Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
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이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소와 노화에 국립 연구소에 의해 투자 되었다 (건강의 미국 국립 연구소; R01NS100366 및 RF1AG057575- MN, 우수 프로그램의 Fondation Leducq 대서양 횡단 네트워크, 그리고 EU 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 번호 666881; SVDs@대상). 또한 그래픽 일러스트레이션에 대한 전문적인 도움을 주신 Dan Xue에게 도왔습니다.

모든 실험은 로체스터 대학에서 동물 자원 대학위원회 (UCAR, 프로토콜 번호 2011-023)에 의해 승인되고 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에 따라 수행되었습니다.
1. 시스터나 마그나 캐뉼라, 헤드 플레이트 및 헤드 홀더 준비
<ol><li>수술 전에 모든 수술 기구와 머리 판을 살균하십시오. 참고: 형광 트레이서는 시스터나 마그나 캐너레이션을 통해 CSF로 직접 전달됩?...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

우리는 상업적으로 이용 가능한 형광 대식검 및 추적자를 사용하여 살아있는 마우스에 있는 경두개 CSF 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위한 상세한 프로토콜을 기술했습니다. 이 기술은 간단하고 최소 침습적이지만 정량적입니다. 생체 내 이미징은 CM 전달 후 3H-dextran 및 14C-inulin을 포함한 무선 표지 추적자의 액체 섬광 계수 계수와 전 생체 코로나 섹션 정량화10과...

뇌척수액 (CSF)은 뇌와 척수를 목욕시키고 항상성을 유지하고 영양분을 공급하며 두개내 압력을 조절하는 데 관여합니다1. 지주막 공간에서 CSF는 피질 피질 동맥을 둘러싼 관통 공간 (PVS)의 네트워크를 통해 뇌로 들어간 다음 관통 하는 동맥을 따라 아래로 흐른다2. 일단 자중에서, CSF는 간질 액체 (ISF)와 교환하고, 낮은 저항성 백색 물질 관 및 perivenous 공간을 통해 뇌에서 아밀로이드 β (Aβ)및 타우 단백질 응집체와 같은 유해한 대사 산물을 운반2,3 . 이 통로는 astroglial aquaporin-4 (AQP4) 채널에 의존하고 따라서 신경교 림프 (glymphatic)시스템 4라고 불려왔다. 신경필의 노폐물은 궁극적으로 CSF-ISF로부터 두개골 신경 근처의 림프관과 자궁 경부 림프절쪽으로 수막에서 5. 이 시스템의 실패는 알츠하이머병 6,7,외상성 뇌 손상 3, 허혈성및 출혈성 뇌졸중 8과 같은여러 신경질환에 연루되어 있다.
CSF 수송은 과거에 시스터나 마그나 (CM)9,10 및 림프관 연구에 트레이서를 주입하여 가시화 할 수 있으며, 주로 2 광자 현미경4,11,12, 13,자기 공명 영상 (MRI)14,15,16,17,및 생체 내 이미징3,6,11, 도 18을 통해 트레이서 역학을 평가한다. 2 광자 현미경 검사법은 그것의 높은 공간 해결책 때문에 PVS및 실치에 있는 CSF 추적자의 상세한 화상 진찰을 위한 적당한 방법입니다, 그러나, 보기의 좁은 필드를 가지고 있고 침략적인 두개골 창 또는 두개골의 숱이 필요합니다. Ex vivo 화상 진찰은, 면역 성 화학과 조합하여, 전체 두뇌19에단 하나 세포에서 구역 수색하는 다단계 분석을 가능하게 합니다. 그러나, 사후 모템 조직을 관찰하는 데 필요한 관류-고정 과정은 CSF 흐름 방향에 중대한 변화를 일으키고 PVS를 붕괴시키고, 트레이서(12)의 분포 및 위치를 현저하게 변화시다. 마지막으로 MRI는 전체 뮤린과 인간의 뇌에 걸쳐 CSF 흐름을 추적 할 수 있지만, 그것은 공간 및 시간 적 흐름의 부족.
새로운 기술, 경두개 거시적 이미징은 살아있는 마우스의 전체 등지 피질에서 경막 CSF 수송의 광시야 이미징을 가능하게함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결합니다. 이러한 유형의 이미징은 멀티밴드 필터 큐브, 튜닝 가능한 LED 광원 및 고효율 CMOS 카메라10을사용하는 에피플루서성 대식경으로 수행된다. 이 설정은 두개골 표면 아래 1-2mm까지 PVS를 해결할 수 있으며 두개골을 완전히 그대로 유지하면서 피질 표면 아래 5-6mm까지 형광을 감지 할 수 있습니다10. 여기 파장을 빠르게 조정할 수 있는 멀티밴드 필터와 LED를 사용하면 여러 형광단을 사용할 수 있으므로 CSF는 동일한 실험에서 다양한 분자량 및 화학적 특성의 트레이서로 라벨을 부착할 수 있습니다.
이 절차는 두개골을 노출하고 화상 진찰 세션 도중 머리를 안정시키기 위하여 가벼운 무게 헤드 격판을 두기 위하여 간단하고, 최소침습 수술이 필요합니다. 트레이서는 두개골에 드릴링하거나 피펫 또는 캐뉼러9,20으로피질 조직을 관통하지 않고 CM으로 전달 될 수 있습니다. CM 캐뉼라와 헤드 플레이트는 며칠에서 몇 주까지 안정적으로 유지되며 클래식 엔드포인트 시각화에 비해 보다 복잡한 실험 설계를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 경두개 거시적 이미징이 마취/수면 또는 깨어있는 마우스의 CM에 형광 CSF 추적자의 급성 또는 만성 주입 다음 림프계 기능을 연구하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

설치류의 뇌척수액(CSF) 흐름은 주로 트레이서의 생체 내 정량화를 사용하여 연구되었습니다. 2 광자 현미경 검사법 및 자기 공명 화상 진찰과 같은 기술은 CSF 교류의 생체 내 정량화에서 가능하게 했습니다 그러나 감소된 화상 진찰 부피 및 낮은 공간 해상도에 의해 각각 제한됩니다. 최근 연구는 CSF가 설치류 피질의 pial 및 관통 동맥을 둘러싼 관통 공간의 네트워크를 통해 뇌 의 자렌치마를 입력 하는 것으로 나타났습니다. CSF의 이러한 관능적 진입은 림프계의 주요 동인이며, 독성 대사 용질(예를 들어, 아밀로이드 β)의 통관에 연루된 통로이다. 여기에서, 우리는 살아있는 마우스의 본래 두개골을 통해 형광 CSF 추적자의 실시간, mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 새로운 거시적인 화상 진찰 기술을 설명합니다. 이 최소 침습 적 방법은 다양한 실험 설계를 용이하게하고 CSF 역학의 단일 또는 반복 테스트를 가능하게합니다. 대용량 자리는 높은 공간 및 시간 해상도를 가지고 있으며, 그들의 큰 갠트리 및 작업 거리는 행동 장치에서 작업을 수행하는 동안 이미징을 허용합니다. 이 화상 진찰 접근은 이 기술에서 얻은 2 광자 화상 진찰 및 형광 측정을 사용하여 전 생체 외 형광 및 무선 표지한 추적자의 정량화와 강하게 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 경두개 거시적인 화상 진찰이 살아있는 마우스에 있는 림프수송을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 기술합니다, 더 비싼 화상 진찰 양식에 접근가능한 대안을 제안하.

CSF 유입은 뮤린 피질에 있는 CSF 추적자 수송의 mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 epifluorescent 대식경 (그림1A)에심상합니다. 전체 두개골 머리 플레이트는 중앙에 있는 전두엽 및 정수리 뼈 둘 다, 및 interparietal 뼈의 rostral 부분 의 가시화를 허용합니다 (그림1B). 이미징 동안, 비전두, 시상, 관상 및 양두봉합사를 쉽게 식별할 수 있다(도1C).</stro...

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In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

살아있는 마우스의 손상되지 않은 두개골을 통해 플로레스센트 CSF 추적의 실시간 중시경 이미징을위한이 새로운 기술은 글리프파틱 수송을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 주요 장점은 이 기법이 다른 이미징 양식의 비용의 일부에서 생체 내 인종 차별 추적자의 동적 측정을 가능하게 한다는 것입니다. 시스테나 마그나 캐뉼라에 헤드 플레이트를 배치하는 데 필요한 절차는 간단하고 최소침습적이지만 올바르게 수행되어야하는 연습이 필요합니다.이 방법의 중요한 단계의 시각적 데모는 이미지 품질을 극대화하고 다른 마우스와 실험 그룹 간의 재현 가능한 비교를 가능하게하는 데 필요합니다. 발가락에 대한 반응의 부족을 확인 한 후 발가락 핀치는 목과 머리를 멸균물로 적시고 촉촉한 털을 면도합니다. 노출된 피부를 알코올 면봉으로 닦아 잔류 모발을 제거하고 온도를 조절하는 패드 위에 마우스를 고정 프레임에 놓습니다.동물의 눈에 연고를 바르고 클로레히시딘 면봉으로 노출된 피부를 청소합니다. 2 분 후 알코올 닦아 클로렉시딘을 제거하고 요오드 솔루션을 적용합니다. 요오드가 건조되면 두개골과 목 의 상단에 피하 진통을 주입합니다.목 껍질을 덮는 목 부분에서 시작하여 오버리 스킨에서 중간 선을 자르면 궤도 선을 향해 장엄하게 계속됩니다. 절개를 측면으로 테두리로 확장하여 측두근육이 두개골에 삽입하고 퍼지폼 절개의 모든 피부를 제거하여 전두엽과 정수리 뼈를 모두 노출시합니다. 두개골을 멸균식식염수로 관개하고 면봉을 사용하여 이물질과 머리카락이 없는 때까지 표면을 청소합니다.시스테나 마그나 캐뉼라를 삽입한 후 치과 시멘트와 시아노아크라일트 접착제를 테두리 주변의 헤드 플레이트의 복부 측에 바친다. 플레이트의 전방 경계가 비강 뼈의 후방 끝과 정렬되도록 두개골에 머리 판을 배치하고 후방 테두리는 경상부 봉합사가 창에 비해 중심적이고 직선적되도록 중간 골반의 전방 측면과 정렬되도록합니다. 헤드 플레이트가 고정되어 있고 시스테나 마그나 캐니옹의 시야를 방해하지 않도록 하는 것이 중요합니다.접착제 가속기 몇 방울을 사용하여 헤드 플레이트의 위치를 수정하고 시멘트 혼합물로 남은 간격을 채웁니다. 시스테르나 마그나 캐뉼라를 헤드 플레이트에 붙이고 헤드 플레이트를 사용하여 마우스를 고정된 위치에 머리 홀더에 넣습니다. 조심스럽게 마우스와 주입 펌프를 카트에 부착하여 거시스코프로 운반하고 머리 홀더를 거시스코프 의 무대에 놓습니다.주사기 펌프에서 시스테나 마그나 캐뉼라에 이르는 라인이 팽팽하지 않고 꼬임이 없는지 확인하십시오. 점액막의 호흡률과 분홍색 착색을 관찰하여 양호한 산소화를 확인한다. 거시스코프 카메라와 발광 다이오드를 켜고 라이브 모드를 시작합니다.화상 진찰 필드의 배율을 조정하여 필드의 상단에 있는 nasofrontal 봉합사 및 하단에 있는 lambdoid 봉합사가 명확하게 시각화될 수 있도록 합니다. 일단 제자리에 테이프로 머리 홀더를 거시스코프 스테이지에 표시하고 초점 평면이 정수리 뼈 후방의 측면부에 관상 봉합사에 위치 할 때까지 노출 된 두개골에 매크로 코프를 집중시합니다. CSF 트레이서 주입의 경우 주입 펌프를 적절한 속도와 부피로 설정하고 각 채널에 대한 트레이서에 대한 적절한 흥분 파장 및 노출 시간을 설정합니다.그런 다음 추적기 주입 및 이미징을 동시에 시작하기 전에 거시스코프의 트리거링 기능이 올바른지 확인합니다. 나소 정면, 처상, 관상 및 람도이드 봉합사를 이미징하는 동안 쉽게 식별 할 수 있습니다. CSF 트레이서가 시스테나 마그나에 주입되면 트레이서 형광은 올리티오프탈 시스테른과 송과휴소 근처의 사분간 시스테른의 수막 CSF의 큰 풀에서 처음 관찰되고 결국 중간 뇌동맥을 둘러싸게 된다.CSF 추적자는 그 때 중간 대뇌 동맥의 피질 화줌 분기의 peri 혈관 공간을 따라 그들의 두뇌를 입력합니다. 외상성 뇌 손상 후 CSF 수송 화상 진찰은 olfactofrontal cistern에서 처음에 추적자를 제시하지만 피질 인식 공간을 따라 심혈 유입은 부상의 측면에 완전히 폐지된다. 생체 내 이미지에서의 정량적 분석은 ipsilateral 유입 영역이 반구에 비해 거의 3분의 1 감소한다는 것을 보여줍니다.모션 아티팩트와 초점 평면의 변화를 피하려면 헤드 플레이트와 헤드 플레이트 홀더를 올바르게 고정하고 동물의 마취 수준을 확인하는 것을 기억합니다. 실험 후 생체 내 이미징 결과는 실제 이 기술을 사용하여 트레이서 침투를 정량화함으로써 더욱 검증될 수 있으며, 생리적이고 최소침습적인 방식으로 글리프파틱 시스템의 연구를 허용하고 건강과 질병의 CSF 유체역학에 대한 향후 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

연구

신경과학

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...