Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e pelo Instituto Nacional de envelhecimento (institutos nacionais de saúde dos EUA; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), o programa de redes de excelência transatlântica Fondation Leducq e o programa de investigação e inovação da UE Horizon 2020 (subvenção n. º 666881; SVDs @ Target). Também gostaríamos de agradecer a Dan Xue pela assistência especializada com ilustrações gráficas.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê universitário de recursos animais (UCAR, protocolo n º 2011-023) da Universidade de Rochester e realizados de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. preparando a cânula da cisterna magna, a placa principal, e o suporte principal
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e placas de cabeça antes da cirurgia. Nota: os traçadores fluorescentes são entregados diretamente no CSF através de ...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Nós descrevemos um protocolo detalhado para executar a imagem latente Transcranial do CSF em ratos vivos usando macroscópios e traçadores fluorescentes comercialmente-disponíveis. Esta técnica é simples e minimamente invasiva, mas quantitativa. A imagem latente in vivo correlaciona bem com os métodos sensíveis tais como a contagem líquida do cintilação de traçadores rádio-etiquetados que incluem 3H-Dextran e 14C-Inulin após a entrega do cm, e com a quantificação ex vivo da seção co...

O líquido cefalorraquidiano (LCR) Bane o cérebro e a medula espinhal e está envolvido na manutenção da homeostase, fornecendo nutrientes e regulando a pressão intracraniana1. O CSF no espaço subarachnoid entra no cérebro através de uma rede de espaços perivasculares (PVS) que cercam artérias pial corticais e flui então para baixo ao longo das arteríolas penetrantes2. Uma vez no parênquima, as trocas de LCR com fluido intersticial (ISF), transportando metabólitos nocivos como amiloide-β (aβ) e proteínas tau agregam fora do cérebro através de intervalos de matéria branca de baixa resistência e espaços perivenosos2,3 . Este caminho é dependente de astroglial Aquaporin-4 (AQP4) canais e, portanto, tem sido denominado o glial-linfático (glymphatic) sistema4. Os produtos waste do neurópilo são cancelados finalmente do CSF-ISF através dos vasos linfáticos perto dos nervos cranianos e nas meninges para fora para os nós de linfa cervicais5. A falha deste sistema foi implicada em diversas doenças neurológicas tais como a doença de Alzheimer6,7, ferimento de cérebro traumático3, e curso isquêmico e hemorrágico8.
O transporte do CSF pode ser visualizado pela infusão de traçadores na cisterna magna (cm)9,10 e os estudos glicmfáticos no passado utilizaram principalmente a microscopia de dois fótons4,11,12, 12, 13, ressonância magnética (RM)14,15,16,17e ex vivo Imaging3,6,11, 18 para avaliar a cinética do traçador. A microscopia do dois-fotão é um método apropriado para a imagem latente detalhada de traçadores do CSF nos PVSs e o parênquima devido a sua definição espacial elevada, entretanto, tem um campo de visão estreito e exige uma janela craniana invasora ou um afinamento do crânio. A imagem latente ex vivo, em combinação com Immunohistochemistry, permite análises multinível que variam das únicas pilhas até o cérebro inteiro19. No entanto, o processo de fixação da perfusão que é necessário para observar o tecido pós-morte produz profundas mudanças na direção do fluxo do LCR e colapsa o PVS, alterando significativamente a distribuição e a localização dos traçadores12. Finalmente, quando MRI puder controlar o fluxo do CSF durante todo o cérebro murino e humano inteiro, falta a definição espacial e temporal do fluxo perivascular.
Uma técnica nova, imagem latente macroscópica transcraniana, resolve algumas destas limitações permitindo a imagem latente do largo-campo do transporte perivascular do CSF no córtice dorsal inteiro de ratos vivos. Este tipo de imagem é feito com um Macroscópio epifluorescente usando um cubo de filtro multibanda, fonte de luz LED sintonável, e câmera CMOS de alta eficiência10. Estes set-ups são capazes de resolver PVSs até 1-2 mm abaixo da superfície do crânio e pode detectar fluoróforos até 5-6 mm abaixo da superfície cortical, deixando o crânio totalmente intacto10. Os filtros e os diodos emissores de luz Multiband que podem rapidamente ajustar o comprimento de onda da excitação permitem o uso de fluoróforos múltiplos permitindo que o CSF seja etiquetado com os traçadores de pesos moleculars e de propriedades químicas diferentes na mesma experiência.
Este procedimento requer uma cirurgia simples, minimamente invasiva para expor o crânio e colocar uma placa de cabeça de peso leve para estabilizar a cabeça durante a sessão de imagem. Os traçadores podem ser entregues no cm sem perfurar no crânio ou penetrar o tecido cortical com pipetas ou cânulas9,20. Ambas as cânulas CM e placas de cabeça permanecem estáveis por vários dias a semanas e facilitam projetos experimentais mais complexos em comparação com a visualização clássica do ponto final. Este protocolo descreve como a imagem latente macroscópica Transcranial é usada para estudar a função glymphatic do sistema que segue a injeção aguda ou crônica do Tracer fluorescente do CSF no CM de ratos anestesiados/dormindo ou acordados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

O fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores tem sido largamente estudado com quantificação ex vivo de Traçadores. As técnicas tais como a microscopia do dois-fotão e a imagem latente de ressonância magnética (MRI) permitiram in vivo a quantificação do fluxo do CSF mas são limitadas por volumes reduzidos da imagem latente e pela baixa definição espacial, respectivamente. O trabalho recente constatou que o LCR entra no parênquima cerebral através de uma rede de espaços perivasculares em torno das artérias piais e penetrantes do córtex do roedor. Esta entrada perivascular do CSF é um excitador preliminar do sistema glymphatic, um caminho implicado no afastamento de solutos metabólicos tóxicos (por exemplo, amyloid-β). Aqui, nós ilustramos uma técnica macroscópica nova da imagem latente que permita o tempo real, imagem latente mesoscópicos de traçadores fluorescentes do CSF através do crânio intacto de ratos vivos. Este método minimamente invasivo facilita uma infinidade de experimentos experimentais e permite o teste único ou repetido da dinâmica do LCR. Os macroscópios têm alta resolução espacial e temporal e seu grande pórtico e distância de trabalho permitem a criação de imagens durante a execução de tarefas em dispositivos comportamentais. Esta aproximação da imagem latente foi validada usando a imagem latente do dois-fotão e as medidas da fluorescência obtidas desta técnica correlacionam fortemente com a fluorescência ex vivo e a quantificação de Tracers rádio-etiquetados. Neste protocolo, nós descrevemos como a imagem latente macroscópica Transcranial pode ser usada para avaliar o transporte glymphatic em ratos vivos, oferecendo uma alternativa acessível às modalidades mais caras da imagem latente.

O afluxo do CSF é imaged em um Macroscópio epifluorescente (Figura 1a), que permita a imagem latente mesoscópicos do transporte do Tracer do CSF no córtice murino. A placa da cabeça do inteiro-crânio permite o visualização dos ossos nasais rostral, dos ossos frontais e parietal no centro, e da parcela rostral do osso interparietal caudalmente (Figura 1b). Durante a imagem, as suturas nasofrontal, sagital, coronal e lambdóide podem ser prontamente identi...

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In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Esta nova técnica para imagens mesoscópicas em tempo real de traços florescente de CSF através do crânio intacto de ratos vivos pode ser usada para avaliar o transporte glifático. A principal vantagem é que essa técnica permite medições dinâmicas de rastreadores intracisternais in-vivo a uma fração do custo de outras modalidades de imagem. Os procedimentos necessários para colocar a placa da cabeça na cisterna magna cânula são simples e minimamente invasivos, mas exigem que a prática seja realizada corretamente.A demonstração visual das etapas críticas deste método é necessária para maximizar a qualidade da imagem e permitir comparações reprodutíveis entre diferentes camundongos e grupos experimentais. Depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, molhar o pescoço e a cabeça com água estéril e raspar a pele umedeçada. Limpe a pele exposta com um cotonete de álcool para remover qualquer cabelo residual e coloque o mouse em uma moldura estereotática em cima de uma almofada controlada pela temperatura.Aplique pomada nos olhos dos animais e limpe a pele exposta com um cotonete de Clorhexidine. Após 2 minutos, remova a Clorhexidine com um lenço de álcool e aplique uma solução de iodona. Quando a iodota tiver injetado analgesia subcutânea no topo do crânio e pescoço.Começando na parte do pescoço que cobre a crosta occipital, faça um corte médio na pele sobreposta continuando rostrally em direção à linha intraorbital. Estenda a incisão lateralmente até a borda onde o músculo temporal insere no crânio e remova toda a pele da incisão fusiforme para expor os ossos frontal e parietal. Irrigar o crânio com soro fisiológico estéril, e use cotonetes de algodão para limpar a superfície até que esteja livre de detritos e cabelos.Após inserir a cisterna magna cânula aplique uma mistura de cimento dental e cola cianoacrilato no lado ventral da placa da cabeça ao redor da borda. Coloque a placa da cabeça sobre o crânio para que a borda anterior da placa se alinhe com a ponta posterior do osso nasal e a borda posterior se alinhe com o aspecto anterior do osso interparietal certificando-se de que a sutura sagital esteja centrada e reta em relação à janela. É importante garantir que a placa da cabeça esteja presa e que não obstrua o campo de visão da cisterna magna cannulation.Use algumas gotas de acelerador de cola para fixar a posição da placa da cabeça e preencher quaisquer lacunas restantes com a mistura de cimento. Cole a cisterna magna cânula na placa da cabeça e use a placa da cabeça para colocar o mouse no suporte da cabeça em uma posição fixa. Coloque cuidadosamente o mouse e a bomba de infusão presa à cânula em um carrinho para transporte ao macroscópio e coloque o porta-cabeça no palco do macroscópio.Certifique-se de que a linha da bomba de seringa até a cisterna magna cânula não está esticada e que não tem dobras. Observe a taxa respiratória e coloração rosa das membranas mucosas para confirmar uma boa oxigenação. Ligue a câmera do macroscópio e o diodo emissor de luz e inicie o modo ao vivo.Ajuste a ampliação do campo de imagem para que a sutura nasofrontal na parte superior do campo e a sutura lambdoid na parte inferior possam ser claramente visualizadas. Uma vez no lugar, tape o suporte da cabeça para o estágio do macroscópio e concentre o macroscópio no crânio exposto até que o plano focal esteja localizado nas laterais laterais dos ossos parietal posteriores às suturas coronais. Para a infusão do rastreador CSF, ajuste a bomba de infusão na taxa e volume apropriados e defina o comprimento de onda de excitação apropriado e o tempo de exposição do rastreador para cada canal.Em seguida, verifique se a função de acionamento no macroscópio está correta antes de iniciar simultaneamente a infusão do rastreador e a imagem. Durante a imagem, as suturas naso frontal, sagital, coronal e lambdoid podem ser prontamente identificadas. Uma vez que o rastreador CSF tenha sido infundido na cisterna magna, a fluorescência do rastreador é observada pela primeira vez em grandes piscinas de CSF subaracnóide na cisterna olfactofrontal e na cisterna quadrigeminal perto do recesso pineal e eventualmente em torno das artérias cerebrais médias.Os rastreadores CSF então entram em seu cérebro ao longo de espaços vasculares peri dos ramos de peal cortical da artéria cerebral média. Imagens de transporte csf após lesão cerebral traumática revelam rastreador inicialmente na cisterna olfactofrontal, mas o fluxo glicênico ao longo dos espaços perivasculares cortical é completamente abolido na lateral da lesão. A análise quantitativa nas imagens in vivo demonstra que a área de influxo ipsilateral é reduzida quase um terço em comparação com o hemisfério contralateral.Para evitar artefatos de movimento e as mudanças no plano focal lembre-se de fixar corretamente a placa da cabeça e o porta-cabeça e verificar o nível de anestesia do animal. Após o experimento, os resultados de imagem in vivo podem ser validados quantificando ainda mais a penetração do rastreador usando a real Esta técnica permite o estudo do sistema glicêmático de forma fisiológica e minimamente invasiva e pode ajudar a abordar questões futuras sobre hidrodinâmica CSF em saúde e doenças.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Neurociência

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