Name: rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level
Uploaded: 2019-05-19T15:00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить доктора Янь Донг для DU145 опухолевых клеток простаты. Мы хотели бы поблагодарить доктора Натана Унгерлейдера за его руководство и советы по созданию суперкомпьютерных сценариев. Некоторые из этих работ были профинансированы низ гранты R01 GM121812 для PD, R01 AG057597 к ВПБ, и 5TL1TR001418 ТЗ. Мы также хотели бы отметить поддержку от рака крестоносцев и Тулан онкологический центр биоинформатики Core.

<ol>
	<li>International Human Genome Sequencing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860 (2001).</li><li>Brouha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+L1s+account+for+the+bulk+of+retrotransposition+in+the+human+population.">Hot L1s account for the bulk of retrotransposition in the human population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).</li><li>Dombroski, B. A., Mathias, S. L., Nanthakumar, E., Scott, A. F., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+active+human+transposable+element.">Isolation of an active human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1805 (1991).</li><li>Swergold, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+characterization,+and+cell+specificity+of+a+human+LINE-1+promoter.">Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (12), 6718-6729 (1990).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Deininger, L., Batzer, M. A., Hutchison, C. A., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+genes+in+mammalian+repetitive+DNA+amplification.">Master genes in mammalian repetitive DNA amplification.</a> Trends in Genetics. 8 (9), 307-311 (1992).</li><li>Boissinot, S., Chevret, P., Furano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+(LINE-1)+Retrotransposon+Evolution+and+Amplification+in+Recent+Human+History.">L1 (LINE-1) Retrotransposon Evolution and Amplification in Recent Human History.</a> Molecular Biology and Evolution. 17 (6), 915-918 (2000).</li><li>Khazina, E., Weichenrieder, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LTR+retrotransposons+encode+noncanonical+RRM+domains+in+their+first+open+reading+frame.">Non-LTR retrotransposons encode noncanonical RRM domains in their first open reading frame.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (3), 731-736 (2009).</li><li>Martin, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+chaperone+activity+of+the+ORF1+protein+from+the+mouse+LINE-1+retrotransposon.">Nucleic acid chaperone activity of the ORF1 protein from the mouse LINE-1 retrotransposon.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (2), 467-475 (2001).</li><li>Feng, Q., Moran, M. H., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+Retrotransposon+Encodes+a+Conserved+Endonuclease+Required+for+Retrotransposition.">Human L1 Retrotransposon Encodes a Conserved Endonuclease Required for Retrotransposition.</a> Cell. 87 (5), 905-916 (1996).</li><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254 (5039), 1808 (1991).</li><li>Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+R2Bm+RNA+is+primed+by+a+nick+at+the+chromosomal+target+site:+A+mechanism+for+non-LTR+retrotransposition.">Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: A mechanism for non-LTR retrotransposition.</a> Cell. 72 (4), 595-605 (1993).</li><li>van den Hurk, J. A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+types+of+mutation+in+the+choroideremia+(CHM)+gene:+a+full-length+L1+insertion+and+an+intronic+mutation+activating+a+cryptic+exon.">Novel types of mutation in the choroideremia (CHM) gene: a full-length L1 insertion and an intronic mutation activating a cryptic exon.</a> Human Genetics. 113 (3), 268-275 (2003).</li><li>Min&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genomic+deletion+in+the+PDHX+gene+caused+by+the+retrotranspositional+insertion+of+a+full-length+LINE-1+element.">A large genomic deletion in the PDHX gene caused by the retrotranspositional insertion of a full-length LINE-1 element.</a> Human Mutation. 28 (2), 137-142 (2007).</li><li>Solyom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+orphan+transduction+created+by+a+nonreference+LINE-1+retrotransposon.">Pathogenic orphan transduction created by a nonreference LINE-1 retrotransposon.</a> Human Mutation. 33 (2), 369-371 (2012).</li><li>Hancks, D. C., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+retrotransposon+insertions+in+human+disease.+Mobile+DNA.">Roles for retrotransposon insertions in human disease. Mobile DNA.</a> Mobile DNA. 7, 9-9 (2016).</li><li>Tubio, J. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DNA+in+cancer.+Extensive+transduction+of+nonrepetitive+DNA+mediated+by+L1+retrotransposition+in+cancer+genomes.">Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes.</a> Science. 345 (6196), 1251343-1251343 (2014).</li><li>Ewing, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+somatic+L1+retrotransposition+occurs+early+during+gastrointestinal+cancer+evolution.">Widespread somatic L1 retrotransposition occurs early during gastrointestinal cancer evolution.</a> Genome Research. 25 (10), 1536-1545 (2015).</li><li>Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+elements+in+structural+variation+and+disease.">LINE-1 elements in structural variation and disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).</li><li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+individual+L1+retrotransposon+instances+is+restricted+to+cell-type+dependent+permissive+loci.">Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci.</a> eLife. 5, e13926 (2016).</li><li>Deininger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+expression+of+L1+loci.">A comprehensive approach to expression of L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 45 (5), e31-e31 (2017).</li><li>Jin, Y., Tam, O. H., Paniagua, E., Hammell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEtranscripts:+a+package+for+including+transposable+elements+in+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+datasets.">TEtranscripts: a package for including transposable elements in differential expression analysis of RNA-seq datasets.</a> Bioinformatics. 31 (22), 3593-3599 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , (2017).</li><li>Mueller, O. L., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Integrity Number (RIN) &#8211;Standardization of RNA Quality Control. , (2016).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29, 24 (2011).</li><li>Speek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+promoter+of+human+L1+retrotransposon+drives+transcription+of+adjacent+cellular+genes.">Antisense promoter of human L1 retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes.</a> Molecular Cellular Biology. 21 (6), 1973-1985 (2001).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97-97 (2009).</li><li>Iskow, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Mutagenesis+of+Human+Genomes+by+Endogenous+Retrotransposons.">Natural Mutagenesis of Human Genomes by Endogenous Retrotransposons.</a> Cell. 141 (7), 1253-1261 (2010).</li><li>Scott, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hot+L1+retrotransposon+evades+somatic+repression+and+initiates+human+colorectal+cancer.">A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer.</a> Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).</li><li>Kines, K. J., Sokolowski, M., deHaro, D. L., Christian, C. M., Belancio, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+genomic+instability+associated+with+retrotranspositionally-incompetent+L1+loci.">Potential for genomic instability associated with retrotranspositionally-incompetent L1 loci.</a> Nucleic Acids Research. 42 (16), 10488-10502 (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Была показана активность, которая вызывает генетические повреждения и нестабильность, способствующий заболеванию27,28,29. Из приблизительно 5 000 полных длины 1-х копий лишь несколько десятков эволюционно-молодых L1s составляют основную часть ретротранспозиции2. Тем не менее, есть свидетельства, что даже некоторые старые, ретропрозрачные-incompentent L1s все еще в состоянии производить ДНК повреждающих белков30. Чтобы в полной мере оценить роль L1s в нестабильности геномной и болезни, необходимо понимать экспрессию на уровне на основе локуса. Однако высокий фон последовательностей, связанных с ВЛ, инкорпорированных в другие РНК, не относящиеся к ретротранзиции, представляет собой серьезную проблему при интерпретации подлинного выражения. Еще одна проблема в выявлении и, следовательно, понимание шаблонов выражения отдельных локусов имеет место из-за их повторяющегося характера, что не позволяет много коротких последовательности чтения, чтобы составить карту к одному уникальному локуу. Чтобы преодолеть эти трудности, мы разработали описанный выше подход в определении экспрессии отдельных локусов с использованием данных РНК-Seq.
Наш подход фильтрует высокий уровень (более 99%) транскрипционного шума, образующихся из последовательностей, не имеющих отношения к «и», с помощью ряда шагов. Первый шаг включает в себя подготовку цитоплазматической РНК. Выбрав для цитоплазматической РНК, ВН-родственных считывает обнаружены в пределах выраженной интранической мРНК в ядре значительно истощены. В последовательности подготовки библиотеки, еще один шаг, чтобы уменьшить транскрипционного шума, не связанных с L1s включают в себя отбор полиаденилированных стенограммы. Это устраняет шум стенограммы, связанные с, найденной в не-мРНК видов. Еще один шаг включает в себя цепь конкретных секвенирования для выявления и устранения антисмысловой, связанных стенограммы. Использование аннотации для полнометражных L1s с функциональными промоутером регионов при определении числа РНК-seq стенограммы, что карта L1s также устраняет фоновый шум, который в противном случае происходят из усеченных L1s. Наконец, последний критический шаг в устранении транскрипционного шума в последовательности 1-1, не связанный с ретротранспозицией, является ручным курирование полнометражных L1s, идентифицированных для картографирования РНК-seq стенограммы. Ручная Курация подразумевает визуализацию каждого биоинформативно идентифицированных-к-быть-выраженных-локуса в контексте окружающей его геномной среды для подтверждения того, что выражение происходит от промоутера. Этот подход применялся к DU145, линии клеток опухоли простаты. Даже при всех шагах, связанных с подготовкой к снижению фонового шума, приблизительно 50% локусов, идентифицированных биоинформативно в DU145, были отклонены как «лоз фоновый шум», возникая из других транскрипционных источников (рис. 4), подчеркивая строгость, необходимую для получения надежных результатов. Такой подход с помощью ручного курации является трудоемким, но необходимым в развитии этого трубопровода для оценки и понимания геномной среды, окружающей всю длину. Следующие шаги включают в себя сокращение объема необходимой ручной курации путем автоматизации некоторых правил курации, хотя из-за еще не полностью известной природы геномного выражения, неаннотированных источников экспрессии в эталонных геномов, регионов с низким способность и даже усложнение факторов, связанных со строительством эталонных генома, в настоящее время невозможно полностью автоматизировать.
Вторая задача в определении выражения отдельных локусов с секвенированием относится к картографированию повторяющихся стенограмм. В этой стратегии выравнивания, требуется, чтобы Стенограмма должен выровнять уникально и со-линейно к эталон генома, чтобы быть отображены. Выбрав для парных конец последовательности, что карта конкордично, количество стенограмм, что однозначно выровнять на-локусов, найденных в эталонных генома увеличивается. Эта уникальная картографическая стратегия обеспечивает уверенность в вызове считывает отображение специально для одного локуса, хотя он потенциально недооценивает количество экспрессии каждого идентифицировано-к-быть-достоверно выраженное, повторяющееся. Чтобы приблизительно исправить эту недооценку, был разработан и применен показатель "mappability" для каждого локуса на основе его mappability и применялся к количеству однозначно отображенных транскрипта (рис. 6). Следует отметить, что в идеале, mappability должен быть забит до полного охвата читает через всю длину, в соответствии с соответствием образца WGS. Здесь мы используем WGS клеток, чтобы определить mappability баллов каждого ЛПО локусов для того, чтобы раздуть или сдувать читает отображение на лвв локусы в DU145 клеточных линий опухоли простаты. Этот расчет mappability является сырой счет коррекции, но выбранный ' полный охват mappability ' из 400 читает был определен с динамическим характером линий опухолевых клеток в виду. Это можно наблюдать в дополнительном рисунке 1, что есть несколько локусов с Неа WGS с чрезвычайно высоким числом сопоставлений читает. Эти, вероятно, исходить от дублированных последовательностей хромосом в Хела, которые не в пределах генома, который является, почему эти локусы не были выбраны, чтобы быть представителем полного охвата mappability. Вместо этого было установлено, что в среднем 100% чтения охват происходит около 400 читает в соответствии с дополнительной фигурой 1 , а затем предположил, что это среднее ОТНОСИТСЯ к DU145 опухоли клетки простаты линии, а также.
Эта стратегия выравнивания с 100-200 BP читает из РНК-seq технология также преференциально выбирает для эволюционно старше L1s в пределах генома ссылки, как пожилые L1s накопили за время уникальных мутаций, которые делают их более mappable. Такой подход, таким образом, имеет ограниченную чувствительность, когда дело доходит до выявления младшего из L1s, а также несправочные, полиморфные L1s. Чтобы определить самый молодой из L1s, мы предлагаем использовать 5 ' RACE выбор, который делает транскрипты и секвенирование технологии, такие как PacBio, которые используют больше читает21. Это позволяет более уникально составлять карту и поэтому уверенно идентификация выраженное, молодое L1s. Использование РНК-seq и PacBio подходы вместе может привести к более полный список достоверно выраженных L1s. Чтобы определить достоверно выраженное полиморфное L1s, первые следующие шаги включают в себя строительство и включение полиморфной последовательности в эталон генома.
Биологические и технические проблемы при изучении повторных последовательностей велики, хотя с вышеуказанной строгой процедурой, чтобы удалить транскрипционный шум из-за последовательностей, связанных с ретротранспозированием, используя технологию РНК-секвенирования, мы начинаем Просеивать больших уровней транскрипционного фонового шума и в том, чтобы уверенно и строго идентифицировать модели экспрессии и количество выражений на индивидуальном уровне локуса.

Ретротранспозоны являются повторяющимися элементами ДНК, которые могут "прыгать" в геноме в механизме копирования и вставки с помощью РНК-промежуточных соединений. Одно из подмножества ретротранспозонов известно как длинные вкрапленные элементы-1 (линии/L1s) и составляет шестую часть генома человека с более чем 500, 0000 копиями1. Несмотря на их изобилие, большинство из этих копий неисправны и усечены только оценочной 80-120 1 элементами, которые считаются активными2. Полноформатный 1-6 КБ в длину с 5 ' и 3 ' непереведенные регионы, внутренний промоутер и связанный анти-Sense промоутер, два не перекрывающихся рамы открытого чтения (ORFS), и сигнал и Polya хвост3,4,5 . В организме человека, L1s состоит из подсемейства отличаются эволюционным возрастом со взрослыми семьями, накопив более уникальных мутаций последовательности с течением времени по сравнению с самым молодым подсемейства, L1HS6,7. L1s являются единственными автономными, человеческими ретротранспозонами, а их Орфы кодируют обратную транскриптазы, эндонуклеазы и Рсот с РНК-обязательными и сопровождающая деятельность, необходимые для ретропереноса и вставки в геном в процессе, именуемый целевым грунтом Обратная транскрипция8,9,10,11,12.
Ретротранспозиция L1s, как сообщается, вызывает заболевания человека герминальных различными механизмами, включая инсертионал мутагенез, удалений целевого объекта, и перестановки13,14,15, 16. Недавно было предположение, что L1s может играть роль в онкогенезе и/или опухоли прогрессии, как увеличение экспрессии и вставки событий этого мутагенный элемент наблюдались в различных эпителиальных раков17,18 . Подсчитано, что есть одна новая Вставка В1 в каждые 200 рождений19. Поэтому необходимо лучше понять биологию активного выражения L1s. Повторяющаяся природа и обилие дефектных копий, найденных в транскриптах других генов, сделали этот уровень анализа сложным.
К счастью, с появлением высоких технологий секвенирования пропускной способности, были предприняты шаги, чтобы разобрать и определить достоверно выражать L1s на определенном уровне локуса. Существуют различные философии о том, как лучше определить выраженные L1s с использованием РНК следующего поколения секвенирования. Было предложено только два разумных подхода для отображения стенограмм на уровне локуса на специфическую. Один фокусируется только на потенциальной транскрипции, которая читает через сигнал Л1 полиаденилирования и в фланговые последовательности20. Наш подход использует небольшие различия последовательностей между 1-е элементами и только сопоставляет эти РНК-seq считывает, что однозначно карта к одному локуу21. Оба этих метода имеют ограничения в плане квантации уровней стенограммы. Квантация может быть улучшена потенциально путем добавления коррекции для «уникальной mappability» каждого локуса21, или с использованием более сложных алгоритмов, которые перераспределяют несколько сопоставленных считывает, которые не могут быть однозначно отображены на конкретный Локус22. Здесь мы будем подробно в шаг за шагом образом РНК экстракции и следующего поколения секвенирования и протокола Биоинформатика для идентификации выраженных уровней на уровне Локус-специфического. Наш подход имеет максимальное преимущество в знании биологии функциональных элементов. Это включает в себя знание того, что функциональные элементы, которые должны быть получены от промоутера, инициированного в начале «в», должны быть переведены в цитоплазму и их Транскрипты должны быть линейными с геном. Кратко, мы собираем свежие, цитоплазматические РНК, выбрать для полиаденилированных стенограммы, и использовать пряди-специфические РНК-seq анализы однозначно карта читает до Л1 локусов в человеческой ссылкой генома. Эти выровнены читает то по-прежнему требуют обширного ручного курации, чтобы определить, если Стенограмма читает исходят от а. а. промоутер до обозначения локус, как достоверно выраженное. Мы применяем этот подход на образец линии клеток опухоли предстательной железы DU145, чтобы продемонстрировать, как он идентифицирует относительно мало активно транскрибированные членов из массы неактивных копий.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bedtools.26.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/installation.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bowtie-0.12.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/0.12.8/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>BBI-8541906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV 2.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mac2unix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/cs-cmdtools/files/mac2unix/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse later solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>samtools-1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/samtools/files/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sratoolkit.2.9.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna next-generation sequencing and a bioinformatics pipeline to identify expressed line-1s at the locus-specific level

Длинные вкрапленные элементы-1 (линии/L1s) являются повторяющимися элементами, которые могут копировать и произвольно вставлять в геном, что приводит к нестабильности генома и мутагенеза. Понимание мимических паттернов на индивидуальном уровне придаст пониманию биологии этого мутагенном элемента. Этот автономный элемент составляет значительную часть генома человека с более чем 500 000 копиями, хотя 99% являются укороченным и дефектным. Однако, их обилие и доминантное количество дефектных копий делает его трудным определить достоверно выраженные L1s от связанных с ним последовательностей, выраженных как часть других генов. Также сложно определить, какой специфический Локус выражен в связи с повторяющимся характером элементов. Преодолевая эти трудности, мы представляем биоинформатический подход РНК-seq для определения экспрессии на уровне в локусе определенного уровня. Таким образом, мы собираем цитоплазматические РНК, выбрать для полиаденилированных стенограммы, и использовать пряди-специфические РНК-seq анализы однозначно карта читает до Л1 локусов в человеческой ссылкой генома. Мы визуально курируем каждый Локус с уникально сопоставлениями для подтверждения транскрипции от своего собственного промоутера и корректируем отображенных стенограммы читает для учета mappability каждого отдельного локуса. Этот подход был применен к линии клеток опухоли простаты, DU145, чтобы продемонстрировать способность этого протокола, чтобы обнаружить выражение из небольшого числа полноформатный.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level at JoVE.com

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

РНК секвенирования следующего поколения и трубопровод биоинформатики для идентификации выраженных линий-1S на уровне Локус

Здесь мы представляем биоинформатический подход и анализы, чтобы определить выражение линии-1 на определенном уровне локуса.

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

Мобильные элементы являются одним из основных источников генетической нестабильности человека. Понимание их экспрессии в различных тканях и условиях имеет решающее значение для понимания их влияния на геном. Обширные L1 стенограммы являются результатом пассивного включения L1 связанных последовательностей в других стенограммах, которые не играют никакой роли в жизненном цикле L1.Наш подход устраняет этот нерелевантный фон. Этот протокол может быть адаптирован к исследованиям любого мобильного элемента или даже вирусов в любом геноме последовательности. Там должно быть по крайней мере некоторые изменения последовательности, чтобы дискриминация между локусами.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для иллюстрации строгости и заботы, необходимых для уверенного выявления выраженных повторяющихся элементов L1 на уровне локуса. Начните эту процедуру с цитоплазмической извлечения РНК и секвенирования следующего поколения, как описано в текстовом протоколе. При выборе цитоплазмической РНК, L1 связанных читает найти в выраженных итронных мРНК в ядре значительно исчерпаны.В подготовке библиотеки секвенирования еще один шаг, предпринятый для уменьшения транскрипционных шумов, не связанных с L1s включает в себя выбор полиаденилатных стенограмм. Это удаляет L1 связанных с транскрипцией шума, найденного в не-мРНК видов. Вы запустите парадигму выравнивания секвенирования файлов FAST с образцом RNA seq, представляющим интерес, используя bowtie1, введя командную строку в терминале Linux.Эта стратегия выравнивания требует, чтобы стенограммы были уникальными и collinearly выровнены с исчерпывающим геномным поиском. Эта стратегия обеспечивает уверенность в вызове читает отображение конкретно на один локус L1. Strand отделить выходные файлы BAM Использование SAMtools и Linux команды, чтобы выбрать для верхней нити и нижней нити.Обратите внимание, что фактические значения флага могут варьироваться, если не использовать стандартные протоколы последовательности следующего поколения. Этот шаг разделения нити работает, чтобы отфильтровать транскрипционные шум, генерируемый в L1 последовательностей, которые не связаны с L1 ретротранспозиции путем устранения потенциальных антисенс L1 связанных отображенных читает. Создание чтения рассчитывает против аннотации для L1 локусов с помощью bedtools.Первый тип командной строки для генерации чтения рассчитывает на L1s в смысле направления на верхней нити, а затем ввените командную строку для создания чтения рассчитывать на L1s в смысле направления на нижней нити. Аннотации, используемые для идентификации L1s обозначают полную длину L1s с функциональными регионами промоутера, которые работают, чтобы устранить фоновый шум, который в противном случае происходит от усеченных L1s. Создайте электронную таблицу для чтения, отображенного на каждый аннотированный локус L1.Копия над сгенерированным считывому тексту файлу, который был создан для нижней нити, и помечтируйте страницу как minus_bottom. Сортировать все столбцы на основе от самого высокого до наименьшего числа читает найти в столбце J.Copy над сгенерированных читать рассчитывает текстовый файл, который был создан для верхней нити. Сортировать все столбцы на основе от самого высокого до наименьшего числа читает найти в столбце J.And пометить страницу как top_plus.Создайте третью страницу, помеченную как объединенная, и добавьте все локусы с 10 или более minus_bottom и plus_top страниц. Сортировать все столбцы на основе самого высокого и наименьшего числа считывания, найденных в столбце J.To помочь mappability геномных регионов, в частности, в или вблизи L1 локусов, весь геном в паре и секвенирования файлов видов, представляющих интерес были загружены из NCBI и преобразованы в файлы FAST, как описано в текстовом протоколе. Теперь индексировать файлы BAM, чтобы сделать их для просмотра в интегративной геномики Viewer, сокращенно IGV, перед загрузкой файлов.В IGV загружают эталонный геном, представляющий интерес для визуализации аннотированных генов. Также загрузите файл аннотации для элементов L1 полной длины, чтобы визуализировать аннотацию L1, файл BAM для экспрессии РНК человека, чтобы визуализировать отображенные стенограммы из образца, представляющий интерес, и файл BAM для mappability генома человека для оценки mappability геномных областей. Удалите строки покрытия и соединения, связанные с каждым файлом BAM.Сжать файлы BAM для экспрессии РНК человека и для mappability генома человека, так что все IGV треки подходят на одном экране. Последним важным шагом в устранении транскрипционных шумов последовательностей L1, не связанных с ретротранспозицией L1, является ручное создание полноформатных L1, которые, как было установлено, нанесли на карту стенограммы поиска РНК. Ручное кураторирование включает визуализацию каждого выраженного локуса L1 в контексте окружающей его геномной среды, чтобы подтвердить, что выражение происходит от промоутера L1.Используя координаты локусов L1, перечисленные на комбинированной странице таблицы, вручную курируют каждый локус L1 с уникальными картографами, изучая окружающую геномную среду в IGV. Курировать локус, чтобы быть достоверно выражены покинуть свои собственные, если Есть нет читает вверх по течению в направлении L1 до пяти килобазы. Этикетка строки зеленого цвета и обратите внимание, почему это достоверно выраженный L1. Исключение из этого правила существует, если область вверх по течению L1 не является mappable.Если это так, отметь строку красным цветом и отметить, что выражение региона вверх по течению от L1 промоутер не может быть оценена, и поэтому выражение L1 не может быть уверенно определены. Курировать локус, чтобы не быть достоверно выражены покинуть свой собственный промоутер, если Есть читает вверх по течению до пяти килоба баз. Этикетка строки красного цвета и обратите внимание, почему это не достоверно выраженный L1. Курировать локус как ложный, если он выражается в интроне выраженного гена в том же направлении, с читает вверх по течению L1, если он находится ниже по течению от выраженного гена в том же направлении с читает вверх по течению L1, или для неанотации выражения моделей с читает вверх по течению L1. Исключение из этого правила применяется, когда есть минимальные чтения непосредственно перекрывающихся L1 промоутер стартовый сайт, но немного вверх по течению от L1. Если нет других читает вверх по течению случае L1, как это, считают, что это L1 быть достоверно выражены.Этикетка строки зеленый и обратите внимание, почему это достоверно выраженный L1. Курировать L1 локус, как вероятно, будет ложным, если шаблон отображенных читает локус не коррелируют с конкретными регионами L1 mappability. Если L1 очень mappable, но только имеет кучу читает в сжатом регионе в L1, это менее вероятно, будет связано с L1 выражение от своего собственного промоутера и, скорее всего, будет из неот аннотированных источников, как exons или LTRs. В таких случаях, курировать локусы, как оранжевый и обратите внимание, почему локус является подозрительным.Проявите источники подозрительных свай, проверив местоположение L1 в браузере генома UCSC. Курировать локус, чтобы не быть достоверно выражены, если он находится в геномной среде спорадически выраженных не аннотированных регионов. Чтения могут быть выражены 10 килобазы вверх по течению от L1. Но каждые 10 килобазы или около того, Есть на карте читает и некоторые из этих читает согласовать с L1. Эти L1, вероятно, нанесли на карту чтения из-за неанотации моделей геномного выражения.В таких случаях, курировать локусы, как красный и обратите внимание, почему локус является подозрительным. Для оказания помощи mappability каждого L1 локусы определить количество однозначно отображены читает L1 локусов с помощью программы bedtools, FL-L1 аннотации и выровнены геномной последовательности данных. Назначить L1 локус, чтобы иметь полное покрытие mappability, когда 400 уникальных читает выровнены к нему.Определите фактор, необходимый для масштабирования вверх или вниз геномной ДНК выровнены читает до 400 для каждого человека L1. Чтобы иметь масштабированную меру выражения в соответствии с отдельными L1 локус mappability, умножить фактор на количество РНК стенограммы читает, что выровнять с индивидуальными достоверно выраженные L1s. Каждый шаг используется для выделения различий между элементами L1, выраженными от их собственного промоутера, и всеми способами, которыми элементы L1 могут быть включены в другие стенограммы, которые не связаны с жизненным циклом L1. Показано здесь стенограмма гласит, что карта однозначно по всей длине нетронутыми L1s в геноме человека, выраженных в DU145 опухолевых клеток линии.В черном — это специфические локусы, идентифицированные как подлинно выраженные после ручного кураторства. И в красном являются конкретные локусы отклонены как достоверно выраженные читает после ручного кураторства. В серых локусы с менее чем 10 читает отображение для каждого.Поскольку эти локусы представляют собой небольшую часть стенограммы читает, они не были вручную куратором. Приблизительно 4500 локусов не отображаются графически, так как они имеют нулевой отображенный читает. После ручного кураторства, количество читает, что карта однозначно достоверно выражены конкретные L1 локусов в DU145 диапазоне от 175 читает произвольно выбранный минимум отрезать 10 читает.После того, как чтения были скорректированы для оценки mappability в каждом локусе, квантиция для выражения для большинства локусов увеличилась. Количество считывания, наносимых исключительно на достоверно выраженные специфические локусы L1 с коррекцией mappability в DU145, варьировалось от 612 до четырех считывания, а также было переупорядочено от самого высокого до самого низкого выражения локусов. Каждый шаг играет решающую роль в снижении высокого уровня транскрипционные фоновый шум.Тем не менее, наиболее важным шагом является ручное кураторирование каждого L1 локуса, чтобы подтвердить транскрипцию его собственного промоутера. Приблизительно 50% локусов L1, идентифицированных биоинформативно в клетках DU145, были отвергнуты как фоновый шум L1, исходящий из других транскрипционных источников, подчеркивая строгость, необходимую для получения надежных результатов. Чтобы определить самого молодого из L1s, мы предлагаем использовать пяти-премьер RACE выбор L1 стенограммы и технологии секвенирования, как PacBio, которые используют более длинные чтения и позволяет более уникальное отображение.При этом подходе мы можем строго и уверенно выявлять и количественно определять модели выражения L1. Это прокладывает путь к лучшему пониманию регулирования отдельных локусов L1 и потенциального воздействия.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA Repair and Recombination

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Оптимизация и сравнительный анализ методов обогащения органической ДНК растений, подходящих для последующей последовательности следующего поколения

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Секвенирование нового поколения и биоинформатики трубопровода для оценки генетических детерминант конституционных болезни

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Биоинформатика трубопровод точно и эффективно анализировать microRNA транскриптомы в растениях

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Полный трубопровод для изоляции и секвенирования микроРНК и анализа их с помощью инструментов с открытым исходным кодом

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...