Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 og RF1AG057575 til MN), Fondation Leducq transatlantiske net of Excellence-programmet og EU Horizon 2020-programmet for forskning og innovation (Grant nr. 666881; SVDs @ Target). Vi vil også gerne takke Dan Xue for eksperthjælp med grafiske illustrationer.

Alle eksperimenter blev godkendt af universitetets Komité for dyreressourcer (UCAR, protokol nr. 2011-023) ved universitetet i Rochester og udført i henhold til NIH guide for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. klargøring af Cisterna Magna-kanyle, hovedplade og hoved holder
<ol><li>Steriliser alle kirurgiske instrumenter og hovedplader før operationen. Bemærk: fluorescerende røbestoffer leveres direkte til CSF via en Cisterna Magna kanyle. For detaljerede anvisninger vedrørende denne ...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Vi har beskrevet en detaljeret protokol til udførelse af transcranial CSF Imaging i levende mus ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende makroskoper og Tracers. Denne teknik er enkel og minimalt-invasiv, men kvantitativ. In vivo Imaging korrelerer godt med følsomme metoder såsom flydende scintillationstælling af radiomærkede røbestoffer, herunder 3H-dextran og 14C-inulinsirup efter cm levering, og med ex vivo koronalsektion Section kvantificering10, <...

Cerebrospinalvæske (CSF) bader hjernen og rygmarven og er involveret i at opretholde homøostase, levering af næringsstoffer, og regulere intrakranielt tryk1. CSF i subarachnoid rummet kommer ind i hjernen gennem et netværk af perivaskulære rum (PVS) omgivende kortikale piale arterier og derefter strømmer ned langs penetrering arterioler2. En gang i parentchyma, CSF udvekslinger med interstitiel væske (ISF), transporterer skadelige metabolitter såsom amyloid-β (Aβ) og Tau protein aggregater ud af hjernen gennem lav modstand hvidt stof skrifter og perivenøse rum2,3 . Denne vej er afhængig af astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler og er derfor blevet kaldt glial-lymphatic (glymphatic) system4. Affaldsprodukter af neuropil er i sidste ende ryddet fra CSF-ISF gennem lymfe skibe nær kranielle nerver og i meninges ud mod de cervikale lymfeknuder5. Svigt af dette system har været impliceret i flere neurologiske sygdomme som Alzheimers sygdom6,7, traumatisk hjerneskade3, og iskæmisk og hæmoragisk slagtilfælde8.
CSF transport kan visualiseres ved at inficere røbestoffer i Cisterna Magna (cm)9,10 og glymfatiske undersøgelser i fortiden har hovedsagelig udnyttet to-foton mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonans imaging (MRI) 14,15,16,17og ex vivo Imaging3,6,11, 18 for at evaluere Tracer kinetik. To-foton mikroskopi er en egnet metode til detaljeret billeddannelse af CSF røbestoffer i pvss og parenkym på grund af sin høje rumlige opløsning, men det har et snævert synsfelt og kræver en invasiv kraniel vindue eller udtynding af kraniet. Ex vivo-billeddannelse, i kombination med immun histokemi, muliggør analyser i flere niveauer, som spænder fra enkeltceller op til hele hjernen19. Men processen med perfusion-fiksering, der er nødvendig for at observere post mortem-væv producerer dybtgående ændringer i CSF flowretning og kollapser PVS, betydeligt ændre fordelingen og placeringen af røbestoffer12. Endelig, mens MRI kan spore CSF flow i hele murine og menneskelige hjerne, det mangler rumlig og tidsmæssig opløsning af perivaskulære flow.
En ny teknik, transcranial macroskopisk billeddannelse, løser nogle af disse begrænsninger ved at muliggøre vidfelt Imaging af perivaskulær CSF transport i hele rygbarken af levende mus. Denne type billeddannelse udføres med et epifluorescerende makroskop ved hjælp af en multi bånds filter kube, en tunbar LED-lyskilde og et højeffektivt CMOS-kamera10. Disse set-ups er i stand til at løse PVSs op til 1-2 mm under kraniets overflade og kan detektere fluorophorer op til 5-6 mm under den kortikale overflade, mens de forlader kraniet helt intakt10. Multiband filtre og lysdioder, der hurtigt kan finjustere excitation bølgelængde gør det muligt at bruge flere fluorophorer tillader CSF at blive mærket med røbestoffer af forskellige molekylvægt og kemiske egenskaber i samme eksperiment.
Denne procedure kræver en enkel, minimalt invasiv operation for at udsætte kraniet og placere en letvægts hovedplade for at stabilisere hovedet under billedbehandlings sessionen. Røbestoffer kan leveres i cm uden boring i kraniet eller trænge ind i det kortikale væv med pipetter eller kanyle9,20. Både CM-kanyle og hovedplader forbliver stabile i flere dage til uger og letter mere komplekse eksperimentelle design sammenlignet med den klassiske endepunkts visualisering. Denne protokol beskriver, hvordan transcranial macroskopisk billeddannelse anvendes til at studere glymphatiske systemfunktion efter akut eller kronisk injektion af fluorescerende CSF Tracer i CM af bedøvet/sovende eller vågen mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

Cerebrospinalvæske (CSF) flow i gnavere er stort set blevet undersøgt ved hjælp af ex vivo kvantificering af røbestoffer. Teknikker såsom to-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI) har aktiveret in vivo kvantificering af CSF flow, men de er begrænset af reduceret billeddannelse volumen og lav rumlig opløsning, hhv. Nylige arbejde har fundet, at CSF ind i hjernen parenkym gennem et netværk af perivaskulære rum omkring de piale og penetratere arterier af gnaver cortex. Denne perivaskulære indtræden af CSF er en primær drivkraft for det glymphatiske system, en vej, der er impliceret i clearance af giftige metaboliske opløfter (f. eks. amyloid-β). Her illustrerer vi en ny makroskopisk billedbehandlings teknik, der giver mulighed for realtids, mesoskopisk billeddannelse af fluorescerende CSF-røbestoffer gennem det intakte dødningehoved af levende mus. Denne minimalt-invasive metode letter en lang række eksperimentelle designs og muliggør en enkelt eller gentagen testning af CSF dynamik. Macroscopes har høj rumlig og tidsmæssig opløsning, og deres store Gantry og arbejdsdistance giver mulighed for billeddannelse, mens de udfører opgaver på adfærdsmæssige enheder. Denne billeddannelses metode er blevet valideret ved hjælp af to-foton billeddannelse, og fluorescens målinger opnået fra denne teknik er stærkt korrelerer med ex vivo fluorescens og kvantificering af radiomærkede røbestoffer. I denne protokol beskriver vi, hvordan transcranial makroskopisk billeddannelse kan anvendes til at evaluere glyfatisk transport i levende mus, hvilket giver et tilgængeligt alternativ til dyrere billedbehandlings metoder.

CSF tilstrømning er afbildet på et epifluorescerende makroskop (figur 1a), som giver mulighed for mesoskopisk billeddannelse af CSF Tracer transport i murine cortex. Hele kraniets hovedplade tillader visualisering af de rostrale næse knogler, både frontal-og parietal knogler i midten, og den rostrale del af interparietalknoglen knogle caudally (figur 1b). Under billeddannelse kan der let identificeres nasofrontal, sagittal, koronal og lambdoid suturer (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Transcranial optisk billeddannelse tillader bred-felt billeddannelse af cerebrospinalvæske transport i cortex af levende mus gennem en intakt kraniet.

In vivo billeddannelse af cerebrospinalvæske transport gennem intakt mus kraniet ved hjælp af fluorescens makroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Denne nye teknik til real-time mesoskopisk billeddannelse af florescent CSF spor gennem intakt kraniet af levende mus kan bruges til at evaluere glymphatic transport. Den største fordel er, at denne teknik muliggør dynamiske målinger af in-vivo intracisternale sporstoffer til en brøkdel af omkostningerne ved andre billeddannelsesmodaliteter. De procedurer, der kræves for at placere hovedpladen på cisterna magna kanyle er enkle og minimalt invasive, men kræver praksis, der skal udføres korrekt.Visuel demonstration af de kritiske trin i denne metode er nødvendig for at maksimere billedkvaliteten og for at muliggøre reproducerbare sammenligninger mellem forskellige mus og eksperimentelle grupper. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids våd hals og hoved med sterilt vand og barbere fugtet pels. Tør den eksponerede hud af med en spritserviet for at fjerne eventuelt resterende hår og placere musen i en stereotaktisk ramme oven på en temperaturstyret pude.Påfør salve på dyrenes øjne og rengør den eksponerede hud med en chlorhexidinpod. Efter 2 minutter fjernes chlorhexidinen med en alkoholservietter, og der påføres en iodon opløsning. Når iodon er tørret injicere subkutan analgesi i toppen af kraniet og halsen.Starter ved den del af halsen, der dækker occipital skorpe, lave en midterlinje skåret i den overliggende hud fortsætter rostrally mod intraorbital linje. Udvid snittet sideom sideligt til grænsen, hvor den tidsmæssige muskel indsætter i kraniet og fjerne alle huden af fusiform snit til at udsætte både frontale og parietal knogler. Overrisle kraniet med sterilt saltvand, og brug vatpinde til at rense overfladen, indtil det er fri for snavs og hår.Efter indsættelse af cisterna magna kanyle anvende en blanding af dental cement og cyanoacrylat lim til ventrale side af hovedpladen omkring grænsen. Placer hovedpladen på kraniet, så pladens forreste kant flugter med den bageste spids af næsebenet og den bageste kant flugter med den forreste del af interparietalbenet og sikrer, at sagittal suturen er centreret og lige i forhold til vinduet. Det er vigtigt at sikre, at hovedpladen er fastgjort, og at det ikke hindrer synsfeltet af cisterna magna dåse.Brug et par dråber limaccelerator til at fastgøre hovedpladens position og udfylde eventuelle resterende huller med cementblandingen. Lim cisterna magna kanylen til hovedpladen og brug hovedpladen til at placere musen i hovedholderen i en fast position. Placer forsigtigt musen og infusionspumpen fastgjort til kanylen på en vogn til transport til makroscope og placer hovedholderen på makroskostets scene.Sørg for, at linjen fra sprøjtepumpen til cisterna magnakannulaen ikke er stram, og at den ikke har knæk. Overhold respirationshastigheden og den lyserøde farve af slimmembranerne for at bekræfte en god iltning. Tænd for makroskopkameraet og den lysemitterende diode, og start live-tilstanden.Juster forstørrelsen af billeddannelsesfeltet, så den nasofrontale sutur øverst på marken og lambdoid sutur i bunden tydeligt kan visualiseres. Når på plads tape hovedholderen til makroscope scenen og fokusere makroscope på den eksponerede kraniet, indtil fokale flyet er placeret på de laterale sider af parietal knogler posterior til koronale suturer. For CSF-sporstofinfusion indstilles infusionspumpen til den relevante hastighed og volumen, og der indstilles den relevante excitationsbølgelængde og eksponeringstid for sporstof for hver kanal.Kontroller derefter, at udløserfunktionen på makroscope'et er korrekt, før sporstofinfusionen og billeddannelsen påbegyndes samtidigt. Under billeddannelse naso frontal, sagittal, koronal, og lambdoid suturer let kan identificeres. Når CSF sporstof er blevet infunderes i cisterna magna sporstof fluorescens er først observeret i store puljer af subaraknoid CSF på olfactofrontal cistern og quadrigeminal cistern nær pinealfordybning og i sidste ende omkring midten cerebral arterier.CSF sporstoffer derefter indtaste deres hjerne langs peri vaskulære rum i kortikale peal grene af den midterste cerebral arterie. CSF transport billeddannelse efter traumatisk hjerneskade afslører sporstof i første omgang på olfactofrontal cisternen, men den glymphatic tilstrømning langs kortikale perivascular rum er helt afskaffet på siden af skaden. Kvantitativ analyse på in vivo-billederne viser, at det ipsilaterale tilstrømningsområde er faldet næsten en tredjedel sammenlignet med den kontralaterale halvkugle.For at undgå bevægelsesartefakter og ændringerne i brændplanet skal du huske at fastgøre hovedpladen og hovedpladeholderen korrekt og kontrollere dyrets anæstesiniveau. Efter forsøget in-vivo imaging resultater kan valideres yderligere ved at kvantificere sporstof penetration ved hjælp af den faktiske Denne teknik gør det muligt at studere glymphatic system i en fysiologisk og minimalt invasive måde og kan hjælpe med at løse fremtidige spørgsmål om CSF hydrodynamik i sundhed og sygdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering af cerebrospinalvæske fra Gnaver Embryoner til brug med dissekeret Cerebral Cortikale Eksplantater

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-foton<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af dendritiske spidser i Mouse Cortex Ved hjælp af en tyndere-kranium Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Tilberedninger af den intakte Vomeronasal orgel og tilbehør lugtekolben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging af Postnatal cerebellare Granule Cell Migration Brug Konfokal makroskopi

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Prøveforberedelse til Endopeptidomic analyse i menneskelige cerebrospinalvæske

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Overvågning af døgnrytmen ur genekspression i mus Suprachiasmatic kernen bruger fluorescens journalister

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

En forbedret metode til indsamling af cerebrospinalvæsken fra bedøvede mus

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Billeddannelse og analyse af Neurofilament Transport i punkterede mus Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...