Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ המכון הלאומי על הזדקנות (מכוני הבריאות הלאומי של ארה ב; R01NS100366 ו-RF1AG057575 ל-MN), תוכנית מצוינות לרשתות טראנס-אטלנטית, ואופק האיחוד האירופי 2020 תוכנית מחקר וחדשנות (מענק מס ' 666881; היעד של SVDs @). אנחנו גם רוצים להודות לדן Xue לקבלת סיוע מומחה עם איורים גרפיים.

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה על משאבי בעלי חיים (UCAR, פרוטוקול No. 2011-023) באוניברסיטת רוצ'סטר וביצע על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת הצינורית הcisterna גנה, צלחת הראש ומחזיק הראש
<ol><li>לחטא את כל כלי הניתוח ואת לוחיות הראש לפני הניתוח. הערה: מנותבים פלורס...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

יש לנו לתאר פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה transcranial שדרתי בעכברים חיים באמצעות מסחרית-זמין מקרוסקופים פלורסנט ו מנותבים. טכניקה זו פשוטה ומינימלית-פולשנית, אך כמותית. בהדמיה vivo מתואם היטב עם שיטות רגישות כגון ספירת מבחנות של מכשירי רדיו המסומנים ב- 3כ-dextran ו -14ג-אינולין לאחר משלוח CM, ...

נוזל מוחי שדרתי (שדרתי) מרחץ את המוח ואת חוט השדרה והוא מעורב בשמירה על הומאוסטזיס, אספקת חומרים מזינים, ויסות לחץ תוך-גולגולתי1. מוחי שדרתי במרחב התת-ארכיוניאיד נכנס למוח דרך רשת של חללים פריכריים (PVS) המקיפים את העורקים הקורטיקליים ולאחר מכן זורמים לאורך העורק העורקי2. פעם אחת ב-כימומה, שדרתי החלפת עם נוזל ביניים (הקרן), נושאת מטבוליטים מזיקים כגון עמילואיד-β (Aβ) ו-טאו מצרפים החלבון מתוך המוח באמצעות התנגדות נמוכה החומר הלבן שטחי ומשטחים ורידים2,3 . מסלול זה תלוי בערוצי האסטרוגליאל aquaporin-4 (AQP4) ולכן כינה את מערכת glial-הלימפה (גלימפחטיק)4. פסולת מוצרים של נוירופיל מנוקה בסופו של דבר מתוך שדרתי-הקרן דרך כלי הלימפה ליד עצבי הגולגולת בתוך קרום המוח לעבר בלוטות הלימפה צוואר הרחם5. הכישלון של מערכת זו היה מעורב במספר מחלות נוירולוגיים כגון מחלת אלצהיימר6,7, פגיעה מוחית טראומטית3, והסכמי שבץ מדמם8.
הובלה בלתי מגנטית ניתן לדמיין על ידי החדרת מנותבים לתוך cisterna מגנה (CM)9,10 ומחקרים גלימפהטיים בעבר היו מנוצלים בעיקר 2-פוטון מיקרוסקופ4,11,12, 13, דימות תהודה מגנטית (MRI) 14,15,16,17, ו vivo ex הדמיה3,6,11, 18 להערכת קינטיקה מעקב. 2-פוטון מיקרוסקופ היא שיטה מתאימה עבור הדמיה מפורטת של מעקב שדרתי ב PVSs ואת הסרכימה בשל הרזולוציה המרחבית גבוהה שלה, עם זאת, יש שדה צר של השקפה והוא דורש חלון הגולגולת פולשני או דליל של הגולגולת. Vivo Ex הדמיה, בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, מאפשר ניתוחים מדורגת החל מתאים בודדים עד המוח כולו19. עם זאת, תהליך הפרזיה-קיבעון הנדרש להתבונן ברקמה שלאחר המוות, מייצר שינויים עמוקים בכיוון הזרימה השדרתי ומכווץ את ה-PVS, משנה באופן משמעותי את ההפצה ואת המיקום של המשדרים12. לבסוף, בעוד שהאמ-אר-איי יכול לעקוב אחר זרימת המוח המוחית לאורך כל הגוף האנושי ומכל האדם, היא חסרה ברזולוציה מרחבית וזמנית של זרימה פרימורית.
טכניקה חדשה, הדמיה transcranial מאקרוסקופי, פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי הפעלת הדמיה של שדה רחב של הובלה שדרתי הפריסקולרית בקליפת המוח כולה של עכברים חיים. סוג זה של דימות מתבצע עם מאקרוסקופ פלורסנטי באמצעות קוביית מסנן multiband, מקור אור LED מהיר ויעילות גבוהה מצלמת CMOS10. אלה להגדיר קופצים מסוגלים לפתור PVSs עד 1-2 מ"מ מתחת למשטח הגולגולת והוא יכול לזהות fluorophores עד 5-6 מ"מ מתחת לפני השטח קליפת המוח תוך השארת הגולגולת לגמרי שלמים10. מסננים multiband ו נוריות שיכולות לכוונן במהירות את אורך הגל מאפשר השימוש fluorophores מרובים ומאפשר שימוש בחומרים מסוימים של שדרתי להיות מתויג עם מסומנים של משקולות מולקולרית שונים תכונות כימיות באותו ניסוי.
הליך זה דורש ניתוח פשוט, מינימלית פולשנית כדי לחשוף את הגולגולת ולמקם צלחת ראש במשקל קל כדי לייצב את הראש במהלך הפעלת ההדמיה. ניתן להעביר את המשדרים לתוך ס מ ללא קידוח לתוך הגולגולת או לחדור לרקמת קליפת המוח באמצעות פיפטות או באמצעות צינורית9,20. שתי הצינורית ולוחיות הראש של ה-CM נשארות יציבות במשך מספר ימים עד שבועות ומקלות את העיצובים הניסיוניים המורכבים יותר בהשוואה להדמיה הקלאסית של נקודת הסיום. פרוטוקול זה מתאר כיצד הדמיה transcranial מאקרוסקופי משמש לחקר פונקציית מערכת גלימפהטית בעקבות הזרקה חריפה או כרונית של מעקב שדרתי הפלורסנט לתוך CM של מורדם/שינה או לישון עכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

נוזל מוחי שדרתי (שדרתי) זרימת מכרסמים כבר נחקרו בעיקר באמצעות לשעבר vivo קוונפיקציה של מנותבים. טכניקות כגון מיקרוסקופ 2-פוטון ותהודה מגנטית (MRI) הופעלו בvivo פיקציה של זרימת שדרתי, אבל הם מוגבלים על ידי מופחתת הדמיה של כרכים ורזולוציה מרחבית נמוכה, בהתאמה. העבודה האחרונה מצאה כי שדרתי נכנס את המוח בתוך מכסמה דרך רשת של חללים perivascular סביב העורקים החודר של קליפת מכרסם. זה הזנה וסקולרית של שדרתי הוא הנהג העיקרי של מערכת glymphatic, מסלול מעורב בסיווג של מסיסות מטבולית רעילים (למשל, עמילואיד-β). כאן, אנו ממחישים טכניקת דימות מקרוסקופי חדש המאפשר בזמן אמת, הדמיה מזוסקופית של מעבר שדרתי מפני פלורסנט דרך הגולגולת ללא פגע של עכברים חיים. שיטה מינימלית פולשנית זו מקלה על המון עיצובים ניסיוניים ומאפשרת בדיקה בודדת או חוזרת של דינמיקה של שדרתי. למקלוסקופים יש רזולוציה גבוהה של מרחבי וזמני ומרחק העבודה הגדול שלהם מאפשר דימות בעת ביצוע משימות על מכשירים התנהגותיים. גישה זו הדמיה כבר אומת באמצעות שני פוטונים הדמיה מדידות פלואורסצנטית שהתקבלו מטכניקה זו מאוד לתאם עם vivo לשעבר וכימות של מכשירי רדיו בעלי התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד הדמיה transcranial מאקרוסקופי ניתן להשתמש כדי להעריך את התחבורה הגלימפטית בעכברים חיים, המציעה חלופה נגישה ליותר שיטות הדמיה יקרות יותר.

זרם מוחי שדרתי מופעל על גבי מקרוסקופ אפיאוסקופי (איור 1A), המאפשר הדמיה מזוסקופית של הובלת מעקב שדרתי בקליפת מורטין. צלחת ראש הגולגולת כולה מאפשרת ויזואליזציה של עצמות האף rostral, הן העצמות הקדמית הקודקודית במרכז, ואת החלק הrostral של העצם הבין הקודקודית (איור 1B). ב...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Transcranial הדמיה אופטית מאפשרת הדמיה בשדה רחב של הובלה נוזל מוחי שדרתי בקליפת עכברים חיים דרך הגולגולת שלם.

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

טכניקה חדשה זו עבור הדמיה mesoscopic בזמן אמת של עקבות CSF פלורסנט דרך הגולגולת שלם של עכברים חיים ניתן להשתמש כדי להעריך תחבורה גלימפטית. היתרון העיקרי הוא שטכניקה זו מאפשרת מדידות דינמיות של עוקבים תוך-ריסטרנלים in-vivo בשבריר מעלותן של דרכים אחרות להדמיה. ההליכים הנדרשים כדי למקם את צלחת הראש על cisterna מגנה cannula הם פשוטים פולשניים מינימלית אבל דורשים תרגול להתבצע כראוי.הדגמה חזותית של השלבים הקריטיים של שיטה זו נדרשת כדי למקסם את איכות התמונה ולאפשר השוואות לשחזור בין עכברים שונים וקבוצות ניסוי. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן הרטיב את הצוואר והראש במים סטריליים וגלח את הפרווה הרטובה. נגב את העור החשוף עם ספוגית אלכוהול כדי להסיר כל שיער שיורית ולה מניח את העכבר במסגרת סטראוטקטית על גבי כרית מבוקרת טמפרטורה.יש למרוח משחה על עיני בעלי החיים ולנקות את העור החשוף בעזרת ספוגית כלורקסידין. לאחר 2 דקות להסיר את כלורהקסידין עם לנגב אלכוהול ולהחיל תותבת יוד. כאשר היודון התייבש להזריק משככי כאבים תת עוריים לתוך החלק העליון של הגולגולת והצוואר.החל מהחלק של הצוואר המכסה את קרום העורף, לעשות חתך קו האמצע בעור overlying ממשיך rostrally לכיוון הקו התוך-אורביאלי. מרחיבים את החתך באופן משני לגבול שבו שריר הזמן מכניס לתוך הגולגולת ומסירים את כל העור של החתך fusiform לחשוף הן את העצמות הקדמיות ואת עצמותקוד. להשקות את הגולגולת עם מלוחים סטריליים, ולהשתמש ספוגיות כותנה כדי לנקות את פני השטח עד שהוא ללא פסולת ושיער.לאחר החדרת קאנולה מגנה cisterna להחיל תערובת של מלט שיניים ודבק cyanoacrylate לצד הגחוני של צלחת הראש סביב הגבול. מניחים את צלחת הראש על הגולגולת כך שהגבול הקדמי של הצלחת מתיישר עם הקצה האחורי של עצם האף והגבול האחורי מתיישר עם ההיבט הקדמי של העצם הבין-דורית ומוודאים שהתפר הסגיטלי מרוכז וישר יחסית לחלון. חשוב לוודא כי צלחת הראש מאובטחת כי זה לא לחסום את שדה הראייה של cannulation מגנה cisterna.השתמש כמה טיפות של מאיץ דבק כדי לתקן את המיקום של צלחת הראש ולמלא את כל הפערים הנותרים עם תערובת המלט. הדבק את מיכל מגנה cisterna לצלחת הראש ולהשתמש בצלחת הראש כדי למקם את העכבר לתוך מחזיק הראש במצב קבוע. בזהירות למקם את העכבר ואת משאבת עירוי מחובר cannula על עגלה להובלה למאקרוסקופ ולהמקם את מחזיק הראש על הבמה של המקרוסקופ.ודא כי הקו ממשאבת המזרק אל cannula מגנה cisterna אינו מתוח, כי אין לו סטיות. שימו לב לקצב הנשימה ולצבע הוורוד של קרום הריר כדי לאשר חמצון טוב. הפעל את מצלמת המאקרוסקופ ואת דיודה פולטת האור והתחל את המצב החי.התאימו את ההגדלה של שדה ההדמיה כך שניתן יהיה לדמיין בבירור את התפר האף-פרונטאלי בחלק העליון של השדה ואת התפר הלמבדואידי בתחתית. פעם אחת במקום קלטת מחזיק הראש לשלב מקרוסקופ ולמקד את המקרוסקופ על הגולגולת החשופה עד מישור המוקד ממוקם בצדדים הצדדיים של עצמות קודקוד אחורי לתפרים הכתר. עבור עירוי מעקב CSF להגדיר את משאבת עירוי לקצב ונפח המתאים ולהגדיר את אורך גל העירור המתאים ואת זמן החשיפה עבור tracer עבור כל ערוץ.לאחר מכן ודא שפונקציית ההפעלה במאקרוסקופ נכונה לפני אתחול בו-זמנית של עירוי המעקב וההדמיה. במהלך ההדמיה ניתן לזהות בקלות את התפרים הקדמיים של האף, הסגיטל, קורונטל והלמבדואידים. לאחר מעקב CSF כבר החדיר לתוך מגנה cisterna הפלואורסצנטיות tracer נצפתה לראשונה בבריכות גדולות של CSF תת-אנכרוניאלי בבור האולפטופרונאלי ובבור המרובע ליד פגרת האצטרובל ובסופו של דבר מקיפה את עורקי המוח האמצעיים.עוקבי CSF ואז להיכנס למוח שלהם לאורך חללי כלי הדם פרי של ענפי פיפל קליפת המוח של העורק המוחי האמצעי. הדמיה הובלה CSF לאחר פגיעה מוחית טראומטית מגלה מעקב בתחילה בבור olfactofrontal אבל הזרם גלימפטי לאורך המרחבים כלי הדם קליפת המוח מבוטל לחלוטין בצד של הפציעה. ניתוח כמותי בתמונות in-vivo מראה כי אזור הזרימה ipsilateral הוא ירד כמעט שליש לעומת חצי הכדור ההפוך.כדי למנוע חפצי תנועה והשינויים במישור המוקד זכור לאבטח כראוי את לוחית הראש ואת מחזיק לוחית הראש ולבדוק את רמת ההרדמה של החיה. לאחר הניסוי בתוצאות הדמיה in-vivo ניתן לאמת עוד יותר על ידי כימות חדירת המעקב באמצעות בפועל טכניקה זו מאפשרת את המחקר של המערכת גלימפטית באופן פיזיולוגי פולשני מינימלי יכול לעזור לענות על שאלות עתידיות על הידרודינמיקה CSF בבריאות ומחלות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...