Name: rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level
Uploaded: 2019-05-19T15:00:00
Duration: 11 min 4 s
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DU145 前立腺腫瘍細胞のためのヤンドン博士に感謝したいと思います。ネイサン・ Ungerleider 博士がスーパーコンピュータスクリプトを作成する際の指導と助言に感謝したいと思います。この研究の一部は、NIH 助成 R01 GM121812 PD、R01 AG057597 VPB、および 5TL1TR001418 TK によって賄われていた。我々はまた、十字軍とチューレーン癌センターバイオインフォマティクスコアからの支持を認めたい。

<ol>
	<li>International Human Genome Sequencing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860 (2001).</li><li>Brouha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+L1s+account+for+the+bulk+of+retrotransposition+in+the+human+population.">Hot L1s account for the bulk of retrotransposition in the human population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).</li><li>Dombroski, B. A., Mathias, S. L., Nanthakumar, E., Scott, A. F., Kazazian, H. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+characterization,+and+cell+specificity+of+a+human+LINE-1+promoter.">Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (12), 6718-6729 (1990).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Deininger, L., Batzer, M. A., Hutchison, C. A., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+genes+in+mammalian+repetitive+DNA+amplification.">Master genes in mammalian repetitive DNA amplification.</a> Trends in Genetics. 8 (9), 307-311 (1992).</li><li>Boissinot, S., Chevret, P., Furano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+(LINE-1)+Retrotransposon+Evolution+and+Amplification+in+Recent+Human+History.">L1 (LINE-1) Retrotransposon Evolution and Amplification in Recent Human History.</a> Molecular Biology and Evolution. 17 (6), 915-918 (2000).</li><li>Khazina, E., Weichenrieder, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LTR+retrotransposons+encode+noncanonical+RRM+domains+in+their+first+open+reading+frame.">Non-LTR retrotransposons encode noncanonical RRM domains in their first open reading frame.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (3), 731-736 (2009).</li><li>Martin, S. 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D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1808 (1991).</li><li>Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+R2Bm+RNA+is+primed+by+a+nick+at+the+chromosomal+target+site:+A+mechanism+for+non-LTR+retrotransposition.">Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: A mechanism for non-LTR retrotransposition.</a> Cell. 72 (4), 595-605 (1993).</li><li>van den Hurk, J. A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+types+of+mutation+in+the+choroideremia+(CHM)+gene:+a+full-length+L1+insertion+and+an+intronic+mutation+activating+a+cryptic+exon.">Novel types of mutation in the choroideremia (CHM) gene: a full-length L1 insertion and an intronic mutation activating a cryptic exon.</a> Human Genetics. 113 (3), 268-275 (2003).</li><li>Min&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genomic+deletion+in+the+PDHX+gene+caused+by+the+retrotranspositional+insertion+of+a+full-length+LINE-1+element.">A large genomic deletion in the PDHX gene caused by the retrotranspositional insertion of a full-length LINE-1 element.</a> Human Mutation. 28 (2), 137-142 (2007).</li><li>Solyom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+orphan+transduction+created+by+a+nonreference+LINE-1+retrotransposon.">Pathogenic orphan transduction created by a nonreference LINE-1 retrotransposon.</a> Human Mutation. 33 (2), 369-371 (2012).</li><li>Hancks, D. C., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+retrotransposon+insertions+in+human+disease.+Mobile+DNA.">Roles for retrotransposon insertions in human disease. Mobile DNA.</a> Mobile DNA. 7, 9-9 (2016).</li><li>Tubio, J. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DNA+in+cancer.+Extensive+transduction+of+nonrepetitive+DNA+mediated+by+L1+retrotransposition+in+cancer+genomes.">Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes.</a> Science. 345 (6196), 1251343-1251343 (2014).</li><li>Ewing, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+somatic+L1+retrotransposition+occurs+early+during+gastrointestinal+cancer+evolution.">Widespread somatic L1 retrotransposition occurs early during gastrointestinal cancer evolution.</a> Genome Research. 25 (10), 1536-1545 (2015).</li><li>Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97-97 (2009).</li><li>Iskow, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Mutagenesis+of+Human+Genomes+by+Endogenous+Retrotransposons.">Natural Mutagenesis of Human Genomes by Endogenous Retrotransposons.</a> Cell. 141 (7), 1253-1261 (2010).</li><li>Scott, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hot+L1+retrotransposon+evades+somatic+repression+and+initiates+human+colorectal+cancer.">A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer.</a> Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).</li><li>Kines, K. J., Sokolowski, M., deHaro, D. L., Christian, C. M., Belancio, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+genomic+instability+associated+with+retrotranspositionally-incompetent+L1+loci.">Potential for genomic instability associated with retrotranspositionally-incompetent L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 42 (16), 10488-10502 (2014).</li></ol>

作者は何も開示することはありません。

L1 活動は、疾患27、28、29に寄与する遺伝的損傷および不安定性を引き起こすことが示されている。約5000の全長 L1 コピーのうち、大部分の retrotransposition 活動2については、数十の進化的に若い L1s が占めています。しかし、いくつかの古い、retrotranspositionally の incompentent L1s でも、DNA 損傷タンパク質30を生成することができるという証拠があります。ゲノム不安定性および疾患における L1s の役割を十分に理解するために、遺伝子座特異的レベルでの L1 発現が理解されなければならない。しかしながら、l1 retrotransposition に関係のない他の Rna に組み込まれた L1 関連配列の高い背景は、本物の L1 発現を解釈する上で大きな課題を提起している。個々の L1 遺伝子座の発現パターンを同定して理解することにおけるもう1つの課題は、多くの短いリード配列が単一のユニークな遺伝子座にマッピングされない反復的な性質のために生じる。これらの課題を克服するために、RNA-SEQ データを用いて個々の L1 遺伝子座の発現を同定する上で、上述した手法を開発しました。
当社のアプローチは高レベル (99% 以上) をフィルタリングします。l1 retrotransposition とは無関係で、いくつかのステップをとることによって生成された1次シーケンスから発生する転写ノイズのこと。第1のステップは、細胞質 RNA の調製を含む。細胞質 RNA を選択することによって、核内で発現している intronic mRNA 内で見出された L1 関連読み取りは著しく枯渇する。シーケンスライブラリの準備では、L1s とは無関係の転写ノイズを低減するための別のステップとして、ポリアデニル化転写物の選択が挙げられます。これは非 mRNA 種で見つかった L1 関連のトランスクリプトノイズを除去します。別のステップは、アンチセンス L1 関連転写産物を同定および除去するためのストランド特異的シーケンシングを含む。L1s にマップされている RNA-SEQ トランスクリプトの数を特定する際に機能プロモーター領域を持つ全長 L1s にアノテーションを使用すると、L1s ではなく切り捨てられたバックグラウンドノイズもなくなります。最後に、L1 retrotransposition に関係のない L1 配列の転写ノイズを除去する最後の重要なステップは、L1s 転写産物であることが特定された全長の手動キュレーションです。手動キュレーションには、周囲のゲノム環境のコンテキストで bioinformatically に識別された各非発現 L1 遺伝子座の視覚化が含まれ、その発現が L1 プロモーターから発生していることを確認します。このアプローチは、DU145、前立腺腫瘍細胞株に適用した。背景雑音を減少させるために取られた準備関連のすべてのステップでさえ、DU145 の bioinformatically を同定した L1 遺伝子座のおよそ 50% は、他の転写源に由来する L1 バックグラウンドノイズとして拒絶した (図 4)。信頼性の高い結果を生み出すために必要な厳しさを強調します。手動キュレーションを用いたこのアプローチは、労働集約的であるが、全長 L1 を取り巻くゲノム環境を評価し理解するために、このパイプラインの開発に必要である。次のステップは、いくつかのキュレーションルールを自動化することによって必要な手作業のキュレーションの量を減らすことですが、ゲノム発現の完全に知られていない性質、参照ゲノムにおける非アノテーションの表現源、低の領域mappability、さらには参照ゲノムの構築に関係する複雑な要因についても、現時点では L1 キュレーションを完全に自動化することはできません。
シーケンシングを伴う個々の L1 遺伝子座の発現を同定する際の第2の課題は、反復的な L1 転写物のマッピングに関するものである。このアライメント戦略において、トランスクリプトは、マッピングされるために、基準ゲノムと一意的に位置合わせする必要があります。Concordantly をマッピングする対末端配列を選択することにより、参照ゲノム中に見られる L1 遺伝子座に一意的に一致する転写産物の量が増加する。このユニークなマッピング戦略は、単一の L1 遺伝子座に特異的に読み取りマッピングの呼び出しに自信を提供しますが、それは潜在的に過小評価に表現された反復的な L1 の式の量を決定します。この過小評価をほぼ正確にするために、その mappability に基づいて各 L1 軌跡の「mappability」スコアを開発し、一意にマッピングされたトランスクリプト読み取りの数に適用しました (図 6)。理想的には、mappability は、一致する WGS サンプルに従って、完全な長さの L1 全体の完全なカバレッジ読み取りにスコアを付けなければならないことに注意してください。ここでは、DU145 前立腺腫瘍細胞株の L1 遺伝子座への読み取りマッピングを膨張または収縮させるために、WGS の HeLa 細胞を使用して各 L1 遺伝子座の mappability スコアを決定します。この mappability 計算は粗補正スコアであるが、400読み取りの選択された「完全なカバレッジ mappability」は、腫瘍細胞株の動的な性質を念頭において決定した。これは、図1の補足で観察することができますが、これには、値が割り当てられています。これらは、参照ゲノム内にない HeLa 内の重複した染色体配列に由来する可能性があり、これらの遺伝子座は完全な mappability カバレッジの代表として選択されなかった理由である。その代わりに、100% の読み取りカバレッジの平均が、補足図 1に従って400の読み取りの周りに発生し、その後、この平均が DU145 腫瘍前立腺細胞株にも適用されると仮定しました。
L1s からの 100-200 bp の読み出しとのこのアライメント戦略はまた、よりマッピングできるようにする古い L1s が時間をかけて蓄積してきたので、参照ゲノム内の進化的に古いのための選択を優先します。したがって、このアプローチは、L1s の最年少と同様に非参照、多形性 L1s を識別することになると、感度が制限されます。L1s の最年少を識別するために、我々はより長い読み取り21を利用する PacBio のような L1 トランスクリプトとシーケンス技術の 5 ' レース選択を使用することをお勧めします。これにより、よりユニークなマッピングが可能になり、したがって、表現された若い L1s の識別が確実になります。 RNA-SEQ と PacBio のアプローチを併用することで、真に表現された L1s のより包括的なリストにつながることができます。真に表現された多形性 L1s を同定するために、最初の次のステップは、参照ゲノムへの多形配列の構築および挿入を含む。
反復配列を研究する上での生物学的および技術的な課題は素晴らしいですが、RNA シーケンシング技術を使用して retrotransposition に非関連の L1 配列の転写ノイズを除去する上記の厳格な手順では、バックグラウンド・ノイズを転写する大規模なレベルは、個々の遺伝子座レベルで L1 発現パターンと量を確実かつ厳密に特定することです。

L1s の Retrotransposition は、insertional 変異誘発、標的部位欠失、および再編成を含む様々なメカニズムによってヒト生殖細胞系列疾患を引き起こすことが報告されている13、14、15、 16.最近では、この変異原性要素の増加した発現および挿入事象が種々の上皮癌において観察されているように、L1s がもとづきおよび/または腫瘍進行において役割を果たす可能性があるという仮説がある17、18.すべての200の出生19に1つの新しい L1 挿入があると推定されます。したがって、積極的に発現する L1s の生物学をよりよく理解することが不可欠である。他の遺伝子の転写産物に見られる、重複する欠陥コピーの性質と豊富さは、このレベルの分析には困難を伴います。
幸いなことに、ハイスループットシーケンス技術の出現により、L1s は、遺伝子座固有のレベルで、真に発現しているサブテクノロジーを解析して識別するようになりました。RNA の次世代のシーケンシングを使用して表現された L1s を最もよく識別する方法にはさまざまな哲学があります。遺伝子座固有のレベルで L1 転写物をマッピングするために提案された2つの合理的なアプローチしかありませんでした。1つは、L1 ポリアデニル化シグナルを介して、および隣接配列20を読み取る可能性のある転写にのみ焦点を当てています。我々のアプローチは、L1 要素間の小さな配列差を利用して、1つの遺伝子座21に一意にマップする rna-seq の読み取りのみをマッピングします。これらの方法は両方ともトランスクリプトレベルの定量化の点で制限があります。各 L1 軌跡21の ' unique mappability ' に対する補正を追加するか、または特定の軌跡22に一意にマッピングできなかったマルチマッピングされた読み取りを再分配するより複雑なアルゴリズムを使用することにより、潜在的に定量を改善することができる。ここでは、遺伝子座特異的レベルにおいて発現した L1 元素を同定するための RNA 抽出と次世代シーケンシングとバイオインフォマティクスプロトコルについて段階的に詳述する。私たちのアプローチは、機能的 L1 要素の生物学の知識を最大限に活用しています。これには、l1 要素の開始時に開始される L1 プロモーターから機能的な L1 要素を生成する必要があることがわかっており、細胞質で翻訳されなければならず、その転写物はゲノムと共に直線的でなければなりません。簡単に言えば、私たちは新鮮な細胞質 RNA を収集し、ポリアデニル化転写産物を選択し、ストランド固有の RNA-SEQ 分析を利用して、ヒト参照ゲノムの L1 遺伝子座への読み取りを一意にマッピングします。これらの整列された読み取りでは、トランスクリプトの読み取りが、真の表現 L1 として位置を指定する前に L1 プロモーターから発生するかどうかを決定するための広範な手動キュレーションが必要です。我々は、DU145 前立腺腫瘍細胞株サンプルにこのアプローチを適用し、不活性なコピーの質量から比較的少数の積極的に転写された L1 メンバーを識別する方法を実証する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bedtools.26.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/installation.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bowtie-0.12.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/0.12.8/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>BBI-8541906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV 2.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mac2unix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/cs-cmdtools/files/mac2unix/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse later solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>samtools-1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/samtools/files/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sratoolkit.2.9.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level

長く散在した要素-1 (ライン/L1s) は、ゲノムの不安定性および突然変異をもたらし、複製し、無作為に遺伝子を挿入することができる反復的な要素である。個々のレベルでの L1 遺伝子座の発現パターンを理解することは、この変異原性要素の生物学の理解に役立つであろう。この自律要素は、ヒトゲノムのかなりの部分を50万以上のコピーで構成しますが、99% は切り捨てられ、欠陥があります。しかし、その豊かさと支配的な数の欠陥コピーにより、他の遺伝子の一部として表現された L1 関連の配列から、真に発現した L1s を同定することは困難になります。また、要素の反復的な性質のために特定の L1 軌跡がどのように発現しているかを特定することも困難である。これらの課題を克服し、遺伝子座特異的レベルで L1 発現を同定するための RNA-SEQ おいアプローチを提示します。要約すると、細胞質 RNA を収集し、ポリアデニル化転写産物として選択し、ヒト参照ゲノムの L1 遺伝子座への読み取りを一意にマップするために、ストランド固有の RNA-SEQ 分析を利用します。独自にマッピングされた読み取りで各 L1 軌跡を視覚的に選定し、独自のプロモーターからの転写を確認し、マッピングしたトランスクリプトの読み取りを調整して個々の L1 遺伝子座の mappability を説明します。このアプローチを、前立腺腫瘍細胞株 DU145 に適用し、少数の全長 L1 要素から発現を検出するこのプロトコルの能力を実証した。

上記および図 1においてグラフィカルに説明したステップを、ヒト前立腺腫瘍細胞株 DU145 に適用した。RNA サンプルは、cytoplasmically に準備され、次世代である、選択した、ストランド固有の、ペアエンドプロトコルで順序付けられました。蝶ネクタイを使用して、ペアのエンドシーケンスファイルは、他のゲノムの場所と比較して1つのゲノム位置に一致したペアエンドの読み取りが合致する一意の一致のみを許可するように配置されました。DU145 シーケンスファイルは、作成者の要求に応じて利用可能である bam ファイルを作成する、人間の参照ゲノムに整列されました。Bedtools を使用して、データは、全長 L1s にマップされた読み取りの数で DU145 のストランド分離 bam ファイルから抽出しました。これらの読み取りはスプレッドシート内で最大から最小に並べ替えられ、IGV 内の各 L1 遺伝子座の周囲のゲノム環境を検証して手動でキュレーションし、その信憑性を確認しました (補足表 1)。サンプルを本物で表現するためにキュレーションされている場合は、右側の列で受け入れられるかどうかを説明する緑色の色分けが施されています。真に表現されることが認められた L1 遺伝子座の例は、方法セクションに記載されたガイドラインに従って、図 2a − bに示される。もしサンプルが本物であると拒絶された場合、それは赤として色分けして、最も右側の列に拒否の理由を示しました。L1 遺伝子座の例は、方法セクションに記載された自身の以下のガイドライン以外のプロモーターからの発現のために、図 2c − eに詳述する。
ここでは、無傷のプロモーター領域を有する全長 L1s のみが検討された。この区別がなされない場合、切り捨てられた L1s に起因する転写雑音の大きな源が導入される。DU145 における切り捨てられた L1s の例を図 3a-bに示し、それらは一意にマッピングされた rna-seq 読み取りを有するものとして同定した。しかし、IGV では、これらの転写物は、切り捨てられた L1 から開始されるのではなく、遺伝子または下流に発現した遺伝子の L1 配列を含むことが明らかである。
全体として、DU145 における完全長の L1 遺伝子座と読み取りの割合は、手作業によるキュレーションの後 L1s によって真に表現されたものとして拒絶されるが、約 50% (補足表 2) である高レベルの l1 マッピング済みトランスクリプトの読み取りを示すそれ以外の場合は、手動キュレーションなしで誤検知として記録されます。具体的には、DU145 では114の全長 L1 遺伝子座が合計3152の読み取りで感覚方向にユニークにマッピングされた読み取りを持っていましたが、1879の読み取りで手動でキュレーションした後に自身のプロモーターを発現することが判明したのは60の遺伝子座のみでした (補足表 1)。これは、細胞質 mRNA を選択することによって L1 生物学に無関係な発現を低減するためのステップが取られた場合でもそうである。DU145 のマッピングされたトランスクリプトの最高レベルの軌跡は、真に発現している L1 (図 4) ではなかったため、拒否されたことに注意してください。特定の L1 遺伝子座に対するマッピングされた転写物の総数は、受け入れられた L1 遺伝子座と同様に、手動によるキュレーション後に真に表現されています (図 4)。
手動によるキュレーションの後、DU145 の特定の L1 遺伝子座を忠実に表現するために一意にマッピングされた読み取りの数は、175から、10回の読み取りの任意に選択した最小カットオフまでの範囲になります (図 5)。一意にマッピングされたトランスクリプトの読み取りを識別するこのアプローチは、L1s を正確に定量化する能力を制限します。これを考慮すると、その mappability に基づいて各軌跡の補正係数が作成されました。この補正係数を作成するために、最初の bedtools は、すべての全長 L1 遺伝子座に位置合わせした、HeLa ゲノム bam ファイルから一意にマッピングされた読み取りの数を抽出し、それらの遺伝子座を最も高いマッピング済みトランスクリプト読み取り (補足図 1)。400の読み取りで L1s が完全なカバレッジ mappability を持っていたことを任意に指定されました。HeLa ゲノムシーケンシングサンプルにおいて L1 遺伝子座にマッピングできる読み取りの数は、400の読み取りに対してスケールされ、そのスケールされた数は、DU145 内の各真に発現している L1 遺伝子座にマッピングした読み取り数に乗算しました (補足表 2)。.予想通り、mappability のためにより大きな補正スコアを持っていた L1 要素は、L1PA2 (補足表 2) のような若いサブファミリーから来ました。各遺伝子座の mappability スコアに対して読み取りを調整した後、ほとんどの遺伝子座の発現に対する定量化が増加しました (図 6)。DU145 の mappability 補正により、真に発現している特定の L1 遺伝子座に特異的にマッピングされた読取りの数は、612から4読み取りであり、最も高い発現遺伝子座への再配列がありました (図 6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig01v2.jpg"> 図 1: ワークフローの回路図。 グラフィカルに説明されているのは、ヒトサンプルにおいて発現した L1s を同定するステップである。適切なファイルが既に使用可能な場合は、手順1と2を繰り返す必要がないことに注意してください。これらの適切なファイルは、補足ファイル 1a-bおよび補足ファイル 2からダウンロードすることができます。赤色のボックスは、bedtools カバレッジプログラムを使用して、同じセンス方向の L1s に対する読み取りマッピングの数をカウントする手順を示しています。センス指向のマッピング読み取りを持つこれらの遺伝子座は、手動でキュレーションすべき L1s です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig01large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig02v2.jpg"> 図 2: DU145 におけるキュレーションされた L1 遺伝子座の例 IGV にロードされた参照ゲノム、完全長の L1 gff アノテーションファイルは、参照ゲノムバージョン (補足ファイル 1)、DU145 bam ファイル、最後にゲノム HeLa bam ファイルが mappability を評価するためのもので、すべて著者によって利用可能です。要求。注釈付き L1 の方向の視覚化を支援するために矢印が追加されました。矢印と赤の読み取りは、右から左に順番に配置されています。矢印と青色の読み取りは、左から右に順番に配置されます。a) IGV では、この l1 遺伝子座は、5 kb を超える感覚方向に l1 の上流には読み取りがないので、自身のプロモーターから発現しているように見えます。この L1 は、mappability が低く、遺伝子にはないが、期待されるアンチセンスプロモーター活性26の証拠を有する。b) IGV において、この l1 遺伝子座は、5 kb を超える感覚方向に上流の l1 を読み取ることがないので、自身のプロモーターをオフに発現しているように見える。この L1 は mappability が低く、反対方向の遺伝子の中にあります。c) IGV において、この l1 遺伝子座は、5 kb 以内に同じ方向の上流読み取りがあるので、発現 L1 として拒絶された。この L1 は同じ方向の遺伝子の中にあるので、転写産物の読み取りは、発現している遺伝子のプロモーターに由来する可能性が最も高い。d) IGV において、この l1 遺伝子座は、5 kb 以内に同じ方向の上流読み取りがあるので、発現 L1 として拒絶された。この L1 は、同じ方向の高発現遺伝子の下流にあるため、転写産物の読み取りは、その発現された遺伝子のプロモーターから発生し、通常の遺伝子ターミネーターを超えて延びている可能性が最も高い。e) IGV において、この l1 遺伝子座は、5 kb 以内に同じ方向のアップストリーム読み取りがあるので、発現 L1 として拒絶された。この L1 は、参照遺伝子中の注釈付き遺伝子の内部またはその近辺ではないため、L1 要素の上流および川上にあるこれらの転写物の起源は、非注釈型プロモーターを示唆する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig02large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig03v2.jpg"> 図 3: バックグラウンドノイズは、切り捨てられた L1s からも発生します。 この L1 アノテーションには、バックグラウンドノイズの主要なソースであるため、切り捨てられた L1s は含まれていません。注釈付き L1 の方向の視覚化を支援するために矢印が追加されました。矢印と青色の読み取りは、左から右に順番に配置されます。a) は 2706 bps である L1MB5 sufamily で切り捨てられた L1 の例です。IGV では、読み取りが発現した遺伝子の下流の拡張に由来することが明らかになっています。b) は、切り捨てられた L1 の別の例である。この L1 は 4767 bps の L1PA11 です。IGV では、L1 に固有の読み取りマッピングが、L1 に含まれる発現されたエクソンから発生していることが明らかです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig03large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig04v2.jpg"> 図 4: DU145 前立腺腫瘍細胞株において発現されたヒトゲノムにおける全長さ無傷 L1s に対して一意にマップするトランスクリプト読み取り。 黒色では、手作業によるキュレーションの後に真に発現していると識別される特定の遺伝子座が、赤では手動でキュレーションした後に、真に表現された読み取りとして拒絶する特定の遺伝子座である。灰色では、それぞれに10未満の読み取りマッピングを有する遺伝子座である。これらの遺伝子座はトランスクリプトの読み取りのわずかな部分を表しているため、手動でキュレーションすることはできませんでした。X 軸目盛りは、すべての100の完全な長さ、無傷の L1s を示しています。約4500遺伝子座は、マップされた読み取りがゼロであるため、グラフィカルに示されません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig04large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig05v2.jpg"> 図 5: トランスクリプトは、DU145 前立腺腫瘍細胞株において、完全な長さの無傷の L1s を真に発現するように一意的にマッピングする。 マニュアルキュレーション後に DU145 細胞の特定の遺伝子座にマップされるトランスクリプトの読み取りの数を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig05large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig06v2.jpg"> 図 6: mappability で調整した場合、真に表現された L1 へのマッピングを読み取ります。 図は、DU145 細胞に手動でキュレーションされた L1 遺伝子座にマッピングされる遺伝子座特異的 mappability スコアによって調節される転写物読み取りの数である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig06large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1: 向きに応じて、完全長、無傷の人間の L1s の注釈。 a)FL-L1-BLAST_RM_minus gffb) FL-L1-BLAST_RM_plus. gff.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 2: セクション4で詳述したバイオインフォマティクスのパイプラインを自動化するために使用されるスパコンスクリプト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile_2.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 1: L1 mappability を決定するために使用されるゲノム DNA サンプル。 示されているのは、ゲノム中の全5000の全長 L1 遺伝子座に一意的にマップする HeLa 細胞株サンプルからのゲノム転写物読み取りの数である。400が L1 にマップを読み込むとき、L1 に完全なカバレッジ mappability があることが指定されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFigure_1.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 1: DU145 における L1s の手動キュレーション<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 2: mappability 調整と DU145 でキュレーション L1s。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

ここでは、おいのアプローチと分析を提示して、遺伝子座の特定のレベルでライン1式を特定します。

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

可動要素は、ヒトの遺伝的不安定性の主要な原因の1つです。異なる組織や条件での発現を理解することは、ゲノムへの影響を理解するために重要です。L1転写物の膨大な量は、L1のライフサイクルに何の役割も持たない他の転写物にL1関連配列を受動的に含んだ結果である。私たちのアプローチは、この無関係な背景を排除します。このプロトコルは、任意のモバイル要素、あるいは任意の配列ゲノム中のウイルスの研究に適応することができる。遺伝子座間の差別を可能にするためには、少なくとも何らかの配列変化が必要である。この方法の視覚的なデモンストレーションは、座遺伝子固有のレベルで発現したL1反復要素を自信を持って識別するために必要なストリンジェンシーとケアを説明する上で重要です。テキストプロトコルに記載されているように、細胞質RNA抽出と次世代シーケンシングでこの手順を開始します。細胞質RNAを選択することにより、核内で発現したイントロニックmRNA内で見つかったL1関連の読み取り値が著しく枯渇する。シーケンシングライブラリ調製では、L1sと無関係の転写ノイズを低減するために取られた別のステップは、ポリアデニル化転写物の選択を含む。これは、非mRNA種に見られるL1関連の転写ノイズを除去します。コマンドラインを Linux 端末に入力して、bowtie1 を使用して目的の RNA シークサンプルを使用して、アライメントパラダイムシーケンスング FASTQ ファイルを実行します。このアライメント戦略では、トランスクリプトが一意に並び、包括的なゲノム検索と一致する必要があります。この戦略は、単一の L1 軌跡に特化した読み取りマッピングの呼び出しに対する信頼を提供します。Strand は、SAMtools コマンドと Linux コマンドを使用して、トップ ストランドとボトム ストランドを選択して出力 BAM ファイルを分離します。標準の次世代シーケンス プロトコルを使用していない場合、実際のフラグ値は異なる可能性があることに注意してください。このストランド分離ステップは、潜在的なアンチセンスL1関連マッピング読み込みを排除することによって、L1レトロトランスポーズとは無関係のL1配列内で生成される転写ノイズを除外するために働く。ベッドツールを使用して L1 loci の注釈に対する読み取り数を生成します。最初にコマンド ラインを入力して、上端のセンス方向の L1 の読み取りカウントを生成し、次にコマンド ラインを入力して、底鎖のセンス方向の L1 の読み取りカウントを生成します。L1 を識別するために使用される注釈は、機能プロモーター領域を持つ全長 L1 を表し、切り捨てられた L1s から発生するバックグラウンド ノイズを除去します。生成された読み取りカウント テキスト ファイルの上にコピーして、下のストランドに対して作成され、ページにminus_bottomラベルを付けます。列 J Copy で見つかった読み取りの最大数から最小数に基づいてすべての列を並べ替えます。列 J. で見つかった読み取りの最大数から最小数に基づいてすべての列を並べ替え、ページにtop_plusラベルを付けます。結合されたラベルの付いた 3 番目のページを作成し、minus_bottomページとplus_topページから 10 回以上の読み取りですべての loci を追加します。列J.Toに見られる読み取りの最大数から最低数に基づいてすべての列を並べ替え、特にL1 loci内または近くのゲノム領域のマッピング可能性を支援し、対象となる種の全ゲノムペアおよびシーケンシングファイルをNCBIからダウンロードし、テキストプロトコルに記載されているようにFASTQファイルに変換した。次に、ファイルを読み込む前に、統合ゲノミクス ビューア(略称 IGV)で表示できるように BAM ファイルにインデックスを付けます。IGVでは、注目の参照ゲノムを読み込み、注目された遺伝子を可視化する。また、全長L1要素のアノテーションファイルをロードして、L1アノテーション、ヒトRNA発現用のBAMファイルを可視化し、ヒトゲノムマッピングの目的サンプルおよびBAMファイルからマッピングされたトランスクリプトを可視化し、ゲノム領域のマッピング可能性を評価する。各 BAM ファイルに関連付けられているカバレッジ行とジャンクション行を削除します。すべての IGV トラックが 1 つの画面に収まるように、ヒト RNA の発現とヒトゲノムのマッピング可能性のために BAM ファイルを圧縮します。L1レトロトランスポーズとは無関係のL1配列の転写ノイズを除去する最後の重要なステップは、RNAシークトランスクリプトをマッピングしたことを特定した全長L1の手動作成です。手動キュレーションは、その周囲のゲノム環境のコンテキストで発現した各L1遺伝子座の可視化を含み、発現がL1プロモーターから生ずることを確認する。スプレッドシート結合ページにリストされているL1 lociの座標を使用して、IGVの周囲のゲノム環境を調べることによって、各L1遺伝子座を一意にマッピングされたトランスクリプトで手動でキュレーションします。L1方向に最大5キロベースのリードがない場合は、独自に本物の表現を行う軌跡をキュレーションします。行に緑色のラベルを付け、それが本物のL1である理由を書き留めます。L1 の上流の領域がマップ可能でない場合、この規則の例外が存在します。この場合は、行に赤い色のラベルを付け、L1プロモーターの上流の領域の発現を評価できないため、L1の式を確実に決定できないことに注意してください。最大5キロベースの読み取りがある場合は、独自のプロモーターから本物に表現しないように軌跡をキュレーションします。行に赤のラベルを付け、L1 が本物で表現されていない理由をメモします。発現した遺伝子のイントロン内で同じ方向に発現している場合、L1の上流、L1の上流読み込みで発現遺伝子の下流にある場合、またはL1の上流読み込みで無情報化発現パターンを持つ不表異調発現パターンに対して、同じ方向に発現している場合は偽として評価する。L1 プロモーター開始サイトに直接重なる読み取りが最小である場合、L1 の上流にだけしか読み取りがない場合は、この規則の例外が適用されます。このような L1 ケースの上流に他の読み取りがない場合は、この L1 を本物に表現することを検討してください。行に緑色のラベルを付け、それが本当に表現されたL1である理由をメモします。ローカスへのマッピングされた読み取りのパターンが特定の L1 のマップ可能性の領域と相関しない場合は、L1 軌跡を偽である可能性が高いかどうかをキュレーションします。L1 が高度にマッピング可能であるが、L1 内の凝縮領域に読み取りが積み重なっている場合、それ自身のプロモーターから L1 表現に関連する可能性が低く、エキソンや LDR のような情報のないソースからのものである可能性が高くなります。このような場合は、lociをオレンジ色にして、なぜ軌跡が疑わしいのかを確認します。UCSCゲノムブラウザでL1の位置を確認し、疑わしい積み重ねの原因を確認します。散発的に無情報化された領域のゲノム環境内にある場合は、本物の表現を行わない軌跡をキュレーションする。読み取りは、L1の上流に10キロベースを表わしてもよい。しかし、10キロベースかそこらごとに、マッピングされた読み取りがあり、それらの読み取りのいくつかはL1と一致しています。これらのL1sは、ゲノム表現の無情報化パターンのために読み取りをマッピングしている可能性が高い。このような場合は、lociを赤としてキュレーションし、軌跡が疑わしい理由をメモします。各L1 lociのマッピングを支援するために、ベッドツールプログラム、FL-L1アノテーション、および整列されたゲノムシーケンスデータを使用して、L1 lociに一意にマッピングされた読み取りの数を決定します。400 のユニークな読み取りが一致している場合に、完全なカバレッジ マップ機能を持つ L1 軌跡を指定します。個々のL1に対して、ゲノムDNAアライメント読み取り値を400にスケールアップまたはダウンするのに必要な因子を決定します。個々の L1 の遺伝子のマッピング可能性に応じて発現のスケール測定を持っている場合は、個々の本物に発現した L1s に整列する RNA トランスクリプト読み取りの数を係数に掛けます。各ステップは、独自のプロモーターから発現されるL1要素と、L1のライフサイクルとは無関係の他のトランスクリプトにL1要素を含めることができるすべての方法の違いを強調するために使用されます。ここに示されているトランスクリプトは、DU145前立腺腫瘍細胞株で発現されるヒトゲノムにおける全長無傷L1sに一意にマップするトランスクリプト読み取りである。黒で特定のlociは、手動キュレーションの後に本物に表現されています。そして、赤で特定のlociは、手動キュレーションの後に本物で表現された読み取りとして拒否されます。灰色では、それぞれに10読み取りマッピングを持つlociです。これらのlociはトランスクリプト読み取りのごく一部を表すので、手動でキュレーションされませんでした。マッピングされた読み取り値がゼロであるため、約 4500 個の loci はグラフィカルには表示されません。手動キュレーションの後、DU145の特定のL1 lociを本物に表現するために一意にマップする読み取りの数は、175読み取りから10読み取りの任意に選択された最小カットオフまで範囲です。各軌跡のマッピング可能性スコアに対して読み取りを調整すると、ほとんどの遺伝子座の式の定量が増加しました。DU145のマッピング可能性補正を伴う特定のL1 lociを本物に表現するために一意にマッピングされた読み取りの数は、612から4読み取りまで及び、最も高い発現遺伝子座の並べ替えがありました。各ステップは、転写バックグラウンドノイズの高レベルを低減する上で重要な役割を果たしています。しかし、最も重要なステップは、それ自身のプロモーターの転写を確認するために、各L1遺伝子座の手動キュレーションです。DU145細胞で生体情報学的に同定されたL1遺伝子座の約50%が、他の転写源に由来するL1バックグラウンドノイズとして拒絶され、信頼性の高い結果を生み出すために必要な厳しさを強調した。L1の最年少を特定するために、我々は、より長い読み取りを利用し、よりユニークなマッピングを可能にするPacBioのようなL1トランスクリプトとシーケンシング技術の5プライムRACE選択を使用することをお勧めします。このアプローチにより、L1発現パターンを厳密かつ確実に特定し、定量化することができます。これは、個々のL1遺伝子座の規制と潜在的な影響をよりよく理解する道を開きます。

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