Name: a double humanized blt-mice model featuring a stable human-like gut microbiome and human immune system
Uploaded: 2019-08-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System at JoVE.com

Ringraziamo Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu per la loro assistenza nella generazione di topi umanizzati con BLT. Vorremmo riconoscere l'UNMC Genomics Core Facility che riceve un supporto parziale dal Nebraska Research Network In Genomica Funzionale NE-INBRE P20GM103427-14, La Biologia Molecolare dei Sistemi Neurosensoriali CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center - P30CA036727, Il Centro per l'innovazione radicale e rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e l'iniziativa di ricerca del Nebraska. Ringraziamo l'Università del Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex e il loro staff per la loro assistenza. Questo studio è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li.  I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella preparazione del manoscritto o nella decisione per la pubblicazione.

Tutti i metodi qui descritti sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali (IACUC) presso l'Università del Nebraska-Lincoln (UNL). L'IACUC all'UNL ha approvato due protocolli relativi alla generazione e all'utilizzo di topi hu-BLT, tra cui i doppi hu-topi. Inoltre, il Comitato di supervisione della ricerca scientifica (SROC) dell'UNL ha anche approvato l'uso di cellule staminali embrionali umane e tessuti fetali, che vengono acquistati dalle risorse bi...

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	<li>Simpson-Abelson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+and+expansion+of+tumor-derived+memory+T+cells+following+the+implantation+of+non-disrupted+pieces+of+human+lung+tumor+into+NOD-scid+IL2R+gamma(null)+mice.">Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice.</a> Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).</li><li>Bankert, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mouse+Model+of+Ovarian+Cancer+Recapitulates+Patient+Solid+Tumor+Progression,+Ascites+Formation,+and+Metastasis.">Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Vudattu, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+as+a+Model+for+Aberrant+Responses+in+Human+T+Cell+Immunotherapy.">Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy.</a> Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).</li><li>Whitfield-Larry, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2+Matched+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+From+Type+1+Diabetic+Patients,+but+Not+Nondiabetic+Donors,+Transfer+Insulitis+to+NOD-scid/gamma+c(null)/HLA-A2+Transgenic+Mice+Concurrent+With+the+Expansion+of+Islet-Specific+CD8(+)+T+cells.">HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells.</a> Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).</li><li>Yi, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Vaccine+Protects+Human+Immune+Cells+against+Zika+Virus+Infection+in+Humanized+Mice.">A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice.</a> EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).</li><li>Stary, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucosal+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+generates+two+waves+of+protective+memory+T+cells.">A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells.</a> Science. 348 (6241), (2015).</li><li>Sun, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarectal+transmission,+systemic+infection,+and+CD4(+)+T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1.">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).</li><li>Wang, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized-BLT+mouse+model+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+infection.">Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).</li><li>Ernst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+infectious+diseases.">Humanized mice in infectious diseases.</a> Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gopalakrishnan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome+modulates+response+to+anti-PD-1+immunotherapy+in+melanoma+patients.">Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients.</a> Science. 359 (6371), 97-103 (2018).</li><li>Routy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome+influences+efficacy+of+PD-1-based+immunotherapy+against+epithelial+tumors.">Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors.</a> Science. 359 (6371), (2018).</li><li>Clemente, J. 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P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+human+intestinal+flora+on+germ-free+mice.">Effects of the human intestinal flora on germ-free mice.</a> Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).</li><li>Hansen, C. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Early+Gut+Colonization+Shape+Future+Immune+Responses+of+the+Host.">Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host.</a> PLoS One. 7 (3), (2012).</li><li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus/liver+and+CD34(+)+cell+transplantation.">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li><li>Li, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Initiation+of+Antiretroviral+Therapy+Can+Functionally+Control+Productive+HIV-1+Infection+in+Humanized-BLT+Mice.">Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice.</a> Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).</li><li>Brainard, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Robust+Cellular+and+Humoral+Virus-Specific+Adaptive+Immune+Responses+in+Human+Immunodeficiency+Virus-Infected+Humanized+BLT+Mice.">Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice.</a> Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).</li><li>Greenblatt, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+versus+Host+Disease+in+the+Bone+Marrow,+Liver+and+Thymus+Humanized+Mouse+Model.">Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model.</a> PLoS One. 7 (9), (2012).</li><li>Hintze, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+scope+method+for+creating+humanized+animal+models+for+animal+health+and+disease+research+through+antibiotic+treatment+and+human+fecal+transfer.">Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer.</a> Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).</li><li>Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. 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H., Fleming, E., Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+colonization+ability+of+human+fecal+microbes+in+different+mouse+gut+environments.">Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments.</a> ISME J. , (2018).</li><li>Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-treated+versus+germ-free+rodents+for+microbiota+transplantation+studies.">Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies.</a> Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).</li><li>Wos-Oxley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+establishing+a+human+gut+microbial+community+within+rodent+models.">Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models.</a> Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).</li></ol>

Il protocollo qui descritto è per la creazione di topi a doppia hu-BLT che presentano sia un sistema immunitario umano funzionale che un microbioma intestinale stabile simile all'uomo. Questo protocollo può essere adattato ad altri modelli di topi umanizzati o non umanizzati senza la necessità di animali GF e strutture gnotobiotiche. Mentre i metodi qui descritti sono relativamente semplici, ci sono diversi dettagli critici che sono importanti per la creazione di successo di topi a doppia hu-BLT. I topi NSG sono estre...

Topi umanizzati (hu-topi) hanno trasformato lo studio di molti aspetti della salute umana e della malattia tra cui ematopoiesi, immunità, e malattie infettive1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Questi hu-topi hanno il netto vantaggio rispetto ad altri modelli murini in quanto hanno un sistema immunitario umano funzionale e possono essere infettati da patogeni specifici umani. Tuttavia, l'importanza del microbioma intestinale è stata dimostrata dal suo ruolo in molte malattie umane come l'obesità, la sindrome metabolica, le malattie infiammatorie e il cancro10,11,12, 13. Il sistema immunitario mucosale e il microbioma intestinale sono reciprocamente regolati per mantenere l'omeostasi intestinale e sistemica. Il sistema immunitario è modellato da antigeni presentati dal microbioma intestinale e reciprocamente il sistema immunitario svolge un importante ruolo regolatore nella promozione dei batteri intestinali commensale ed eliminazione degli agenti patogeni14,15, 16.Tuttavia, il microbioma intestinale dei topi hu non è stato ben caratterizzato e il microbioma intestinale murino differisce sostanzialmente nella composizione e nella funzione degli esseri umani17. Ciò è dovuto alle differenze evolutive, fisiologiche e anatomiche tra il murino e l'intestino umano, nonché ad altri fattori importanti come la dieta, che possono influenzare i risultati sperimentali dei modelli di malattia hu-mice18. Pertanto, al di là della classificazione del microbioma intestinale murino dei topi hu, è necessario un modello animale caratterizzato sia da un sistema immunitario umano che da un microbioma intestinale umano per studiare le complesse interazioni della malattia umana in vivo.
Lo studio delle malattie umane direttamente nei soggetti umani è spesso impraticabile o non etico. Molti modelli animali non possono essere utilizzati per studiare patogeni umani come il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). I modelli di primati non umani sono geneticamente obsoleti, molto costosi e non sono soggetti a molti patogeni umani. I topi che sono stati derivati come germi liberi (GF) e ricostituiti con microbiomi intestinali simili a come esseri umani sono stati ampiamente utilizzati per studiare la salute umana e la malattia19,20. Tuttavia, questi animali non hanno un sistema immunitario umano e lavorare con gli animali GF richiede strutture specializzate, procedure e competenze. Pertanto, vi è la necessità di migliori modelli preclinici per studiare la complessa relazione del microbioma intestinale e del sistema immunitario umano. Molti ceppi di topi, come NOD. Cg-Prkdcha recitatoIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), non sono disponibili in commercio come GF. Gli animali GF possono anche soffrire di carenze immunitarie di lunga durata che non sono completamente invertite dall'innesto dei microbi21. Pertanto, abbiamo creato un doppio hu-topi caratterizzato sia da un sistema immunitario umano funzionale che da un microbioma intestinale umano stabile in condizioni specifiche di senza patogeni (SPF). Per generare topi a doppio toro, è stato eseguito un intervento chirurgico su topi NSG per creare midollo osseo, fegato, timo mumanizzato topi (hu-BLT). I topi hu-BLT sono stati poi trattati con antibiotici ad ampio spettro e poi sottoposti a trapianti fecali con un campione di donatori umani sano. Abbiamo caratterizzato il microbioma intestinale batterico di 173 campioni fecali di 45 topi a doppio hu-BLT e 4 campioni di donatori fecali umani. I topi a doppia to-BLT hanno profili genici di rRNA 16S unici basati sul campione di donatore umano singolo che viene trapiantato. È importante sottolineare che il microbioma umano trapiantato è rimasto stabile nei topi per tutta la durata dello studio fino a 14,5 settimane dopo il trapianto. Inoltre, i metagenomi previsti hanno mostrato che i topi a doppio hu-BLT hanno una capacità funzionale prevista diversa rispetto ai topi umani che è più simile ai campioni di donatori umani.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Animal Feeding Needles 18G</td>
			<td style="width:225px;">Cadence Science</td>
			<td style="width:103px;">9928B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Clidox-s Activator</td>
			<td style="width:225px;">Pharmacal Research Laboratories</td>
			<td style="width:103px;">95120F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Clidox-s Base</td>
			<td style="width:225px;">Pharmacal Research Laboratories</td>
			<td style="width:103px;">96125F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DGM 108 cage rack</td>
			<td style="width:225px;">Techniplast</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Flat Brown Grocery Bag 3-5/8&#34;D x 6&#34;W x 11-1/16&#34;L&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Grainger</td>
			<td style="width:103px;">12R063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FMT Upper Delivery Microbiota Preparations&#160;</td>
			<td style="width:225px;">OpenBiome</td>
			<td style="width:103px;">FMP30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Grape Kool-Aid</td>
			<td style="width:225px;">Kraft Foods Inc.</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD19-PE/Cy5</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">302209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD3-PE</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD4-Alexa 700</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD45-FITC</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD8-APC/Cy7</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">301016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Lactate Buffered Ringer&#39;s Solution</td>
			<td style="width:225px;">Boston BioProducts Inc&#160;</td>
			<td style="width:103px;">PY-906-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">mCD45-APC</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Microvette 100 K3E</td>
			<td style="width:225px;">Microvette</td>
			<td style="width:103px;">20.1278.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment</td>
			<td style="width:225px;">Neosporin</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)</td>
			<td style="width:225px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:103px;">005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">PrecisionGlide 25 G Needle</td>
			<td style="width:225px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">RS200 X-ray irradiator</td>
			<td style="width:225px;">RAD Source Technologies</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sealsafe Plus GM500 microisolator cages</td>
			<td style="width:225px;">Techniplast</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile Non-woven Gauze</td>
			<td style="width:225px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:103px;">22-028-558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Teklad global 16% protein irradiated mouse chow</td>
			<td style="width:225px;">Teklad</td>
			<td style="width:103px;">2916</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a double humanized blt-mice model featuring a stable human-like gut microbiome and human immune system

I topi umanizzati (topi arabi) che caratterizzano un sistema immunitario umano funzionale hanno cambiato radicalmente lo studio dei patogeni umani e delle malattie. Possono essere utilizzati per modellare malattie che sono altrimenti difficili o impossibili da studiare nell'uomo o in altri modelli animali. Il microbioma intestinale può avere un profondo impatto sulla salute umana e sulle malattie. Tuttavia, il microbioma intestinale murino è molto diverso da quello trovato negli esseri umani.  È necessario migliorare i modelli di hu-top preclinici che hanno un microbioma intestinale umano innestato. Pertanto, abbiamo creato due hu-topi che presentano sia un sistema immunitario umano che un microbioma intestinale umano stabile. fare cenno col capo. I topi Cg-PrkdcScidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sono uno dei migliori animali per l'umanizzazione a causa del loro alto livello di immunodeficienza. Tuttavia, i topi NSG privi di germi e vari altri importanti modelli di topi privi di germi non sono attualmente disponibili in commercio. Inoltre, molte impostazioni di ricerca non hanno accesso a strutture gnotobiotiche, e lavorare in condizioni gnotobiotiche può spesso essere costoso e richiede molto tempo. È importante sottolineare che i topi privi di germi hanno diverse carenze immunitarie che esistono anche dopo l'innesto di microbi. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo che non richiede animali privi di germi o strutture gnotobiotiche. Per generare topi a doppio toro, i topi NSG sono stati trattati con radiazioni prima dell'intervento chirurgico per creare midollo osseo, fegato, topi timo-umanizzati (hu-BLT). I topi sono stati poi trattati con antibiotici ad ampio spettro per esaurire il microbioma dell'intestino murino preesistente. Dopo il trattamento antibiotico, i topi sono stati sottoposti a trapianti fecali con campioni di donatori umani sani tramite gavage orale. I topi a doppio hu-BLT avevano profili genetici di rRNA 16S unici basati sul campione di donatore umano singolo che è stato trapiantato. È importante sottolineare che il microbioma umano trapiantato è rimasto stabile nei topi a doppio hu-BLT per tutta la durata dello studio fino a 14,5 settimane dopo il trapianto.

La figura 1 mostra un contorno dei metodi utilizzati per creare topi a doppia hu-BLT e descrive brevemente il processo di aggiunta di un sistema immunitario umano funzionale e di un microbioma intestinale umano stabile ai topi NSG. La figura 2 mostra un esempio di analisi della citometria di flusso del sangue periferico da un topo BLT umanizzato 10 settimane dopo l'intervento chirurgico. La figura 3 mostra l'abbondanza relativa dei ...

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A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System

Descriviamo un nuovo metodo per generare doppi topi BLT umani umani umani che presentano un sistema immunitario umano funzionale e un microbioma intestinale innestato stabile. Questo protocollo può essere seguito senza la necessità di topi privi di germi o strutture gnotobiotiche.

Un modello di topi BLT a doppia umanizzata caratterizzato da un microbioma intestinale umano stabile e un sistema immunitario umano

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be ...

Il nostro protocollo è significativo, perché può essere utilizzato per creare riproducibilmente topi con un microbioma intestinale umano e un sistema immunitario umano. Chiamiamo questi topi, doppi topi umanizzati. Il modello a doppio topo umanizzato può essere utilizzato sia per la ricerca biomedica di base che traslazionale, incluso lo studio delle relazioni in vivo tra il microbioma intestinale umano e il sistema immunitario umano.A dimostrare la procedura saranno Jianshui Zhang, un postdoc, e Yilun Chang, un dottorando del nostro laboratorio. Per impiantare i tessuti del fegato e del timo nella capsula renale sinistra, per prima cosa, posizionare il mouse in un cappuccio. Il giorno dell'intervento chirurgico, trattare i topi con irradiazione subletale per tutto il corpo a 12 centigray per grammo di dose di peso corporeo.Radere ogni mouse attorno al lato laterale sinistro e mediale dopo aver confermato un livello appropriato di sedazione. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale e applicare un marchio auricolare in base alle esigenze. Disinfettare la pelle con tre iodio sequenziale e scrub isopropanolo al 70%.Una volta che la pelle è stata predisposta, utilizzare le forcelle per caricare da uno a sei millimetri di frammento di tessuto fetico fetale umano a cubetti in un trocar, seguito da un frammento di tessuto di timo fetale umano a cubetti da uno a 1,6 millimetri. Utilizzare le forcep per sollevare la pelle e utilizzare un bisturi per fare un piccolo taglio longitudinale nella pelle. Estendere il taglio a 1,5 a due centimetri sul lato sinistro del mouse.E usa le forcep per sollevare lo strato muscolare. Utilizzare le forbici per aprire lo strato muscolare longitudinalmente, estendendo il taglio se necessario per esporre il rene e afferrare delicatamente il tessuto adiposo che circonda il rene. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione da uno a due millimetri all'estremità posteriore della capsula renale e inserire lentamente il trocar precaricato nell'incisione parallela al lungo asse del rene.Rilasciare i tessuti tra la capsula renale e il rene e riportare il rene e l'intestino nelle loro posizioni normali. Quindi, usa le suture per chiudere lo strato muscolare e le graffette chirurgiche per chiudere la pelle. Posizionare il mouse in una gabbia di microisolatore autoclavato con monitoraggio fino alla completa reclinabilità.Sei ore dopo l'intervento, posizionare i topi sotto una lampada termica e disinfettare le code con il 70% di isopropanolo. Iniettare da 1,5 a cinque volte da 10 a cinque CD34 positivo tessuto fetico fetale umano isolato cellule staminali emopoietiche in 200 microlitri di PBS in una vena di coda dilatata per animale. Quindi fermare qualsiasi sanguinamento con una leggera pressione e riportare i topi nella loro gabbia di casa.Da nove a 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, utilizzare un sistema di ritenuta per pettine di plastica di dimensioni appropriato per isolare una gamba di un topo umanizzato e spruzzare il lato mediale della gamba isolata con il 70% di isopropanolo. Stendere unguento antibiotico e antidolorifici nel sito di raccolta. Utilizzando un ago calibro 25 tenuto con un angolo di 90 gradi, forare la vena safenosa per raccogliere da 50 a 100 microlitri di sangue in un tubo di raccolta del sangue rivestito di EDTA.Quando è stato ottenuto un volume adeguato di sangue, applicare pressione sul sito con un pezzo sterile di garza per fermare il sanguinamento prima di riportare il mouse nella sua gabbia. Quindi utilizzare il campione di sangue periferico raccolto per valutare il livello di ricostituzione delle cellule immunitarie umane mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi contro CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 e CD45 del mouse. Per la raccolta di campioni fecali freschi, posizionare i singoli sacchetti di carta autoclavati in un cappuccio dei fumi e posizionare un mouse in ogni sacchetto fino a quando ogni animale non defeca.Quindi riportare i topi nella loro gabbia e utilizzare forcep sterili per trasferire ogni campione fecale in un tubo da 1,5 millilitri per topo per meno 80 gradi Celsius. Alla fine del trattamento antibiotico di 14 giorni, cambiare l'acqua potabile in acqua sterilizzata autoclavata e trasferire i topi in una nuova gabbia autoclavata. 24 e 48 ore dopo la cessazione degli antibiotici scongelano fonti adeguatamente preparate di materiale da trapianto di microbiota fecale e aliquotano i campioni in una camera anaerobica in condizioni anaerobiche.Per eseguire un trapianto fecale, consegnare 200 microlitri di materiale da trapianto di microbiota fecale tramite gavage orale a ciascun animale sperimentale e diffondere qualsiasi materiale disgelato rimanente sulla pelliccia di topi umanizzati o sulla lettiera della gabbia. Qui viene mostrato un esempio di analisi citometrica del flusso del sangue periferico da un topo BLT umanizzato 10 settimane dopo l'intervento chirurgico. Le popolazioni cellulari T e B possono essere identificate, così come i sottoinsiemi di cellule T positive CD4 e CD8.In questo grafico si può osservare l'abbondanza relativa dei campioni di donatori fecali umani utilizzati per trasferire un microbioma intestinale per creare doppi topi umanizzati. Le modifiche fenotipiche alla milza e al cieco indotte dal trattamento antibiotico sono simili a quelle osservate negli animali senza germi. Questo grafico di analisi dei componenti principali dei dati rappresentativi di sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S rivela che i doppi topi umanizzati hanno microbiomi intestinali simili all'uomo che sono unici per il campione di donatore umano.L'aspetto più critico di questo protocollo è limitare l'introduzione di batteri indesiderati per garantire che i topi rimangano sani e mantengano il microbioma intestinale umano. Questo modello ha il potenziale per far progredire la medicina personalizzata e per permetterci di esaminare come la malattia umana influisce sul microbioma intestinale controllando al contempo altri fattori attenuanti.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Ricerca

Biochimica

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Analisi e specificazione delle distribuzioni delle dimensioni dei granuli di amido

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...