Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of neurologische aandoeningen and Stroke en het National Institute on Aging (U.S. National Institutes of Health; R01NS100366 en RF1AG057575 tot MN), het trans-Atlantisch netwerken van uitmuntendheid-programma van de Fondation Leducq en het EU Horizon 2020-onderzoeks-en innovatieprogramma (Grant No. 666881; SVDs @ target). Ook willen we dan Xue bedanken voor deskundige hulp bij grafische illustraties.

Alle experimenten werden goedgekeurd door het universitair Comité voor dierlijke hulpbronnen (UCAR, Protocol nr. 2011-023) aan de Universiteit van Rochester en uitgevoerd volgens de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. bereiding van de Cisterna magna canule, Hoofdplaat en hoofd houder
<ol><li>Steriliseren alle chirurgische instrumenten en hoofd platen voor de operatie. Opmerking: fluorescerende tracers worden direct in CSF geleverd via een Cisterna magna-cannula...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

We hebben een gedetailleerd protocol beschreven voor het uitvoeren van Transcraniële CSF-beeldvorming in levende muizen met behulp van commercieel verkrijgbare fluorescerende macroscopen en tracers. Deze techniek is eenvoudig en minimaal invasief, maar toch kwantitatief. In vivo beeldvorming correleert goed met gevoelige methoden zoals vloeibare Scintillatie telling van radio-gelabelde tracers, waaronder 3H-dextran en 14C-inuline na cm levering, en met ex vivo coronale sectie kwantificering<sup cla...

Cerebrospinale vloeistof (CSF) bakt de hersenen en het ruggenmerg en is betrokken bij het handhaven van homeostase, leveren van voedingsstoffen, en regulering van intracraniële druk1. CSF in de subarachnoïde ruimte komt de hersenen binnen via een netwerk van perivasculaire ruimten (pv's) rondom de corticale merg slagaders en stroomt vervolgens langs penetrerende arteriolen2. Eenmaal in het parenchym worden CSF-uitwisselingen met interstitiële vloeistof (ISF), die schadelijke metabolieten zoals amyloid-β (Aβ) en Tau-eiwit bevatten, uit de hersenen verzameld door middel van lage weerstand witte materie Tracts en periveneuze ruimten2,3 . Dit traject is afhankelijk van astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanalen en is daarom het glial-lymfatische (glymphatische) systeem4genoemd. Afvalproducten van de neuro pil worden uiteindelijk gewist uit het CSF-ISF via lymfevaten in de buurt van craniale zenuwen en in de hersenvliezen naar de cervicale lymfeklieren5. Het falen van dit systeem is betrokken bij verschillende neurologische ziekten zoals de ziekte van Alzheimer6,7, traumatisch hersenletsel3, en ischemische en hemorragische beroerte8.
CSF transport kan worden gevisualiseerd door het infusie tracers in de Cisterna magna (cm)9,10 en glymphatic studies in het verleden hebben voornamelijk gebruikt twee-photon microscopie4,11,12, 13, magnetische resonantie beeldvorming (MRI) 14,15,16,17en ex vivo imaging3,6,11, 18 om de Tracer kinetiek te evalueren. Two-photon microscopie is een geschikte methode voor gedetailleerde beeldvorming van CSF-tracers in PVSs en het parenchym vanwege de hoge ruimtelijke resolutie, maar het heeft een smal gezichtsveld en vereist een invasief craniaal venster of dunner worden van de schedel. Ex vivo imaging, in combinatie met immunohistochemie, maakt analyses op meerdere niveaus mogelijk, variërend van afzonderlijke cellen tot de hele hersenen19. Het proces van perfusie-fixatie dat nodig is om het postmortemweefsel te observeren produceert echter ingrijpende veranderingen in de CSF-stroomrichting en stort de PVS in, waardoor de verdeling en de locatie van de tracers12aanzienlijk veranderen. Tot slot, terwijl MRI de CSF-stroom over de gehele Murine en het menselijk brein kan volgen, ontbreekt het aan ruimtelijke en temporele resolutie van de perivasculaire stroming.
Een nieuwe techniek, Transcraniële macroscopische beeldvorming, lost sommige van deze beperkingen op door het inschakelen van Wide-veld beeldvorming van perivasculaire CSF transport in de gehele rugschors van levende muizen. Dit type beeldvorming wordt gedaan met een epifluorescerende macro scoop met behulp van een multiband filter kubus, Instelbare LED-lichtbron en hoogrenderende CMOS-camera10. Deze opstellingen zijn in staat om PVSs op te lossen tot 1-2 mm onder het schedel oppervlak en kunnen fluoroforen tot 5-6 mm onder het corticale oppervlak detecteren en de schedel volledig intact laten10. Multiband filters en Led's die de excitatie golflengte snel kunnen afstemmen, maken het gebruik van meerdere fluor Foren mogelijk, waardoor CSF kan worden gelabeld met tracers van verschillende molecuulgewichten en chemische eigenschappen in hetzelfde experiment.
Deze procedure vereist een eenvoudige, minimaal invasieve ingreep om de schedel bloot te leggen en een lichtgewicht Hoofdplaat te plaatsen om het hoofd te stabiliseren tijdens de beeldvormings sessie. Tracers kunnen in de cm worden afgeleverd zonder in de schedel te boren of door het corticale weefsel te penetreren met pipetten of canules9,20. Zowel cm canules als hoofd platen blijven enkele dagen tot weken stabiel en faciliteren complexere experimentele ontwerpen in vergelijking met de klassieke eindpunt visualisatie. Dit protocol beschrijft hoe Transcraniële macroscopische beeldvorming wordt gebruikt om de glymphatische systeemfunctie te bestuderen na acute of chronische injectie van fluorescerende CSF Tracer in de CM van anesthetized/slapende of wakker muizen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

Cerebrospinale vloeistof (CSF) stroom bij knaagdieren is grotendeels bestudeerd met behulp van ex vivo kwantificering van tracers. Technieken zoals twee-Fobe microscopie en magnetische resonantie imaging (MRI) hebben in vivo kwantificering van de CSF-stroom ingeschakeld, maar ze worden beperkt door respectievelijk lagere beeld volumes en een lage ruimtelijke resolutie. Recent werk heeft geconstateerd dat CSF de hersen parenchym binnenkomt via een netwerk van perivasculaire ruimten rond de Piale en penetrerende slagaders van de knaagdieren cortex. Deze perivasculaire invoer van CSF is een primaire bestuurder van het glymphatische systeem, een traject dat betrokken is bij de klaring van toxische metabole opgeloste stoffen (bijv. amyloid-β). Hier illustreren we een nieuwe macroscopische beeldvormings techniek die real-time mesoscopische beeldvorming van fluorescerende CSF-tracers mogelijk maakt via de intacte schedel van levende muizen. Deze minimaal invasieve methode vergemakkelijkt een veelheid aan experimentele ontwerpen en maakt enkelvoudige of herhaalde tests van de CSF-dynamiek mogelijk. Macroscopen hebben een hoge ruimtelijke en temporele resolutie en hun grote portaal en werkafstand zorgen voor Imaging tijdens het uitvoeren van taken op gedrags apparaten. Deze beeldvormings benadering is gevalideerd met behulp van Two-photon Imaging en fluorescentie metingen verkregen uit deze techniek sterk correleren met ex vivo fluorescentie en kwantificering van radio-gelabelde tracers. In dit protocol beschrijven we hoe Transcraniële macroscopische beeldvorming kan worden gebruikt om glymphatische transport in levende muizen te evalueren, en biedt een toegankelijk alternatief voor duurdere beeldvormings modaliteiten.

De CSF-toestroom wordt afgebeeld op een epifluorescerende macro Scoop (Figuur 1a), die mesoscopische beeldvorming van CSF Tracer transport in de muriene cortex mogelijk maakt. De hele-schedel Hoofdplaat maakt de visualisatie van de rostrale migratoire nasale botten, zowel frontale en pariëtale botten in het midden, en de rostrale migratoire deel van het interpariëtale bot caudally (Figuur 1b). Tijdens de beeldvorming kunnen de nasofrontale, sagittale, coronale...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Transcraniële optische beeldvorming maakt het mogelijk om het transport van cerebrospinale vloeistof in de cortex van levende muizen door middel van een intacte schedel te Imaging.

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Deze nieuwe techniek voor real-time mescopische beeldvorming van florescent CSF-sporen door de intacte schedel van levende muizen kan worden gebruikt om glymphatisch transport te evalueren. Het belangrijkste voordeel is dat deze techniek dynamische metingen van in-vivo intracisternale tracers mogelijk maakt tegen een fractie van de kosten van andere beeldvormingsmodaliteiten. De procedures die nodig zijn om de hoofdplaat op cisterna magna canule te plaatsen zijn eenvoudig en minimaal invasief, maar vereisen dat de praktijk correct wordt uitgevoerd.Visuele demonstratie van de kritieke stappen van deze methode is nodig om de beeldkwaliteit te maximaliseren en reproduceerbare vergelijkingen tussen verschillende muizen en experimentele groepen mogelijk te maken. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen nat de nek en het hoofd met steriel water en scheren de bevochtigde vacht. Veeg de blootgestelde huid met een alcoholuitstrijkje om resthaar te verwijderen en plaats de muis in een stereotactisch frame bovenop een temperatuurgestuurd pad.Breng zalf aan op de ogen van de dieren en maak de blootgestelde huid schoon met een chloorhexidineuitstabuurtje. Verwijder na 2 minuten de Chlorhexidine met een alcoholdoek en breng een iodone-oplossing aan. Wanneer de iodone is gedroogd injecteren onderhuidse analgesie in de bovenkant van de schedel en nek.Beginnend bij het deel van de nek dat de occipitale korst bedekt, maak een middellijn gesneden in de bovenlijnige huid die rostrally richting de intraorbitale lijn gaat. Breid de incisie lateraal uit tot de grens waar de temporele spier in de schedel wordt aangebracht en verwijder alle huid van de fusiforme incisie om zowel de frontale als pariëtale botten bloot te leggen. Irrigeer de schedel met steriele zoutoplossing en gebruik wattenstaafjes om het oppervlak schoon te maken totdat het vrij is van puin en haar.Na het inbrengen van de cisterna magna canule breng een mengsel van tandcement en cyanoacrylaat lijm aan de ventrale kant van de hoofdplaat rond de grens. Plaats de hoofdplaat op de schedel, zodat de voorste rand van de plaat uitlijnt met de achterste punt van het neusbeen en de achterste rand in lijn is met het voorste aspect van het interpariëtale bot, zodat de sagittale hechting gecentreerd en recht ten opzichte van het raam is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de hoofdplaat is bevestigd en dat het gezichtsveld van de cisterna magna cannulation niet belemmert.Gebruik een paar druppels lijmversneller om de positie van de hoofdplaat te bevestigen en eventuele resterende gaten met het cementmengsel te vullen. Lijm de cisterna magna canule op de hoofdplaat en gebruik de hoofdplaat om de muis in een vaste positie in de hoofdhouder te plaatsen. Plaats de muis en de infuuspomp die aan de canule is bevestigd voorzichtig op een kar voor transport naar de macroscoop en plaats de hoofdhouder op het podium van de macroscoop.Zorg ervoor dat de lijn van de spuitpomp naar de cisterna magna cannula niet strak is en dat het geen knikken heeft. Let op de ademhalingsfrequentie en roze kleuring van de slijmvliezen om een goede oxygenatie te bevestigen. Schakel de macroscoopcamera en de lichtgevende diode in en start de live-modus.Pas de vergroting van het beeldvormingsveld zo aan dat de nasofrontale hechting aan de bovenkant van het veld en lambdoïde hechting aan de onderkant duidelijk kunnen worden gevisualiseerd. Eenmaal op zijn plaats tape de hoofdhouder naar de macroscoop stadium en focus de macroscoop op de blootgestelde schedel totdat het brandpuntsvlak is gelegen aan de zijkanten van de pariëtale botten achterste aan de coronale hechtingen. Stel voor csf-tracer-infusie de infusiepomp in op de juiste snelheid en het juiste volume en stel de juiste excitatiegolflengte en blootstellingstijd voor de tracer voor elk kanaal in.Controleer vervolgens of de triggeringfunctie op de macroscoop correct is voordat u tegelijkertijd de tracerinfusie en de beeldvorming initieert. Tijdens het beeldvorming van de naso frontale, sagittale, coronale, en lambdoïde hechtingen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Zodra de CSF-tracer is toegediend in de cisterna magna, wordt de tracerfluorescentie voor het eerst waargenomen in grote poelen van subarachnoid CSF in de olfactofrontale stortbak en de vierbakvormige put bij de pijnappeluitsparing en uiteindelijk rond de middelste cerebrale slagaders.CSF-tracers komen vervolgens hun hersenen binnen langs peri vasculaire ruimten van de corticale peale takken van de middelste hersenslagader. CSF transport beeldvorming na traumatisch hersenletsel onthult tracer in eerste instantie op de olfactofrontale stortbak, maar de glymphatische instroom langs de corticale perivasculaire ruimtes is volledig afgeschaft aan de zijkant van het letsel. Kwantitatieve analyse op de in-vivo beelden toont aan dat de ipsilaterale instroom gebied is bijna een derde verminderd in vergelijking met de contralaterale hemisfeer.Om te voorkomen dat beweging artefacten en de veranderingen in het brandpuntsvlak niet aan de hoofdplaat en de hoofdplaathouder correct vast te zetten en controleer de anesthesie niveau van het dier. Na het experiment kunnen in-vivo beeldvormingsresultaten verder worden gevalideerd door de tracerpenetratie te kwantificeren met behulp van de werkelijke Deze techniek maakt het mogelijk om het glymfatische systeem fysiologisch en minimaal invasieve wijze te bestuderen en kan toekomstige vragen over CSF-hydrodynamica in gezondheid en ziekte helpen aanpakken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo&#39;s voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Bereidingen van de Intact Vomeronasal en accessoires bulbus olfactorius

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo beeldvorming van postnatale cerebellaire Korrel Cell Migration met behulp van confocale Macroscopie

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Bereiding van de monsters voor de analyse van de Endopeptidomic van menselijke cerebrospinale vloeistof

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Een verbeterde methode voor de verzameling van de cerebrospinale vloeistof van narcose muizen

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...