Name: a double humanized blt-mice model featuring a stable human-like gut microbiome and human immune system
Uploaded: 2019-08-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu por sua ajuda na geração de camundongos humanizados por BLT. Gostaríamos de reconhecer a UNMC Genomics Core Facility que recebe apoio parcial da rede de pesquisa Nebraska em genômica funcional NE-INBRE P20GM103427-14, a biologia molecular dos sistemas Neurosensoriais CoBRE P30GM110768, o Fred & Pamela Centro do cancer de Buffett-P30CA036727, o centro para a inovação da raiz e do Rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e a iniciativa da pesquisa de Nebraska. Gostaríamos de agradecer à Universidade de Nebraska-Lincoln Life Sciences anexo e seus funcionários para a sua assistência. Este estudo é apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde (NIH) concede R01AI124804, R21AI122377-01, p30 MH062261-16A1 infecção por HIV crônica e envelhecimento em neuroaids (cadeia) centro, 1R01AI111862 para Q li.  Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, preparação do manuscrito ou decisão de publicação.

Todos os métodos aqui descritos foram conduzidos de acordo com os protocolos institucionais de assistência animal e de pesquisa (IACUC) aprovados na Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL). O IACUC na UNL aprovou dois protocolos relacionados à geração e utilização de camundongos Hu-BLT, incluindo ratos duplos Hu. Adicionalmente, o Comitê de supervisão de pesquisa científica (SROC) da UNL também aprovou o uso de células-tronco embrionárias humanas e tecidos fetais, que são adquiridos dos recursos avançados d...

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	<li>Simpson-Abelson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+and+expansion+of+tumor-derived+memory+T+cells+following+the+implantation+of+non-disrupted+pieces+of+human+lung+tumor+into+NOD-scid+IL2R+gamma(null)+mice.">Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice.</a> Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).</li><li>Bankert, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mouse+Model+of+Ovarian+Cancer+Recapitulates+Patient+Solid+Tumor+Progression,+Ascites+Formation,+and+Metastasis.">Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Vudattu, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+as+a+Model+for+Aberrant+Responses+in+Human+T+Cell+Immunotherapy.">Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy.</a> Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).</li><li>Whitfield-Larry, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2+Matched+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+From+Type+1+Diabetic+Patients,+but+Not+Nondiabetic+Donors,+Transfer+Insulitis+to+NOD-scid/gamma+c(null)/HLA-A2+Transgenic+Mice+Concurrent+With+the+Expansion+of+Islet-Specific+CD8(+)+T+cells.">HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells.</a> Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).</li><li>Yi, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Vaccine+Protects+Human+Immune+Cells+against+Zika+Virus+Infection+in+Humanized+Mice.">A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice.</a> EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).</li><li>Stary, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucosal+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+generates+two+waves+of+protective+memory+T+cells.">A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells.</a> Science. 348 (6241), (2015).</li><li>Sun, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarectal+transmission,+systemic+infection,+and+CD4(+)+T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1.">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).</li><li>Wang, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized-BLT+mouse+model+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+infection.">Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).</li><li>Ernst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+infectious+diseases.">Humanized mice in infectious diseases.</a> Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gopalakrishnan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome+modulates+response+to+anti-PD-1+immunotherapy+in+melanoma+patients.">Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients.</a> Science. 359 (6371), 97-103 (2018).</li><li>Routy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome+influences+efficacy+of+PD-1-based+immunotherapy+against+epithelial+tumors.">Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors.</a> Science. 359 (6371), (2018).</li><li>Clemente, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Microbiota+and+the+Immune+System.">Interactions Between the Microbiota and the Immune System.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).</li><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. 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A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Diet+on+the+Human+Gut+Microbiome:+A+Metagenomic+Analysis+in+Humanized+Gnotobiotic+Mice.">The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice.</a> Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).</li><li>Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+human+intestinal+flora+on+germ-free+mice.">Effects of the human intestinal flora on germ-free mice.</a> Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).</li><li>Hansen, C. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Early+Gut+Colonization+Shape+Future+Immune+Responses+of+the+Host.">Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host.</a> PLoS One. 7 (3), (2012).</li><li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus/liver+and+CD34(+)+cell+transplantation.">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li><li>Li, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Initiation+of+Antiretroviral+Therapy+Can+Functionally+Control+Productive+HIV-1+Infection+in+Humanized-BLT+Mice.">Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice.</a> Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).</li><li>Brainard, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Robust+Cellular+and+Humoral+Virus-Specific+Adaptive+Immune+Responses+in+Human+Immunodeficiency+Virus-Infected+Humanized+BLT+Mice.">Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice.</a> Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).</li><li>Greenblatt, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+versus+Host+Disease+in+the+Bone+Marrow,+Liver+and+Thymus+Humanized+Mouse+Model.">Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model.</a> PLoS One. 7 (9), (2012).</li><li>Hintze, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+scope+method+for+creating+humanized+animal+models+for+animal+health+and+disease+research+through+antibiotic+treatment+and+human+fecal+transfer.">Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer.</a> Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).</li><li>Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Colonization+after+Reciprocal+Fecal+Microbiota+Transfer+between+Mice+with+Low+and+High+Richness+Microbiota.">Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).</li><li>Ellekilde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+gut+microbiota+from+lean+and+obese+mice+to+antibiotic-treated+mice.">Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li><li>Staley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+engraftment+of+human+microbiota+into+mice+with+a+single+oral+gavage+following+antibiotic+conditioning.">Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning.</a> Microbiome. 5, (2017).</li><li>Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+colonization+ability+of+human+fecal+microbes+in+different+mouse+gut+environments.">Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments.</a> ISME J. , (2018).</li><li>Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-treated+versus+germ-free+rodents+for+microbiota+transplantation+studies.">Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies.</a> Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).</li><li>Wos-Oxley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+establishing+a+human+gut+microbial+community+within+rodent+models.">Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models.</a> Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).</li></ol>

O protocolo descrito aqui é para a criação de ratos dobro do Hu-BLT que caracterizam um sistema imunitário humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino. Este protocolo pode ser adaptado a outros modelos de camundongos humanizados ou não humanizados sem a necessidade de animais GF e instalações gnotobióticas. Embora os métodos descritos aqui sejam relativamente simples, existem vários detalhes críticos que são importantes para a criação bem-sucedida de camundongos Double Hu-BLT. Os camu...

Camundongos humanizados (Hu-camundongos) transformaram o estudo de muitos aspectos da saúde humana e da doença, incluindo hematopoiese, imunidade, câncer, doença auto-imune e doenças infecciosas1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estes Hu-ratos têm a vantagem distinta sobre outros modelos do rato que têm um sistema imune humano funcional e podem ser contaminados com os micróbios patogénicos específicos humanos. No entanto, a importância do microbioma intestinal tem sido demonstrada pelo seu papel em muitas doenças humanas, como obesidade, síndrome metabólica, doenças inflamatórias e câncer10,11,12, trezeanos. O sistema imunológico da mucosa e o microbioma intestinal são regulados reciprocamente para manter o intestino e a homeostase sistêmica. O sistema imunológico é moldado por antígenos apresentados pelo microbioma intestinal e reciprocamente o sistema imunológico desempenha um importante papel regulador na promoção de bactérias do intestino comensal e eliminando os patógenos14,15, 16. Entretanto, o microbioma do intestino de Hu-ratos não foi caracterizado bem e o microbioma murino do intestino difere substancialmente na composição e na função dos seres humanos17. Isso se deve às diferenças evolutivas, fisiológicas e anatômicas entre o intestino murino e humano, bem como outros fatores importantes, como a dieta, que podem influenciar os resultados experimentais dos modelos de doença de Hu-camundongos18. Conseqüentemente, além da classificação do microbioma murino do intestino de Hu-ratos, um modelo animal que caracteriza um sistema imunitário humano e um microbioma humano do intestino é necessário estudar as interações complexas da doença humana in vivo.
O estudo de doenças humanas diretamente em indivíduos humanos é muitas vezes impraticável ou antiético. Muitos modelos animais não podem ser usados para estudar patógenos humanos como o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Os modelos de primatas não humanos são geneticamente superados, muito caros e não são suscetíveis a muitos patógenos humanos. Camundongos que foram derivados como germe livre (GF) e reconstituídos com Ademir intestinais semelhantes a humanos têm sido amplamente utilizados para estudar a saúde humana e a doença19,20. No entanto, estes animais não têm um sistema imunológico humano e trabalhar com animais GF requer instalações especializadas, procedimentos e conhecimentos especializados. Portanto, há a necessidade de melhores modelos pré-clínicos para estudar a complexa relação entre o microbioma intestinal e o sistema imunológico humano. Muitas cepas de camundongos, como NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), não estão disponíveis comercialmente como GF. Os animais GF também podem sofrer de deficiências imunes de longa duração que não são completamente revertidas pelo Engraftment de micróbios21. Conseqüentemente, nós criamos um Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino circunstâncias específicas do micróbio patogénico livre (SPF). Para gerar ratos Hu-duplos, a cirurgia foi realizada em camundongos NSG para criar ratos de medula óssea, fígado, Timo humanizado (Hu-BLT). Os ratos de Hu-BLT foram tratados então com os antibióticos do espectro largo e deram então transplantações fecais com uma amostra humana saudável do doador. Nós caracterizamos o microbioma bacteriano do intestino de 173 amostras fecais de 45 ratos dobro do Hu-BLT e 4 amostras de doador fecal humanas. Os ratos dobro do Hu-BLT têm os perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que é transplantado. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante. Além, os metagenomas previstos mostraram que os ratos dobro do Hu-BLT têm a capacidade funcional prevista diferente do que Hu-ratos que é mais similar às amostras do doador humano.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Animal Feeding Needles 18G</td>
			<td style="width:225px;">Cadence Science</td>
			<td style="width:103px;">9928B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Clidox-s Activator</td>
			<td style="width:225px;">Pharmacal Research Laboratories</td>
			<td style="width:103px;">95120F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Clidox-s Base</td>
			<td style="width:225px;">Pharmacal Research Laboratories</td>
			<td style="width:103px;">96125F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DGM 108 cage rack</td>
			<td style="width:225px;">Techniplast</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Flat Brown Grocery Bag 3-5/8&#34;D x 6&#34;W x 11-1/16&#34;L&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Grainger</td>
			<td style="width:103px;">12R063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FMT Upper Delivery Microbiota Preparations&#160;</td>
			<td style="width:225px;">OpenBiome</td>
			<td style="width:103px;">FMP30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Grape Kool-Aid</td>
			<td style="width:225px;">Kraft Foods Inc.</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD19-PE/Cy5</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">302209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD3-PE</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD4-Alexa 700</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD45-FITC</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">hCD8-APC/Cy7</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">301016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Lactate Buffered Ringer&#39;s Solution</td>
			<td style="width:225px;">Boston BioProducts Inc&#160;</td>
			<td style="width:103px;">PY-906-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">mCD45-APC</td>
			<td style="width:225px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Microvette 100 K3E</td>
			<td style="width:225px;">Microvette</td>
			<td style="width:103px;">20.1278.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment</td>
			<td style="width:225px;">Neosporin</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)</td>
			<td style="width:225px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:103px;">005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">PrecisionGlide 25 G Needle</td>
			<td style="width:225px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">RS200 X-ray irradiator</td>
			<td style="width:225px;">RAD Source Technologies</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sealsafe Plus GM500 microisolator cages</td>
			<td style="width:225px;">Techniplast</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile Non-woven Gauze</td>
			<td style="width:225px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:103px;">22-028-558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Teklad global 16% protein irradiated mouse chow</td>
			<td style="width:225px;">Teklad</td>
			<td style="width:103px;">2916</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a double humanized blt-mice model featuring a stable human-like gut microbiome and human immune system

Camundongos humanizados (Hu-camundongos) que apresentam um sistema imunológico humano funcional mudaram fundamentalmente o estudo de patógenos e doenças humanas. Podem ser usados para modelar as doenças que são de outra maneira difíceis ou impossíveis de estudar nos seres humanos ou em outros modelos animais. O microbioma intestinal pode ter um profundo impacto na saúde humana e na doença. No entanto, o microbioma do intestino murino é muito diferente do encontrado em humanos.  Há uma necessidade para os modelos pre-clínicos melhorados do Hu-ratos que têm um microbioma humano enxertado do intestino. Conseqüentemente, nós criamos Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imunitário humano e um microbioma humano-como estável do intestino. Aceno. Os camundongos CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) são um dos melhores animais para a humanização devido ao seu alto nível de imunodeficiência. No entanto, camundongos NSG livres de germes e vários outros modelos de camundongos sem germes importantes não estão atualmente disponíveis comercialmente. Além disso, muitas configurações de pesquisa não têm acesso a instalações gnotobióticas, e trabalhar condições gnotobióticas muitas vezes pode ser caro e demorado. Importante, os ratos germe-livres têm diversas deficiências imunes que existem mesmo depois que o Engraftment dos micróbios. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um protocolo que não exija animais germe-livres ou facilidades gnotobióticos. Para gerar ratos Hu-duplos, camundongos NSG foram tratados com radiação antes da cirurgia para criar camundongos de medula óssea, fígado, Thymus-humanizados (Hu-BLT). Os ratos foram tratados então com os antibióticos do espectro largo para esgotar o microbioma murino pre-existing do intestino. Após o tratamento antibiótico, os camundongos receberam transplantes fecais com amostras de doadores humanos saudáveis via gavagem oral. Os ratos dobro do Hu-BLT tiveram perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que foi transplantada. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos dobro do Hu-BLT para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante.

A Figura 1 mostra um contorno dos métodos usados para criar camundongos Double Hu-BLT e descreve brevemente o processo de adição de um sistema imunológico humano funcional e um microbioma intestinal estável, semelhante ao humano, aos camundongos NSG. A Figura 2 mostra um exemplo de análise de citometria de fluxo de sangue periférico de um blt-mouse humanizado 10 semanas após a cirurgia. A Figura 3 mostra a abundância relati...

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A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System

Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be ...

Nosso protocolo é significativo, porque pode ser usado para criar camundongos reproduzivelmente com um microbioma intestinal humano e um sistema imunológico humano. Chamamos esses ratos, ratos humanizados duplos. O modelo de camundongo humanizado duplo pode ser usado para pesquisas biomédicas básicas e translacionais, incluindo o estudo das relações in vivo entre o microbioma intestinal humano e o sistema imunológico humano.Demonstrando o procedimento estarão Jianshui Zhang, um pós-doutor, e Yilun Chang, um estudante de doutorado do nosso laboratório. Para implantar os tecidos de fígado e timo na cápsula renal esquerda, primeiro, coloque o rato em um capuz. No dia da cirurgia, trate os camundongos com irradiação subletal corporal inteira a 12 centímetros por grama de dose de peso corporal.Raspe cada rato ao redor do lado lateral esquerdo e do lado medial após confirmar um nível apropriado de sedação. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal e aplique uma etiqueta de ouvido conforme necessário. Desinfete a pele com três iodo sequenciais e 70% de esfoliantes isopropanol.Quando a pele estiver preparada, use fórceps para carregar um a seis milímetros de tecido hepático fetal humano em um trocarte, seguido por um fragmento de tecido de timo fetal humano de um a 1,6 milímetros. Use as fórceps para levantar a pele, e use um bisturi para fazer um pequeno corte longitudinal na pele. Estenda o corte para 1,5 a dois centímetros no lado esquerdo do mouse.E use fórceps para levantar a camada muscular. Use a tesoura para abrir a camada muscular longitudinalmente, estendendo o corte conforme necessário para expor o rim, e segure suavemente o tecido gorduroso ao redor do rim. Use um bisturi para fazer uma incisão de um a dois milímetros na extremidade posterior da cápsula renal e insira lentamente o trocarte pré-carregado na incisão paralela ao longo eixo do rim.Libere os tecidos entre a cápsula renal e o rim, e devolva o rim e o intestino às suas posições normais. Em seguida, use suturas para fechar a camada muscular e grampos cirúrgicos para fechar a pele. Coloque o mouse em uma gaiola de microisolador autoclavado com monitoramento até a recumbação total.Seis horas após a cirurgia, coloque os ratos sob uma lâmpada de calor e desinfete as caudas com isopropanol de 70%. Injete de 1,5 a cinco vezes 10 a 5 cd34 tecido hepático fetal humano positivo isolado células-tronco hemopoiéticas em 200 microliters de PBS em uma veia traseira dilatada por animal. Em seguida, pare qualquer sangramento com pressão suave e devolva os ratos para sua gaiola.Nove a 12 semanas após a cirurgia, use uma contenção de pente de plástico de tamanho apropriado para isolar uma perna de um rato humanizado, e pulverizar o lado medial da perna isolada com isopropanol de 70%. Espalhe antibiótico e pomada para aliviar a dor no local da coleta. Usando uma agulha de calibre 25 presa em um ângulo de 90 graus, puna a veia safena para coletar de 50 a 100 microliters de sangue em um tubo de coleta de sangue revestido de EDTA.Quando um volume adequado de sangue tiver sido obtido, aplique pressão no local com um pedaço de gaze estéril para parar o sangramento antes de devolver o rato à sua gaiola. Em seguida, use a amostra de sangue periférica coletada para avaliar o nível de reconstituição de células imunes humanas por citometria de fluxo usando anticorpos contra CD45 humanos, CD3, CD4, CD8, CD19 e mouse CD45. Para a coleta de amostras fecais frescas, coloque sacos de papel autoclaved individuais em um capô de fumaça e coloque um rato em cada saco até que cada animal defeque.Em seguida, devolva os ratos à sua gaiola, e use fórceps estéreis para transferir cada amostra fecal em um tubo de 1,5 mililitro por rato para menos 80 graus Celsius de armazenamento. No final do tratamento antibiótico de 14 dias, mude a água potável para água esterilizada autoclavada, e transfira os ratos para uma nova gaiola autoclavada. 24 e 48 horas após a cessação dos antibióticos descongelam fontes devidamente preparadas de material de transplante de microbiota fecal, e alíquotam as amostras em uma câmara anaeróbica sob condições anaeróbicas.Para realizar um transplante fecal, entregue 200 microliters de material de transplante de microbiota fecal via gavage oral para cada animal experimental, e espalhe qualquer material descongelado restante na pele de camundongos humanizados ou na cama da gaiola. Aqui, um exemplo de análise de citometria de fluxo de sangue periférico de um rato BLT humanizado 10 semanas após a cirurgia é mostrado. As populações de células T e B podem ser identificadas, assim como subconjuntos de células T nD4 e CD8 positivos.Neste gráfico pode ser observada a abundância relativa das amostras de doadores fecais humanos usadas para transferir um microbioma intestinal para criar camundongos humanizados duplos. As alterações fenotípicas no baço e no ceco induzidos pelo tratamento antibiótico são semelhantes às observadas em animais livres de germes. Este enredo principal de análise de componentes dos dados representativos de sequenciamento de RNA ribossômicos 16S revela que camundongos humanizados duplos têm microbiomas intestinais semelhantes a humanos que são exclusivos da amostra de doadores humanos.O aspecto mais crítico deste protocolo é limitar a introdução de bactérias indesejadas para garantir que os camundongos permaneçam saudáveis e mantenham o microbioma intestinal humano. Esse modelo tem o potencial de avançar na medicina personalizada e nos permitir ver como a doença humana impacta o microbioma intestinal enquanto controla outros fatores mitigadores.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Análise e Especificação das Distribuições de Tamanho do Granulo de Amido

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...