Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Ces travaux ont été financés par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke et le National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 et RF1AG057575 à MN), le Programme des réseaux transatlantiques d'excellence de la Fondation Leducq et le programme de recherche et d'innovation DE l'UE Horizon 2020 (subvention no 666881; SVDs-target). Nous tenons également à remercier Dan Xue pour son aide experte en illustrations graphiques.

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité universitaire sur les ressources animales (UCAR, Protocole no 2011-023) de l'Université de Rochester et réalisées selon le Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation de la canule cisterna magna, plaque de tête et support de tête
<ol><li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux et les plaques de tête avant la chirurgie. REMARQUE : Les traceurs fluorescents sont livrés direc...

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	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Nous avons décrit un protocole détaillé pour exécuter la formation image transcrânienne de CSF dans les souris vivantes utilisant les macroscopes et les traceurs fluorescents commercialement disponibles. Cette technique est simple et peu invasive, mais quantitative. L'imagerie in vivo est bien corrélée avec des méthodes sensibles telles que le comptage de la scintillation liquide des traceurs étiquetés par radio, y compris 3H-dextran et 14C-inuline après la livraison de CM, et avec la qua...

Le liquide céphalo-rachidien (CSF) baigne le cerveau et la moelle épinière et est impliqué dans le maintien de l'homéostasie, l'approvisionnement en nutriments, et la régulation de la pression intracrânienne1. CSF dans l'espace subarachnoïde pénètre dans le cerveau à travers un réseau d'espaces périvasculaires (PVS) entourant les artères corticales piales, puis coule vers le bas le long des artérioles pénétrantes2. Une fois dans le parenchyme, Le CSF échange avec le liquide interstitiel (ISF), transportant des métabolites nocifs tels que l'amyloïde et les agrégats de protéines tau hors du cerveau par des voies de matière blanche à faible résistance et des espaces pereux2,3 . Cette voie dépend des canaux astroglial d'aquaporine-4 (AQP4) et a donc été appeléele système glil-lymphatique (glymphatique) 4. Les déchets du neuropil sont finalement éliminés du CSF-ISF par des vaisseaux lymphatiques près des nerfs crâniens et dans les méninges vers les ganglions lymphatiques cervicaux5. L'échec de ce système a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer6,7, traumatisme crânien3, et l'AVC ischémique et hémorragique8.
Le transport De CSF peut être visualisé en infusant des traceurs dans la magna de cisterna (CM)9,10 et les études glymphatiques dans le passé ont principalement utilisé la microscopie de deux photons4,11,12, 13, imagerie par résonance magnétique (IRM)14,15,16,17, et ex vivo imagerie3,6,11, 18 pour évaluer la cinétique des traceurs. La microscopie à deux photons est une méthode appropriée pour l'imagerie détaillée des traceurs de CSF dans les PVS et le parenchyme en raison de sa haute résolution spatiale, cependant, il a un champ de vision étroit et nécessite une fenêtre crânienne envahissante ou l'amincissement du crâne. L'imagerie ex vivo, en combinaison avec l'immunohistochimie, permet des analyses à plusieurs niveaux allant des cellules individuelles jusqu'à l'ensemble du cerveau19. Cependant, le processus de perfusion-fixation qui est nécessaire pour observer le tissu post-mortem produit des changements profonds dans la direction de flux de CSF et s'effondre le PVS, modifiant considérablement la distribution et l'emplacement des traceurs12. Enfin, tandis que MRI peut suivre le flux de CSF dans l'ensemble du cerveau murine et humain, il manque de résolution spatiale et temporelle du flux périvasculaire.
Une nouvelle technique, l'imagerie macroscopique transcrânienne, résout certaines de ces limitations en permettant l'imagerie à large champ du transport périvasculaire de CSF dans le cortex dorsal entier des souris vivantes. Ce type d'imagerie est fait avec un macroscope épifluorescent utilisant un cube de filtre multibande, source de lumière LED réglable, et caméra CMOS à haut rendement10. Ces configurations sont capables de résoudre pvS jusqu'à 1-2 mm sous la surface du crâne et peuvent détecter les fluorophores jusqu'à 5-6 mm sous la surface corticale tout en laissant le crâne entièrement intact10. Les filtres multibandes et les LED qui peuvent rapidement régler la longueur d'onde de l'excitation permettent l'utilisation de fluorophores multiples permettant à CSF d'être étiqueté avec des traceurs de différents poids moléculaires et propriétés chimiques dans la même expérience.
Cette procédure nécessite une chirurgie simple et mini-invasive pour exposer le crâne et placer une plaque de tête légère pour stabiliser la tête pendant la séance d'imagerie. Les traceurs peuvent être livrés dans le CM sans percer dans le crâne ou pénétrer le tissu cortical avec des pipettes ou des canules9,20. Les canules CM et les plaques de tête restent stables pendant plusieurs jours à plusieurs semaines et facilitent des conceptions expérimentales plus complexes par rapport à la visualisation classique de point final. Ce protocole décrit comment la formation image macroscopique transcrânienne est employée pour étudier la fonction glymphatique de système suivant l'injection aigue ou chronique du traceur fluorescent de CSF dans le CM des souris anesthésiées/dormantes ou éveillées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

Le flux de fluide céphalo-rachidien (CSF) chez les rongeurs a été largement étudié à l'aide de la quantification ex vivo des traceurs. Des techniques telles que la microscopie à deux photons et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis une quantification in vivo du flux de FSC, mais elles sont limitées par des volumes d'imagerie réduits et une faible résolution spatiale, respectivement. Des travaux récents ont constaté que CSF pénètre dans le parenchyme cérébral à travers un réseau d'espaces périvasculaires entourant les artères piales et pénétrantes du cortex des rongeurs. Cette entrée périvasculaire de CSF est un moteur primaire du système glymphatique, une voie impliquée dans le dégagement des solutés métaboliques toxiques (par exemple, amyloïde-MD). Ici, nous illustrons une nouvelle technique d'imagerie macroscopique qui permet l'imagerie en temps réel et mésoscopique des traceurs fluorescents de CSF par le crâne intact des souris vivantes. Cette méthode peu invasive facilite une multitude de conceptions expérimentales et permet des tests uniques ou répétés de la dynamique du FSC. Les macroscopes ont une résolution spatiale et temporelle élevée et leur grande distance de portique et de travail permet l'imagerie tout en effectuant des tâches sur des dispositifs comportementaux. Cette approche d'imagerie a été validée à l'aide de mesures d'imagerie à deux photons et de fluorescence obtenues à partir de cette technique fortement corrélées avec la fluorescence ex vivo et la quantification des traceurs radio-étiquetés. Dans ce protocole, nous décrivons comment l'imagerie macroscopique transcrânienne peut être utilisée pour évaluer le transport glymphatique chez les souris vivantes, offrant une alternative accessible aux modalités d'imagerie plus coûteuses.

L'afflux de CSF est représenté sur un macroscope épifluorescent (Figure 1A), qui permet l'imagerie mésoscopique du transport de traceurs CSF dans le cortex murine. La plaque de tête du crâne entier permet la visualisation des os nasaux rostral, les os frontaux et pariétaux au centre, et la partie rostrale de l'os interpariétal caudally (Figure 1B). Pendant l'imagerie, les sutures nasofrontales, sagittales, coronales et lambdoid peuvent être facilement i...

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In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

L'imagerie optique transcrânienne permet l'imagerie à large champ du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cortex des souris vivantes à travers un crâne intact.

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Cette nouvelle technique d’imagerie mésoscopique en temps réel des traces de CSF florescentes à travers le crâne intact de souris vivantes peut être utilisée pour évaluer le transport glymphatique. Le principal avantage est que cette technique permet des mesures dynamiques des traceurs intracistraux in vivo à une fraction du coût d’autres modalités d’imagerie. Les procédures requises pour placer la plaque de tête sur la canule magna cisterna sont simples et peu invasives, mais nécessitent une pratique à effectuer correctement.La démonstration visuelle des étapes critiques de cette méthode est nécessaire pour maximiser la qualité de l’image et permettre des comparaisons reproductibles entre différentes souris et groupes expérimentaux. Après avoir confirmé un manque de réponse à pincement des pieds humide le cou et la tête avec de l’eau stérile et raser la fourrure humidifié. Essuyez la peau exposée à l’aide d’un écouvillon d’alcool pour enlever les poils résiduels et placez la souris dans un cadre stéréotaxique au-dessus d’un tampon à température contrôlée.Appliquer de l’onguent sur les yeux des animaux et nettoyer la peau exposée à l’l’l’œil chlorhexidine. Après 2 minutes, retirer la chlorhexidine à l’alcool et appliquer une solution d’iodone. Lorsque l’iodone a séché injecter analgésie sous-cutanée dans le haut du crâne et le cou.À partir de la partie du cou qui couvre la croûte occipitale, faire une coupe médiane dans la peau qui recouvre continue rostrally vers la ligne intraorbitale. Étendre l’incision latéralement à la frontière où le muscle temporal s’insère dans le crâne et enlever toute la peau de l’incision fusitforme pour exposer les os frontaux et pariétals. Irriguer le crâne avec salin stérile, et utiliser des cotons-tiges pour nettoyer la surface jusqu’à ce qu’il soit exempt de débris et de cheveux.Après l’insertion de la cisterna magna cannula appliquer un mélange de ciment dentaire et de colle cyanoacrylate sur le côté ventral de la plaque de tête autour de la frontière. Placez la plaque de tête sur le crâne de sorte que la bordure antérieure de la plaque s’aligne avec la pointe postérieure de l’os nasal et la bordure postérieure s’aligne avec l’aspect antérieur de l’os interpariétal en s’assurant que la suture sagittale est centrée et droite par rapport à la fenêtre. Il est important de s’assurer que la plaque de tête est fixée et qu’elle n’obstrue pas le champ de vision de la cannulation magna cisterna.Utilisez quelques gouttes d’accélérateur de colle pour fixer la position de la plaque de tête et combler les lacunes restantes avec le mélange de ciment. Collez la cisterna magna cannula à la plaque de tête et utilisez la plaque de tête pour placer la souris dans le porte-tête en position fixe. Placez soigneusement la souris et la pompe d’infusion attachées à la canule sur un chariot pour le transport vers le macroscope et placez le porte-tête sur la scène du macroscope.Assurez-vous que la ligne de la pompe à seringues à la canule magna cisterna n’est pas tendue et qu’elle n’a pas de plis. Observez la fréquence respiratoire et la coloration rose des muqueuses pour confirmer une bonne oxygénation. Allumez la caméra macroscope et la diode électroluminescente et démarrez le mode live.Ajustez le grossissement du champ d’imagerie de sorte que la suture nasofrontale en haut du champ et la suture lambdoid au fond puissent clairement être visualisées. Une fois en place, tapez le porte-tête au stade macroscope et concentrez le macroscope sur le crâne exposé jusqu’à ce que le plan focal soit situé sur les côtés latéraux des os pariétals postérieures aux sutures coronaires. Pour l’infusion de traceur CSF, réglez la pompe d’infusion au taux et au volume appropriés et réglez la longueur d’onde d’excitation et le temps d’exposition appropriés pour le traceur pour chaque canal.Vérifiez ensuite que la fonction de déclenchement du macroscope est correcte avant d’initier simultanément l’infusion du traceur et l’imagerie. Pendant l’imagerie, les sutures naso frontales, sagittales, coronal et lambdoid peuvent être facilement identifiées. Une fois que le traceur de CSF a été infusé dans la magna de cisterna la fluorescence de traceur est d’abord observée dans de grandes piscines de CSF sous-arachnoïdien à la citerne olfactofrontal et à la citerne quadrigeminal près de la cavité pinéale et par la suite entourant les artères cérébrales moyennes.Les traceurs de CSF entrent alors dans leur cerveau le long des espaces peri vasculaires des branches corticales de peal de l’artère cérébrale moyenne. L’imagerie de transport de CSF après des dommages traumatiques de cerveau indique traceur d’abord à la citerne olfactofrontal mais l’afflux glymphatic le long des espaces périivasculaires corticals est complètement aboli sur le côté de la blessure. L’analyse quantitative des images in vivo démontre que la zone d’afflux ipsilateral est diminuée de près d’un tiers par rapport à l’hémisphère contralatéral.Pour éviter les artefacts de mouvement et les changements dans le plan focal n’oubliez pas de fixer correctement la plaque de tête et le porte-plaqueau et de vérifier le niveau d’anesthésie de l’animal. Après l’expérience, les résultats de l’imagerie in vivo peuvent être validés en quantifiant la pénétration du traceur à l’aide de la technique réelle Cette technique permet l’étude du système glymphatique d’une manière physiologique et mini-invasive et peut aider à répondre aux questions futures sur l’hydrodynamique CSF dans la santé et la maladie.

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