population.">Hot L1s account for the bulk of retrotransposition in the human population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).</li><li>Dombroski, B. A., Mathias, S. L., Nanthakumar, E., Scott, A. F., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+active+human+transposable+element.">Isolation of an active human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1805 (1991).</li><li>Swergold, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+characterization,+and+cell+specificity+of+a+human+LINE-1+promoter.">Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (12), 6718-6729 (1990).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Deininger, L., Batzer, M. A., Hutchison, C. A., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+genes+in+mammalian+repetitive+DNA+amplification.">Master genes in mammalian repetitive DNA amplification.</a> Trends in Genetics. 8 (9), 307-311 (1992).</li><li>Boissinot, S., Chevret, P., Furano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+(LINE-1)+Retrotransposon+Evolution+and+Amplification+in+Recent+Human+History.">L1 (LINE-1) Retrotransposon Evolution and Amplification in Recent Human History.</a> Molecular Biology and Evolution. 17 (6), 915-918 (2000).</li><li>Khazina, E., Weichenrieder, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LTR+retrotransposons+encode+noncanonical+RRM+domains+in+their+first+open+reading+frame.">Non-LTR retrotransposons encode noncanonical RRM domains in their first open reading frame.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (3), 731-736 (2009).</li><li>Martin, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+chaperone+activity+of+the+ORF1+protein+from+the+mouse+LINE-1+retrotransposon.">Nucleic acid chaperone activity of the ORF1 protein from the mouse LINE-1 retrotransposon.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (2), 467-475 (2001).</li><li>Feng, Q., Moran, M. H., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+Retrotransposon+Encodes+a+Conserved+Endonuclease+Required+for+Retrotransposition.">Human L1 Retrotransposon Encodes a Conserved Endonuclease Required for Retrotransposition.</a> Cell. 87 (5), 905-916 (1996).</li><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1808 (1991).</li><li>Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+R2Bm+RNA+is+primed+by+a+nick+at+the+chromosomal+target+site:+A+mechanism+for+non-LTR+retrotransposition.">Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: A mechanism for non-LTR retrotransposition.</a> Cell. 72 (4), 595-605 (1993).</li><li>van den Hurk, J. A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+types+of+mutation+in+the+choroideremia+(CHM)+gene:+a+full-length+L1+insertion+and+an+intronic+mutation+activating+a+cryptic+exon.">Novel types of mutation in the choroideremia (CHM) gene: a full-length L1 insertion and an intronic mutation activating a cryptic exon.</a> Human Genetics. 113 (3), 268-275 (2003).</li><li>Min&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genomic+deletion+in+the+PDHX+gene+caused+by+the+retrotranspositional+insertion+of+a+full-length+LINE-1+element.">A large genomic deletion in the PDHX gene caused by the retrotranspositional insertion of a full-length LINE-1 element.</a> Human Mutation. 28 (2), 137-142 (2007).</li><li>Solyom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+orphan+transduction+created+by+a+nonreference+LINE-1+retrotransposon.">Pathogenic orphan transduction created by a nonreference LINE-1 retrotransposon.</a> Human Mutation. 33 (2), 369-371 (2012).</li><li>Hancks, D. C., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+retrotransposon+insertions+in+human+disease.+Mobile+DNA.">Roles for retrotransposon insertions in human disease. Mobile DNA.</a> Mobile DNA. 7, 9-9 (2016).</li><li>Tubio, J. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DNA+in+cancer.+Extensive+transduction+of+nonrepetitive+DNA+mediated+by+L1+retrotransposition+in+cancer+genomes.">Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes.</a> Science. 345 (6196), 1251343-1251343 (2014).</li><li>Ewing, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+somatic+L1+retrotransposition+occurs+early+during+gastrointestinal+cancer+evolution.">Widespread somatic L1 retrotransposition occurs early during gastrointestinal cancer evolution.</a> Genome Research. 25 (10), 1536-1545 (2015).</li><li>Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+elements+in+structural+variation+and+disease.">LINE-1 elements in structural variation and disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).</li><li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+individual+L1+retrotransposon+instances+is+restricted+to+cell-type+dependent+permissive+loci.">Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci.</a> eLife. 5, e13926 (2016).</li><li>Deininger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+expression+of+L1+loci.">A comprehensive approach to expression of L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 45 (5), e31-e31 (2017).</li><li>Jin, Y., Tam, O. H., Paniagua, E., Hammell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEtranscripts:+a+package+for+including+transposable+elements+in+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+datasets.">TEtranscripts: a package for including transposable elements in differential expression analysis of RNA-seq datasets.</a> Bioinformatics. 31 (22), 3593-3599 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , (2017).</li><li>Mueller, O. L., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Integrity Number (RIN) &#8211;Standardization of RNA Quality Control. , (2016).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29, 24 (2011).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97-97 (2009).</li><li>Iskow, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Mutagenesis+of+Human+Genomes+by+Endogenous+Retrotransposons.">Natural Mutagenesis of Human Genomes by Endogenous Retrotransposons.</a> Cell. 141 (7), 1253-1261 (2010).</li><li>Scott, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hot+L1+retrotransposon+evades+somatic+repression+and+initiates+human+colorectal+cancer.">A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer.</a> Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).</li><li>Kines, K. J., Sokolowski, M., deHaro, D. L., Christian, C. M., Belancio, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+genomic+instability+associated+with+retrotranspositionally-incompetent+L1+loci.">Potential for genomic instability associated with retrotranspositionally-incompetent L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 42 (16), 10488-10502 (2014).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

L1 פעילות הוכח לגרום נזק גנטי ואי-יציבות לתרום מחלה27,28,29. מתוך כ 5,000 העתקים באורך מלא L1, רק כמה עשרות בעלות מלאה של הL1s בעלות החשבון הצעיר ביותר עבור הרוב של פעילות הרטרוטרנספוזיציה2. עם זאת, יש ראיות כי אפילו כמה מבוגרים יותר, L1s incompentent מבחינה מבצעית עדיין מסוגלים לייצר DNA נזק חלבונים30. כדי להעריך במלואו את התפקיד של L1s ב אי-יציבות ומחלות גנומית, הביטוי L1 ברמה הספציפית לוקוס חייב להיות מובן. עם זאת, הרקע הגבוה של רצפים הקשורים L1 שולבו RNAs אחרים שאינם קשורים L1 retro, מהווה אתגר משמעותי לפרש ביטוי L1 אותנטי. אתגר נוסף בזיהוי ולכן הבנת דפוסי הביטוי של הL1 האדם מתרחשת בגלל הטבע החוזר שלהם שאינו מאפשר רצפי קריאה קצרים רבים למפות למקום יחיד ייחודי. כדי להתגבר על האתגרים הללו, פיתחנו את הגישה הנ ל בזיהוי ביטוי של הL1 הפרט באמצעות נתוני RNA-Seq.
הגישה שלנו מסננת את הרמה הגבוהה (מעל 99%) של רעש שנוצר מרצפי L1 שאינם קשורים L1 רטרומיציה על ידי נקיטת מספר צעדים. הצעד הראשון כרוך הכנת RNA cytoplasmic. על ידי בחירת RNA cytoplasmic, L1 הקשורות קריאות שנמצאו בתוך מבוטא mRNA ב הגרעין הם התרוקנו באופן משמעותי. בהכנות לעריכת הספריה, צעד נוסף שנלקח להפחתת הרעש הL1s ביותר שאינו קשור לכלל המבחר של התעתיקים הרב. פעולה זו מסירה רעשי תעתיק הקשורים ל-L1 שנמצאו במינים שאינם מסוג mRNA. צעד נוסף כולל רצף מיוחד של סטרנד על מנת לזהות ולחסל את התעתיקים L1-sense הקשורות. השימוש בביאור עבור L1s באורך מלא עם אזורי מיזם פונקציונלי בעת זיהוי מספר התעתיקים של RNA-Seq המיפוי לL1s גם מבטל את רעשי הרקע שמקורם מL1s מעוגלים. בסופו של דבר, הצעד הקריטי האחרון ביטול רעש ההמרה של L1 רצפים שאינם קשורים L1 retroation היא התוספת ידנית של L1s באורך מלא מזוהה יש ממופה RNA-Seq התעתיקים. התוספת הידנית כרוכה ויזואליזציה של כל מזוהה ביולוגי להיות מבוטא L1 לוקוס בהקשר של הסביבה גנומית שמסביב שלה כדי לאשר את הביטוי מקורו מיזם L1. גישה זו הוחלה על DU145, קו של גידול של הערמונית. אפילו עם כל השלבים הקשורים להכנה כדי להפחית את רעש הרקע, כ 50% של הL1 מזוהה ביולוגית ב DU145 נדחו כרעש רקע L1 שמקורם ממקורות מעבר אחרים (איור 4), המדגיש את הקשיחות הדרושה להפקת תוצאות אמינות. גישה זו באמצעות כפייה ידנית היא עבודה אינטנסיבית, אבל הכרחי בפיתוח של צינור זה להעריך ולהבין את הסביבה גנומית סביב באורך מלא L1. השלבים הבאים כוללים הפחתת כמות התוספת הידנית הנדרשת על-ידי הפיכת חלק מכללי הקורציה, למרות שבגלל הטבע הידוע עדיין לחלוטין של ביטוי גנומית, מקורות ביטוי בלתי ממוארים של הביטוי בגנום הייחוס, אזורים נמוכים mappability, ואפילו מסבך גורמים מעורב בבניית הגנום התייחסות זה לא ניתן להפוך באופן מלא L1 אוצרות בשלב זה.
האתגר השני בזיהוי ביטוי של הL1 הפרט עם רצף מתייחס למיפוי התעתיקים החוזרים L1. באסטרטגיית יישור זו, נדרש כי תעתיק חייב להתיישר באופן ייחודי ושיתוף ליניארי לגנום הייחוס כדי שניתן יהיה למפות אותו. על ידי בחירה עבור רצפי לזווג סוף המפה concordantly, את כמות התעתיקים ליישר באופן ייחודי L1 לוקום נמצא בתוך הגנום התייחסות גדל. אסטרטגיית מיפוי ייחודית זו מספקת ביטחון בקריאה של קריאות מיפוי במיוחד לL1 לוקוס יחיד, למרות שהיא עשויה להיות בעלת מראה מסוים של כמות הביטוי של כל אחד שמזוהה להיות מבוטא, חוזר על עצמו L1. כדי לתקן את ההערכה הזאת, ציון "mappability" עבור כל L1 לוקוס מבוסס על mappability שלה פותחה והוחל על מספר התמליל ממופה באופן ייחודי (איור 6). זה לציין כי באופן אידיאלי, mappability צריך להיות הבקיע כיסוי מלא קורא באורך מלא L1 על פי דגימת WGS תואם. כאן, אנו משתמשים ב-WGS של תאי הלה כדי לקבוע עשרות mappability של כל L1 המקום על מנת לנפח או השטפה קורא מיפוי כדי L1 המקום בתוך DU145 תאים סרטניים הערמונית. חישוב mappability זה הוא ציון תיקון גולמי, אבל הנבחר ' הכיסוי השלם mappability ' של 400 קורא נקבע עם האופי הדינאמי של קווי הגידול במוח. ניתן לצפות באיור המשלים 1, כי יש כמה L1 המקום עם הלה wgs עם מספר גבוה מאוד של קריאות ממופה. אלה כנראה מגיעים רצפים כרומוזום משוכפל בתוך הלה כי הם לא בתוך הגנום התייחסות, ולכן אלה המלא נבחרו להיות נציג של כיסוי השלם mappability. במקום זאת נקבע כי הממוצע של 100% כיסוי לקרוא מתרחשת סביב 400 קורא על פי איור משלים 1 ולאחר מכן הניחו כי ממוצע זה חל על קו הערמונית DU145 גידול גם.
זו אסטרטגיה יישור עם 100-200 bp קורא מטכנולוגיית RNA-Seq גם מעדיפים בוחר עבור המבוגר מבוגר L1s בתוך הגנום התייחסות כמו מבוגרים L1s צברו לאורך מוטציות ייחודיות זמן הופכים אותם מיותר למיפוי. גישה זו, לכן, יש רגישות מוגבלת כשמדובר בזיהוי הצעיר של L1s, כמו גם אי התייחסות, פולימלמכולה L1s. כדי לזהות את הצעיר של L1s, אנו מציעים באמצעות 5 ' מירוץ מבחר של התעתיקים L1 וטכנולוגיה רצף כמו PacBio כי לעשות שימוש של קורא עוד21. זה מאפשר מיפוי ייחודי יותר ולכן זיהוי בטוח של ביטא, צעיר L1s. באמצעות RNA-Seq ו PacBio גישות יחד יכול להוביל לרשימה מקיפה יותר של ביטוי אותנטי L1s. כדי לזהות L1s מתבטאת באופן אותנטי, השלבים הבאים הראשונים כוללים בנייה והחדרת רצפים פוליממומכולה לתוך הגנום התייחסות.
האתגרים הביולוגיים והטכניים בלימוד רצפים חוזרים הם גדולים, אף עם ההליך הקפדני לעיל כדי להסיר רעש הטרנססקריפט של רצפי L1 בלתי קשורים לרטרוטרנספוזיציה באמצעות הטכנולוגיה ברצף RNA, אנו מתחילים לנפות הרמות הגדולות של רעש הרקע הטרנדיות ולהיות בביטחון ולזהות בL1 דפוסי ביטוי וכמות ברמת לוקוס בודדים.

Retrotransposons הם רכיבי DNA חוזרים שיכולים "לקפוץ" בגנום במנגנון העתק והדבק באמצעות RNA intermediates. קבוצת משנה אחת של הרטרוטרנספסונים ידועה כאלמנטים ארוכים ומודפסים -1 (קווים/L1s) ומייצרת שישית של הגנום האנושי עם מעל 500, 0000 עותקים1. למרות השפע שלהם, רוב העותקים האלה פגומים מעוגלים עם רק 80-120 מוערך אלמנטים L1 חשב להיות פעיל2. באורך מלא L1 הוא כ 6 kb באורך עם 5 ' ו 3 ' אזורים לא מתורגם, מיזם פנימי ומקדם ההיגיון המשויך, שתי מסגרות הקריאה הפתוחה שאינם חופפים (orfs), ואות ו polya זנב3,4,5 . בבני אדם, L1s מורכבת ממשפחות משנה המושוות על-ידי הגיל האבולוציוני עם המשפחות הבוגרות שצברו מוטציות רצף ייחודיות יותר לאורך זמן בהשוואה למשפחת המשנה הצעירה ביותר, L1HS6,7. L1s הם האוטונומי היחיד, הגוף האנושי ושלהם ORFs לקודד היפוך ההמרה הפוכה, endonuclease, ו RNPs עם RNA-binding ופעילויות המלווה הנדרש כדי להחליף ולהכניס את הגנום בתהליך המכונה כיעד-מוכן . תעתיק הפוך8,9,10,11,12
Retroטרנספוזיציה של L1s נמסר לגרום למחלות של מחלת האדם באמצעות מגוון מנגנונים, כולל insertional מוטגנזה, מחיקות באתר היעד וסידור מחדש של13,14,15, 16. לאחרונה זה כבר שיערו כי L1s עשוי לשחק תפקיד באונגנזה ו/או התקדמות הגידול כמו ביטוי מוגבר ואירועי הכניסה של אלמנט זה מוטאנמית נצפו במגוון של סרטן אפיתל17,18 . מעריכים כי יש אחד חדש L1 הכניסה בכל 200 לידות19. לכן, זה הכרחי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הבעת ביטוי פעיל L1s. הטבע החוזר והשפע של עותקים פגומים שנמצאו בתוך תעתיקים של גנים אחרים הפכו רמה זו של ניתוח מאתגרת.
למרבה המזל, עם הופעתו של טכנולוגיות ברצף תפוקה גבוהה, צעדים נעשו כדי לנתח ולזהות ביטוי אותנטי L1s ברמה ספציפית לוקוס. ישנן פילוסופיות שונות על איך לזהות באופן הטוב ביותר הביע L1s באמצעות רצף הדור הבא של RNA. היו רק שתי גישות סבירות הציע מיפוי L1 תעתיקים ברמה ספציפית לוקוס. אחד מתמקד רק בתעתיק הפוטנציאלי הקורא דרך האות L1 פולאדלציה ולתוך רצפים מאגפים20. הגישה שלנו מנצלת הבדלים רצף קטן בין אלמנטים L1 וממפה רק אלה RNA-Seq קורא כי ממפה באופן ייחודי למיקום אחד21. שתי השיטות הללו מתיישנות במונחים של כימות התעתיק. ניתן לשפר את הקוונטות באמצעות הוספת תיקון עבור ' היכולת הייחודית ' של כל L1 לוקוס21, או שימוש באלגוריתמים מורכבים יותר המספיקים מראש את הקריאות הממופות מרובות שלא היתה אפשרות למפות באופן ייחודי למיקום מסוים22. כאן, אנו פרטים באופן צעד אחר צעד את החילוץ RNA ו-הדור הבא רצף וביואינפורמטיקה פרוטוקול כדי לזהות אלמנטים L1 מבוטא ברמה ספציפית לוקוס. הגישה שלנו לוקחת את היתרון המקסימלי של הידע שלנו על הביולוגיה של אלמנטים L1 פונקציונליים. זה כולל לדעת כי אלמנטים L1 פונקציונלי חייב להיווצר מיזם L1, יזם בתחילת האלמנט L1, חייב להיות מתורגם בציטופלסמה וכי התעתיקים שלהם צריך להיות co-ליניארי עם הגנום. בקצרה, אנו אוספים טריים, RNA cytoplasmic, בחר עבור תעתיקים polyadenylated, ולנצל סטרנד ספציפי RNA-Seq מנתח המפה באופן ייחודי קורא L1 לוקואו בגנום התייחסות אנושית. לאחר מכן, קריאות מיושרות אלה דורשות שימוש נרחב בקריאה ידנית כדי לקבוע אם התעתיק מקורו במקדם L1 לפני הגדרת מקום כL1 מתבטא באופן אותנטי. אנו להחיל את הגישה הזאת על DU145 של סרטן הערמונית מדגם קו כדי להדגים כיצד הוא מזהה מספר יחסי בפועל באופן פעיל L1 חברים מן המסה של עותקים לא פעילים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bedtools.26.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/installation.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bowtie-0.12.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/0.12.8/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>BBI-8541906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV 2.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mac2unix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/cs-cmdtools/files/mac2unix/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse later solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>samtools-1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/samtools/files/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sratoolkit.2.9.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level

רכיבים ארוכים וממוזגים-1 (קווים/L1s) הם רכיבים חוזרים שיכולים להעתיק ולהוסיף באקראי את הגנום וכתוצאה מכך אי-יציבות גנומית ומוטזיס. הבנת דפוסי הביטוי של L1 הבית ברמה האינדיבידואלית תלווה להבנת הביולוגיה של אלמנט מוטאלי זה. אלמנט אוטונומי זה מייצר חלק משמעותי של הגנום האנושי עם מעל 500,000 עותקים, אם כי 99% הם מעוגלים ופגומים. עם זאת, שלהם שפע מספר דומיננטי של עותקים פגומים להפוך אותו מאתגר לזהות אותנטי הביע L1s מתוך L1 הקשורות רצפים הביע במסגרת גנים אחרים. הוא גם מאתגר לזהות איזה מקום L1 ספציפי מתבטא בשל האופי החוזר של היסודות. התגברות על אתגרים אלה, אנו מציגים גישה ביולוגית RNA-Seq כדי לזהות ביטוי L1 ברמה ספציפית לוקוס. לסיכום, אנו לאסוף את ה-RNA cytoplasmic, בחר עבור התעתיקים הפוליפוניים, ולנצל את הצורך בניתוח RNA-Seq ספציפי המפה באופן ייחודי קורא L1 החוף בגנום התייחסות אנושית. אנו מעוצבים באופן חזותי כל L1 לוקוס עם קריאות ממופות ייחודי כדי לאשר תמלול מיזם משלו ולהתאים את התמליל ממופה קריאות לחשבון עבור mappability של כל אחד L1 לוקוס. גישה זו חלה על קו הגידול של הערמונית, DU145, כדי להדגים את היכולת של פרוטוקול זה כדי לזהות ביטוי ממספר קטן של אלמנטים L1 באורך מלא.

השלבים המתוארים לעיל ותוארו באופן גרפי באיור 1 הוחלו על קו הגידול של הערמונית האנושי DU145. דוגמת ה-RNA הייתה cytoplasmically וכנה והייתה הרצף הבאה של הדור השני ב-פולי-A שנבחרו, מיוחד לשיוך, פרוטוקול משויך. באמצעות Bowtie, הקבצים ברצפי הרצף המשויכים מיושרים ומאפשרים התאמות ייחודיות בלבד שבו הקריאה המוקשרת מתאימה טוב יותר למיקום גנומי אחד לעומת כל מיקום גנומי אחר. קבצי רצף DU145 היו מיושרים לגנום התייחסות אנושית יצירת קובץ bam, אשר זמין על פי בקשת המחבר. באמצעות כלי המיטה, הנתונים חולצו מקבצי bam DU145 strand מופרדים במספר הקריאות שמופו לאורך מלא L1s. קריאות אלה היו ממוינות בגיליון אלקטרוני מהגדולים ביותר ובאופן ידני האצרה על ידי בחינת הסביבה גנומית סביב כל L1 לוקוס ב-IGV כדי לאשר את אמיתותה (טבלה משלימה 1). אם הדגימה הייתה מתבטאת בצורה נכונה, היא היתה ירוקה מקודדת בצבעים עם הסבר על הקבלה בטור הימני ביותר. דוגמאות לL1 היכן שניתן לבטא בצורה מקובלת בהתאם להנחיות המתוארות בסעיף השיטות מוצגות באיור 2א-ב. אם מדגם נדחה לביטוי אותנטי, הוא היה מקודד בצבע כאדום עם הסיבה לדחייה בעמודה הימנית ביותר. דוגמאות לL1 שנדחו עקב ביטוי מיזם אחר מלבד הקווים המנחים הבאים, המתוארים בסעיף השיטות, מפורטים באיור 2c-e.
כאן, רק L1s באורך מלא עם אזור מיזם שלם נחקרו. אם הבחנה זו אינה מעשית, מקור גדול של רעש הטרנססקריפט שמקורם L1s נחתך הוא הציג. דוגמאות של L1s שנחתכו ב-DU145 מוצגות באיור 3a-b שם הם זוהו כבעל ממופה באופן ייחודי RNA-Seq קורא. ב IGV, לעומת זאת, ברור כי התעתיקים האלה לא יזמו L1 החתוכים, אלא מהכללה של הרצף L1 בגן או במורד מן הגן מבוטא.
בסך הכל ב DU145, את האחוז של באורך מלא L1 הקורה והקריאות כי הם נדחו כאותנטי הביע L1s לאחר היווצרות ידני הוא כ 50% (טבלה משלימה 2) הוכחת את הרמה הגבוהה של התמליל L1 ממופה קורא כי היה אחרת יירשמו כתוצאות חיוביות שגויות ללא החזקה ידנית. באופן ספציפי, ב DU145 היו 114 הכולל באורך מלא L1 הקורה יש ממופה באופן ייחודי קריאות בכיוון ההיגיון עם סך של 3,152 קורא, אבל היו רק 60 המקום זיהה להיות ביטא את היזם שלהם לאחר אוצרות ידני עם 1,879 קורא ( טבלה משלימה 1). זה המקרה גם כאשר צעדים נלקחו כדי להפחית את הביטוי לא רלוונטי L1 ביולוגיה על ידי בחירה עבור cytoplasmic mRNA. שימו לב כי המיקום ברמה הגבוהה ביותר של התעתיקים הממופים ב-DU145 נדחה משום שהוא לא היה מבוטא בצורה מעשית L1 (איור 4). באופן כללי, מספר התעתיקים הממופים לL1 המקום הספציפי, בדומה למקום הL1 המקובל והנדחה, כביטוי אותנטי לאחר היווצרות ידני (איור 4).
לאחר הפללה ידנית, מספר הקריאות כי המפה באופן ייחודי הביע הL1 הספציפי מסוים בטווח DU145 מ 175 קורא לגזור מינימלי שנבחר באופן שרירותי מתוך 10 קריאות (איור 5). גישה זו של זיהוי תעתיק ממופה באופן ייחודי קוראת ל-L1s מגבילה את היכולת לכמת במדויק את הביטוי. כדי להסביר את זה, גורם תיקון עבור כל מקום מבוסס על היכולת שלו נוצר. כדי ליצור את פקטור התיקון, נעשה שימוש בכלי המיטה הראשונים כדי לחלץ את מספר הקריאות שמופו באופן ייחודי מהקובץ "חלה גנומית" של הקובץ שמיושר לכל הL1 המלא ולכתוב בגרף את המקום הגבוה ביותר לקריאות התמליל הממופות הנמוכות ביותר (משלים איור 1). זה היה מצוין באופן שרירותי כי L1s עם 400 קורא יש מלוא כיסוי הכיסוי. מספר הקריאות הניתן למפות לL1 מקום בדגימת הרצף הגנומית של חלה השתנה באופן יחסי ל-400 ומספר שינוי קנה הגודל הוכפל למספר הקריאות שמופו לכל הL1 מיויית הביטוי האותנטי ב DU145 (טבלה משלימה 2) . כצפוי, האלמנטים L1 שהיו תוצאות תיקון גדול יותר עבור mappability הגיע ממשפחות משנה הצעיר כמו L1PA2 (טבלה משלימה 2). ברגע שהקריאות הותאמו לניקוד מוגבר בכל מקום, הקוונטות לביטוי לרוב ההאוקום גדלה (איור 6). מספר הקריאות שמופו באופן ייחודי לביטוי אותנטי הביע L1 המקום הספציפי עם תיקוני mappability ב-DU145 נע בין 612 ל-4 קריאות והיה הזמנה מחדש של הגבוהה ביותר לביטוי הנמוך ביותר (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig01v2.jpg"> איור 1: תרשים של זרימת עבודה. מתוארים באופן גרפי הם הצעדים לזיהוי ביטוי L1s במדגם אנושי. שים לב שהשלבים 1 ו-2 אינם צריכים לחזור אם הקבצים המתאימים כבר זמינים. ניתן להוריד קבצים מתאימים אלה מתוסף קובץ 1a-b ומוסף קובץ 2. התיבות באדום מציינות את השלבים שבהם תוכנית הכיסוי של כלי המיטה משמשת לספירת מספר הקריאות ל-L1s בכיוון זהה. אלה לוקוזה עם מיפוי מונחה חושים קורא הם L1s כי צריך להיות האצור באופן ידני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig02v2.jpg"> איור 2: דוגמאות לL1 הומה בDU145. נטען לתוך igv הם הגנום התייחסות, באורך מלא L1 פעילותה ביאור קובץ התאמת גירסת הגנום התייחסות (תוספת קובץ 1), את הקובץ DU145 bam, ולבסוף את הקובץ חלה גנומית להעריך mappability, אשר כולם זמינים על המחבר קשה. חיצים נוספו כדי לסייע בהדמיה של כיוון של L1 מסומן. חיצים וקריאות באדום מכוונים ברצף מימין לשמאל. חיצים וקריאות בכחול מכוונים ברצף משמאל לימין. a) ב Igv, L1 לוקוס זה נראה להיות מבוטא מיזם משלו כפי שאין קריאות במעלה הזרם של L1 בכיוון תחושה עבור מעל 5 kb. L1 זה יש mappability נמוך, זה לא בגנים, ויש לו ראיות של פעילות מיזם מניעת החושים הצפויה26. ב) ב igv, L1 לוקוס זה נראה להיות מבוטא מיזם משלו, כפי שאין קריאות המעלה המעלה L1 בכיוון תחושה עבור מעל 5 kb. L1 זו יש מחסור נמוך והוא בתוך גן של כיוון הפוך. ג) בשנת igv, L1 לוקוס זה נדחה כL1 ביטוי כפי שיש במעלה המעלה קורא בכיוון זהה בתוך 5 kb. L1 זו היא בתוך גן של אותו כיוון, כך שהתעתיק מגיע ככל הנראה מהמקדם של הגן המבוטא. d) ב-Igv, L1 לוקוס זה נדחה כL1 ביטוי כפי שיש במעלה המעלה קורא בכיוון זהה בתוך 5 kb. L1 זה הוא במורד של גן מבוטא מאוד באותו כיוון כך התמליל קורא הם כנראה שמקורם היזם של זה הביע גן והארכת מעבר המחסל הגן הרגיל. e) ב-igv, L1 לוקוס זה נדחה כL1 מבוטא כפי שיש במעלה הזרם בכיוון זהה בתוך 5 kb. L1 זה לא בתוך או ליד גן מסומן בגן התייחסות כך המקור של התעתיקים האלה בתוך הזרם של האלמנט L1 מציע מקדם בלתי מסומן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig03v2.jpg"> איור 3: רעש הרקע מקורו גם L1s חתוכים. הביאור שלנו L1 אינו כולל L1s חתוכים כפי שהם מקור מרכזי של רעש הרקע. חיצים נוספו כדי לסייע בהדמיה של כיוון של L1 מסומן. חיצים וקריאות בכחול מכוונים ברצף משמאל לימין. a) הפגינו דוגמה של L1 נחתך ב SUFAMILY L1MB5 כי הוא 2706 bps. ב IGV ניכר כי הקריאות מקורם בשלוחה של גן מבוטא. b) מוצג דוגמה נוספת של L1 מעוגל. L1 זה הוא L1PA11 באורך של 4767 bps. בשנת IGV מתברר כי המיפוי מתבטא באופן ייחודי לL1 שמקורם בביטוי, שL1 בתוכו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig04v2.jpg"> איור 4: תעתיק קורא כי המפה באופן ייחודי לכל באורך מלא L1s בגנום האנושי מתבטאת בDU145 קו הגידול של הערמונית. בשחור הם היכן שניתן לזהות כפי שהתבטא באופן אותנטי לאחר ביטוי ידני ובאדום הם הרוח המסוימת להידחות כפי שהתבטא באופן אותנטי קורא לאחר היווצרות ידני. באפור הם המקום עם פחות מעשרה קורא מיפוי לכל. כאשר המטה הזה מייצג חלקיק קטן של תעתיק, הם לא היו מקורסים ידנית. סימוני השנתות בציר x מציינות כל 100 באורך מלא, L1s ללא שינוי. כ-4,500 המקום אינו מוצג באופן גרפי כפי שהיו להם אפס קריאות ממופות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig05v2.jpg"> איור 5: התמליל קורא כי המפה באופן ייחודי כדי אותנטי הביע באורך מלא L1s ב DU145 הערמונית קו התא. מוצגים הם מספרי התעתיק המקראים את המפה לDU145 מסוים בתאי ה לאחר היווצרות ידני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig06v2.jpg"> איור 6: קורא מיפוי לביטוי אותנטי L1 בעת התאמתו על ידי mappability. מוצגים הם מספרי התעתיק המותאם באמצעות ציוני הדרך הספציפיים לרוח המפה לL1 הDU145 בתאים באופן ידני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
משלים קובץ 1: ביאורים עבור L1s אנושי באורך מלא, על פי אוריינטציה. a) FL-L1-BLAST_RM_minus. גף. ב) FL-L1-BLAST_RM_plus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
משלים קובץ 2: סקריפטים מחשב המשמש להפיכת צינור ביואינפורמטיקה מפורט בסעיף 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile_2.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 1: דגימת דנ א גנומית המשמש כדי לקבוע L1 mappability. המוצג הם מספר התעתיק הגנומית המופיעה מדגימת קו של תא של הלה המפה באופן ייחודי לכל 5,000 באורך מלא L1 המקום בגנום. זה היה מצוין כי L1 יש כיסוי מלאה מאוד כאשר 400 קורא את המפה L1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFigure_1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.</a>
טבלה משלימה 1: היווצרות ידני של L1s ב DU145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>
טבלה משלימה 2: אוצרת L1s ב DU145 עם כוונון mappability. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level at JoVE.com

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

כאן, אנו מציגים גישה ביולוגית ואנליזות כדי לזהות את הביטוי LINE-1 ברמה מסוימת.

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

אלמנטים ניידים הם אחד המקורות העיקריים לחוסר יציבות גנטית אנושית. הבנת הביטוי שלהם ברקמות ובתנאים שונים היא קריטית להבנת השפעתם על הגנום. העצום של תעתיקי L1 הם תוצאה של הכללה פסיבית של רצפים הקשורים L1 בתעתיקים אחרים שאין להם תפקיד במחזור החיים L1.הגישה שלנו מבטלת את הרקע הלא רלוונטי הזה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למחקרים של כל אלמנט נייד, או אפילו וירוסים בכל גנום רצף. צריכה להיות לפחות וריאציה ברצף כדי לאפשר אפליה בין לוצי.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית להמחשת ההחמרה והטיפול הנדרשים כדי לזהות בביטחון אלמנטים חוזרים L1 מבוטאים ברמה הספציפית לוקוס. התחל הליך זה עם מיצוי RNA ציטופלסמי ותהום הדור הבא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. על ידי בחירה עבור RNA ציטופלסמי, קריאות הקשורות L1 נמצאו בתוך mRNA intronic לידי ביטוי בגרעין מתרוקנים באופן משמעותי.בספריית רצף הכנה צעד נוסף שננקט כדי להפחית את רעש שעתוק שאינו קשור L1s כולל את הבחירה של תעתיקים polyadenylated. פעולה זו מסירה רעש תעתיק הקשור ל- L1 שנמצא במין שאינו mRNA. הפעל רצף יישור רצף קבצי FASTQ עם מדגם RNA seq של עניין באמצעות bowtie1 על ידי הקלדת שורת הפקודה במסוף לינוקס.אסטרטגיית יישור זו דורשת שהתעתיקים יהיו מיושרים באופן ייחודי וקוליני עם חיפוש גנומי ממצה. אסטרטגיה זו מספקת ביטחון בקריאה של מיפוי קריאות במיוחד לוקוס L1 יחיד. סטרנד מפריד את קובצי הפלט BAM באמצעות פקודות SAMtools ו- Linux כדי לבחור עבור הגדיל העליון והגדיל התחתון.שים לב כי ערכי הדגל בפועל עשויים להשתנות אם אחד אינו משתמש בפרוטוקולי רצף הדור הבא הרגילים. שלב הפרדת גדילים זה פועל כדי לסנן את רעש התמלול שנוצר בתוך רצפי L1 שאינם קשורים רטרוטרנספוזיציה L1 על ידי ביטול קריאות ממופות פוטנציאליות הקשורות antisense L1. צור ספירות קריאה נגד ביאורים עבור L1 loci באמצעות bedtools.הקלד תחילה את שורת הפקודה כדי ליצור ספירות קריאה עבור L1s בכיוון החושי בגדיל העליון ולאחר מכן הקלד את שורת הפקודה כדי ליצור ספירת קריאה עבור L1s בכיוון החושי בגדיל התחתון. הביאורים המשמשים לזיהוי L1s מציינים L1s באורך מלא עם אזורי מקדם פונקציונליים אשר פועלים כדי למנוע רעשי רקע שמקורם בדרך אחרת L1s חתוכים.העתק מעל קובץ הטקסט שנוצר ספירות קריאה שנוצר עבור הגדיל התחתון ולתייג את הדף minus_bottom. מיין את כל העמודות בהתבסס על המספר הגבוה ביותר לנמוך ביותר של קריאות שנמצאו בעמודה J.Copy מעל קובץ הטקסט שנוצר ספירות קריאה שנוצר שנוצר עבור הגדיל העליון. מיין את כל העמודות בהתבסס על המספר הגבוה ביותר עד הנמוך ביותר של קריאות שנמצאו בעמודה J.And תייג את העמוד top_plus.צור עמוד שלישי המסווים כעמוד משולב והוסף את כל הלוצ'י עם 10 קריאות או יותר minus_bottom plus_top עמודים. מיין את כל העמודות בהתבסס על המספר הגבוה ביותר עד הנמוך ביותר של קריאות שנמצאו בעמודה J.To לסייע mappability של אזורים גנומיים, במיוחד בתוך או ליד L1 loci, גנום שלם מזווג רצף קבצים של מינים של עניין הורדו מ NCBI והומרו קבצי FASTQ כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כעת, צור אינדקס עבור קבצי BAM כדי להפוך אותם לניתנים להצגה במציג הגנומיקה האינטגרטיבית, IGV מקוצר, לפני טעינת הקבצים.ב IGV לטעון את הגנום התייחסות של עניין לדמיין גנים מבואר. טען גם את קובץ הביאור עבור רכיבי L1 באורך מלא כדי להמחיש את הביאור L1, קובץ ה- BAM לביטוי RNA אנושי, כדי לדמיין תעתיקים ממופים מדגם העניין וקובץ ה- BAM עבור יכולת mappability של הגנום האנושי כדי להעריך את יכולת ה- mappability של אזורים גנומיים. הסר שורות עיתוד וצומת המשויכות לכל קובץ BAM.לדחוס את קבצי BAM עבור ביטוי RNA אנושי עבור mappability הגנום האנושי כך כל מסלולי IGV להתאים על מסך אחד. השלב הקריטי האחרון בביטול רעש שעתוק של רצפי L1 שאינם קשורים רטרוטרנספוזיציה L1 היא יצירה ידנית של L1s באורך מלא שזוהו כי ממופה RNA לחפש תעתיקים. אוצרות ידנית כרוכה בהדמיה של כל לוקוס L1 מבוטא בהקשר של הסביבה הגנומית הסובבת אותו כדי לאשר כי הביטוי מקורו מקדם L1.באמצעות קואורדינטות מ- L1 loci המפורטות בדף המשולב של גיליון העבודה, אצור באופן ידני כל לוקוס L1 עם תעתיקים ממופים באופן ייחודי על-ידי בחינת הסביבה הגנומית המקיפה אותם ב- IGV. לאצור לוקוס להתבטא באופן אותנטי משלו אם אין קריאות במעלה הזרם בכיוון L1 עד חמישה קילו-בבס. סמן את השורה בירוק בצבע ושים לב מדוע היא L1 המבוטאת באופן אותנטי. חריג לכלל זה קיים אם האזור במעלה הזרם של L1 אינו ניתן לתיווגם.אם זהו המקרה, סמן את השורה באדום בצבע ושים לב שלא ניתן להעריך את ביטוי האזור במעלה הזרם של מקדם L1 ולכן אין אפשרות לקבוע בביטחון את ביטוי ה- L1. לאצור לוקוס שלא יתבטא באופן אותנטי את האמרגן שלו אם יש קריאות במעלה הזרם עד חמישה קילו-בבס. סמן את השורה באדום בצבע ושים לב מדוע היא אינה L1 המבוטאת באופן אותנטי. לאצור לוקוס ככוזב אם הוא בא לידי ביטוי בתוך אינטרון של גן מבוטא באותו כיוון, עם קריאות במעלה הזרם של L1, אם זה במורד הזרם של גן מבוטא באותו כיוון עם קריאות במעלה הזרם של L1, או עבור דפוסי ביטוי ללא ביאורים עם קריאות במעלה הזרם של L1. חריג לכלל זה חל כאשר יש קריאות מינימליות החופפות ישירות לאתר ההתחלה של מקדם L1, אך מעט במעלה הזרם של L1. אם אין קריאות אחרות במעלה הזרם של מקרה L1 כזה, שקול L1 זה לבוא לידי ביטוי אותנטי.סמן את השורה בירוק ושים לב מדוע היא L1 המבוטאת באופן אותנטי. לאצור לוקוס L1 ככל הנראה להיות שקר אם הדפוס של קריאות ממופות לוקוס אינם תואמים עם אזורי L1 הספציפיים של mappability. אם L1 הוא מאוד mappable, אבל יש רק ערימה של קריאות באזור מרוכז בתוך L1, זה פחות סביר להיות קשור ביטוי L1 את האמרגן שלה סביר יותר להיות ממקורות לא ידועים כמו exons או LTRs. במקרים כאלה, לאצור את הלוקוס כתום ולציין מדוע הלוקוס הוא חשוד.אמת מקורות של ערימות חשודות על ידי בדיקת מיקום L1 בדפדפן הגנום של UCSC. לאצור לוקוס שלא יתבטא באופן אותנטי אם הוא נמצא בסביבה גנומית של אזורים לא מבוטאים באופן ספורדי. קריאות עשויות לבוא לידי ביטוי 10 קילו-בבס במעלה הזרם של L1. אבל כל 10 קילו-בבס בערך, יש קריאות ממופות וחלק מהקריאות האלה מתיישרות עם ה-L1. L1s אלה צפויים להיות ממופים קריאות עקב דפוסים לא מנואורים של ביטוי גנומי.במקרים כאלה, לאצור את הלוקוסים כמו אדום ולציין מדוע הלוקוס הוא חשוד. כדי לסייע mappability של כל L1 loci לקבוע את מספר קריאות ממופות באופן ייחודי L1 loci באמצעות תוכנית bedtools, ביאור FL-L1 ואת נתוני רצף גנומי מיושר. ייעוד לוקוס L1 יש mappability כיסוי מלא כאשר 400 קריאות ייחודיות מיושרים אליו.לקבוע את הגורם הנדרש כדי להגדיל או למטה DNA גנומי מיושר קורא 400 עבור כל L1 בודדים. כדי לקבל מידה מסוימת של ביטוי על פי Mappability L1 לוקוס בודדים, להכפיל את הגורם על ידי מספר תעתיק RNA קורא כי ליישר L1s בודדים מבוטאים באופן אותנטי. כל שלב משמש כדי להדגיש הבדלים בין אלמנטים L1 לידי ביטוי את האמרגן שלהם, ואת כל הדרכים כי אלמנטים L1 עשוי להיכלל לתוך תעתיקים אחרים שאינם קשורים מחזור החיים L1. המוצגים כאן תעתיק קורא כי המפה באופן ייחודי לכל L1s שלם באורך מלא בגנום האנושי לידי ביטוי בקו תא גידול הערמונית DU145.בשחור הם הלוצ'י הספציפיים שזוהו כאותנטיים לאחר אוצרות ידנית. ואדום הם loci ספציפי נדחה כמו קריאות באותנטיות לאחר אוצרות ידנית. באפור הם loci עם פחות מ 10 קריאות מיפוי לכל אחד.מכיוון שלוצי אלה מייצגים חלק קטן מקריאות התמליל, הם לא אוצרו ידנית. כ-4500 לוכסנים אינם מוצגים גרפית, מכיוון שהיו להם אפס קריאות ממופות. לאחר אוצרות ידנית, מספר קריאות המפה באופן ייחודי כדי אותנטי לידי ביטוי ספציפי L1 loci ב DU145 נע בין 175 קריאות למינימום שנבחר באופן שרירותי לחתוך של 10 קריאות.לאחר קריאות הותאמו עבור ציונים mappability בכל לוקוס, כימות הביטוי עבור רוב הלוקוס גדל. מספר הקריאות הממופות באופן ייחודי ללוצ'י L1 ספציפיים שהובעו באופן אותנטי עם תיקוני mappability ב- DU145 נע בין 612 לארבע קריאות והיה סידור מחדש של הלוצ'י הגבוה ביותר לנמוך ביותר. כל צעד ממלא תפקיד מכריע בהפחתת הרמה הגבוהה של רעשי רקע שעתוק.עם זאת, הצעד הקריטי ביותר הוא אוצרות ידנית של כל לוקוס L1 כדי לאשר שעתוק של האמרגן שלו. כ-50% מ-L1 loci שזוהו ביואינפורמטית בתאי DU145 נדחו כרעש רקע L1 שמקורו במקורות שעתוק אחרים, תוך שימת דגש על הקשיחות הנדרשת להפקת תוצאות אמינות. כדי לזהות את הצעיר ביותר של L1s, אנו מציעים להשתמש חמש ראשוני RACE הבחירה של תעתיקי L1 וטכנולוגיית רצף כמו PacBio לעשות שימוש קריאות ארוכות יותר ומאפשר מיפוי ייחודי יותר.בגישה זו, אנו יכולים לזהות ולמת דפוסי ביטוי L1 בצורה מחמירה ובטוחה. זה סולל את הדרך להבנה טובה יותר של הרגולציה של לוקי L1 בודדים ואת ההשפעה הפוטנציאלית.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA Repair and Recombination

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

צינור ביואינפורמטיקה לנתח באופן מדויק ויעיל את המייקרואורפה בצמחים

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...