Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke e dal National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), il programma Fondation Leducq Transatlantic Networks of Excellence e il programma di ricerca e innovazione EU Horizon 2020 (n. 666881; SVDs-target). Ringraziamo anche Dan Xue per l'assistenza di esperti con illustrazioni grafiche.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali (UCAR, Protocollo n. 2011-023) presso l'Università di Rochester ed eseguiti secondo la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Preparazione della cisterna magna cannula, della piastra di testa e del supporto della testa
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e le piastre della testa prima dell'intervento chirurgico. NOTA: I traccianti fluorescenti vengono conse...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione di imaging TRANScranico CSF in topi vivi utilizzando macroscopi fluorescenti e traccianti fluorescenti disponibili in commercio. Questa tecnica è semplice e minimamente invasiva, ma quantitativa. L'imaging in vivo è ben correlato con metodi sensibili come il conteggio della scintillazione liquida di traccianti con etichetta radio, tra cui 3H-dextran e 14C-inulin dopo la consegna CM, e con la quantificazione della sezione coronale ex vivo...

Il liquido cerebrospinale (CSF) bagna il cervello e il midollo spinale ed è coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi, nella fornitura di nutrienti e nella regolazione della pressione intracranica1. CSF nello spazio subaracnoideo entra nel cervello attraverso una rete di spazi perivascolari (PVS) che circondano le arterie corticali piali e poi scorre lungo arteriole penetranti2. Una volta nel parenchyma, CSF si scambia con il fluido interstiziale (ISF), trasportando metaboliti nocivi come l'amiloide-z (A) e gli aggregati proteici tau fuori dal cervello attraverso tratti di materia bianca a bassa resistenza e spazi perivenous2,3 . Questa via dipende dai canali astrogliali di acquaporina-4 (AQP4) ed è stata quindi definita il sistema gliale-linfatico (glimphatico)4. I prodotti di scarto del neuropil vengono infine eliminati dal CSF-ISF attraverso vasi linfatici vicino ai nervi cranici e nelle meningi verso i linfonodi cervicali5. Il fallimento di questo sistema è stato implicato in diverse malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer6,7, lesioni cerebrali traumatiche3, e ictus ischemico ed emorragico8.
Il trasporto CSF può essere visualizzato infondendo traccianti nella cisterna magna (CM)9,10 e studi glimphatici in passato hanno utilizzato principalmente la microscopia a due fotoni4,11,12, 13, risonanza magnetica (RM)14,15,16,17ed ex vivo imaging3,6,11, 18 per valutare la cinetica tracciante. La microscopia a due fotoni è un metodo adatto per l'imaging dettagliato dei traccianti CSF nei PVS e del parenchyma a causa della sua alta risoluzione spaziale, tuttavia, ha un campo visivo stretto e richiede una finestra cranica invasiva o un assottigliamento del cranio. L'imaging ex vivo, in combinazione con l'immunohistochimica, consente analisi multilivello che vanno da singole cellule fino all'intero cervello19. Tuttavia, il processo di perfusione-fissazione che è necessario per osservare il tessuto post-mortem produce profondi cambiamenti nella direzione del flusso CSF e collassa il PVS, alterando significativamente la distribuzione e la posizione dei traccianti12. Infine, mentre la risonanza magnetica può tracciare il flusso di CSF in tutto il murino e il cervello umano, manca di risoluzione spaziale e temporale del flusso perivascolare.
Una nuova tecnica, l'imaging macroscopico transcranico, risolve alcuni di questi limiti consentendo l'imaging ad ampio campo del trasporto di CSF perivascolare nell'intera corteccia dorsale dei topi viventi. Questo tipo di imaging viene eseguito con un macroscopio epifluorescente utilizzando un cubo di filtro multibanda, una sorgente luminosa a LED regolabile e una fotocamera CMOS ad alta efficienza10. Questi set-up sono in grado di risolvere PVS fino a 1-2 mm sotto la superficie del cranio e in grado di rilevare fluorofori fino a 5-6 mm sotto la superficie corticale, lasciando il cranio completamente intatto10. Filtri multibanda e LED in grado di ottimizzare rapidamente la lunghezza d'onda dell'eccitazione consentono l'uso di più fluorofori che consentono alla CSF di essere etichettati con traccianti di diversi pesi molecolari e proprietà chimiche nello stesso esperimento.
Questa procedura richiede un intervento chirurgico semplice e minimamente invasivo per esporre il cranio e posizionare una piastra della testa leggera per stabilizzare la testa durante la sessione di imaging. I traccianti possono essere consegnati nel CM senza perforare nel cranio o penetrare nel tessuto corticale con pipette o cannulas9,20. Sia le cannule CM che le piastre della testa rimangono stabili da diversi giorni a settimane e facilitano progetti sperimentali più complessi rispetto alla classica visualizzazione del punto finale. Questo protocollo descrive come l'imaging macroscopico transcranico viene utilizzato per studiare la funzione del sistema glimphatico a seguito di iniezione acuta o cronica di tracciante CSF fluorescente nel CM di topi anestetizzati/dormienti o svegli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

Il flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nei roditori è stato ampiamente studiato utilizzando la quantificazione ex vivo dei traccianti. Tecniche come la microscopia a due fotoni e la risonanza magnetica (MRI) hanno permesso la quantificazione in vivo del flusso CSF, ma sono limitate rispettivamente dalla riduzione dei volumi di imaging e dalla bassa risoluzione spaziale. Recenti lavori hanno scoperto che il CSF entra nel parenchyma cerebrale attraverso una rete di spazi perivascolari che circondano il pial e le arterie penetranti della corteccia dei roditori. Questa entrata pericolare di CSF è un fattore principale del sistema glimphatico, una via implicata nella clearance dei soluti metabolici tossici (ad es. amiloide-z). Qui, illustriamo una nuova tecnica di imaging macroscopico che permette l'imaging mesoscopico in tempo reale dei traccianti CSF fluorescenti attraverso il cranio intatto dei topi vivi. Questo metodo minimamente invasivo facilita una moltitudine di progetti sperimentali e consente test singoli o ripetuti delle dinamiche CSF. I Macroscopi hanno un'alta risoluzione spaziale e temporale e la loro grande distanza di gantry e lavoro consentono l'imaging durante l'esecuzione di attività sui dispositivi comportamentali. Questo approccio di imaging è stato convalidato utilizzando misurazioni di imaging a due fotoni e fluorescenza ottenute da questa tecnica fortemente correlate alla fluorescenza ex vivo e alla quantificazione dei traccianti con etichetta radio. In questo protocollo, descriviamo come l'imaging macroscopico transcranico può essere utilizzato per valutare il trasporto glimphatico nei topi vivi, offrendo un'alternativa accessibile a modalità di imaging più costose.

L'afflusso di CSF è rappresentato su un macroscopio epifluorescente (Figura 1A), che consente l'imaging mesoscopico del trasporto tracciante CSF nella corteccia murina. La piastra della testa integrale permette la visualizzazione delle ossa nasali rostrali, sia ossa frontali che parietali al centro, e la porzione rostrale dell'osso interparietale caudally (Figura 1B). Durante l'imaging, le suture nasofrontale, sagittale, coronale e lambdoid possono essere facil...

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In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

L'imaging ottico transcranico consente l'imaging ad ampio campo del trasporto di fluidi cerebrospinali nella corteccia di topi vivi attraverso un cranio intatto.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Questa nuova tecnica per l'imaging mesoscopico in tempo reale di tracce florescenti di CSF attraverso il cranio intatto di topi vivi può essere utilizzata per valutare il trasporto linfomanico. Il vantaggio principale è che questa tecnica consente misurazioni dinamiche di traccianti intracisternali in vivo a una frazione del costo di altre modalità di imaging. Le procedure necessarie per posizionare la piastra della testa sulla cisterna magna cannula sono semplici e minimamente invasive ma richiedono una pratica corretta.La dimostrazione visiva dei passaggi critici di questo metodo è necessaria per massimizzare la qualità dell'immagine e consentire confronti riproducibili tra topi diversi e gruppi sperimentali. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi bagnato il collo e la testa con acqua sterile e radere la pelliccia inumidita. Pulire la pelle esposta con un tampone alcolico per rimuovere eventuali capelli residui e posizionare il mouse in un telaio stereotattico sopra un tampone a temperatura controllata.Applicare un unguento sugli occhi degli animali e pulire la pelle esposta con un tampone di clorexidina. Dopo 2 minuti rimuovere la clorexidina con una salvietta alcolica e applicare una soluzione di iodone. Quando lo iodone ha essiccato iniettare analgesia sottocutanea nella parte superiore del cranio e del collo.Partendo dalla parte del collo che copre la crosta occipitale, fare un taglio a metà linea nella pelle sovrastante proseguendo rostralmente verso la linea intraorbitale. Estendere l'incisione lateralmente al bordo dove il muscolo temporale si inserisce nel cranio e rimuovere tutta la pelle dell'incisione fusiforme per esporre sia le ossa frontali che parietali. Irrigare il cranio con soluzione salina sterile e utilizzare tamponi di cotone per pulire la superficie fino a quando non è priva di detriti e capelli.Dopo aver inserito la cisterna magna cannula applicare una miscela di cemento dentale e colla cianoacrilato sul lato ventrale della piastra della testa intorno al bordo. Posizionare la piastra della testa sul cranio in modo che il bordo anteriore della piastra si allinei con la punta posteriore dell'osso nasale e il bordo posteriore si allinei con l'aspetto anteriore dell'osso interparietale assicurandosi che la sutura sagittale sia centrata e dritta rispetto alla finestra. È importante assicurarsi che la piastra della testa sia fissata e che non ostruisca il campo visivo della cannula cisterna magna.Utilizzare un paio di gocce di acceleratore di colla per fissare la posizione della piastra della testa e riempire eventuali spazi rimanenti con la miscela di cemento. Incollare la cisterna magna cannula sulla piastra della testa e utilizzare la piastra della testa per posizionare il mouse nel supporto della testa in posizione fissa. Posizionare con cura il mouse e la pompa di infusione attaccati alla cannula su un carrello per il trasporto al macroscopio e posizionare il supporto della testa sul palco del macroscopio.Assicurarsi che la linea dalla pompa della siringa alla cisterna magna cannula non sia tesa e che non abbia nodi. Osservare la frequenza respiratoria e la colorazione rosa delle membrane del muco per confermare una buona ossigenazione. Accendi la fotocamera del macroscopio e il diodo che emette luce e avvia la modalità live.Regolare l'ingrandimento del campo di imaging in modo che la sutura nasofrontale nella parte superiore del campo e la sutura lambdoide nella parte inferiore possano essere chiaramente visualizzate. Una volta in posizione nastro il supporto della testa allo stadio macroscopio e mettere a fuoco il macroscopio sul cranio esposto fino a quando il piano focale non si trova sui lati laterali delle ossa parietali posteriori alle suture coronali. Per l'infusione di tracciante CSF impostare la pompa per infusione alla velocità e al volume appropriati e impostare la lunghezza d'onda di eccitazione e il tempo di esposizione appropriati per il tracciante per ciascun canale.Quindi verificare che la funzione di attivazione sul macroscopio sia corretta prima di avviare contemporaneamente l'infusione di tracciante e l'imaging. Durante l'imaging le suture naso frontali, sagittali, coronali e lambdoidi possono essere facilmente identificate. Una volta che il tracciante CSF è stato infuso nella cisterna magna, la fluorescenza del tracciante viene osservata per la prima volta in grandi pozze di CSF subaracnoide alla cisterna olfattofrontale e alla cisterna quadrigeminale vicino alla rientranza pineale e infine circondando le arterie cerebrali centrali.I traccianti CSF entrano quindi nel loro cervello lungo gli spazi vascolari peri dei rami pettorale corticali dell'arteria cerebrale centrale. L'imaging di trasporto CSF dopo una lesione cerebrale traumatica rivela tracciante inizialmente alla cisterna olfattofrontale, ma l'afflusso linfomanico lungo gli spazi perivascolari corticali è completamente abolito sul lato della lesione. L'analisi quantitativa nelle immagini in vivo dimostra che l'area di afflusso ipsilaterale è diminuita di quasi un terzo rispetto all'emisfero contralaterale.Per evitare artefatti di movimento e i cambiamenti nel piano focale ricordarsi di fissare correttamente la piastra della testa e il supporto della piastra della testa e controllare il livello di anestesia dell'animale. Dopo l'esperimento i risultati dell'imaging in vivo possono essere ulteriormente convalidati quantificando la penetrazione del tracciante utilizzando l'attuale Questa tecnica consente lo studio del sistema glimphatico in modo fisiologico e minimamente invasivo e può aiutare ad affrontare le domande future sull'idrodinamica del CSF in salute e malattia.

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