Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта и Национальным институтом по проблемам старения (Национальные институты здравоохранения США; R01NS100366 и RF1AG0575775 до MN), Фонд Leducq Трансатлантические сети передового опыта программы, и ЕС Горизонт 2020 научно-исследовательской и инновационной программы (грант No 666881; SVDs-target). Мы также хотели бы поблагодарить Дэна Сюэ за экспертную помощь с графическими иллюстрациями.

Все эксперименты были одобрены Университетским комитетом по ресурсам животных (UCAR, Протокол No 2011-023) в Университете Рочестера и проведены в соответствии с руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка цистерны магна канюла, головная пластин?...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Мы описали подробный протокол для выполнения транскраниальных csF изображений у живых мышей с использованием коммерчески доступных флуоресцентных макроскопов и трассаторов. Этот метод прост и минимально инвазивный, но количественный. In vivo изображений хорошо коррелирует с чувствитель...

Цереброспинальная жидкость (CSF) купает мозг и спинной мозг и участвует в поддержании гомеостаза, поставки питательных веществ и регулирования внутричерепного давления1. CSF в субарахноидальном пространстве входит в мозг через сеть периваскулярных пространств (PVS) окружающих корковых pial артерий, а затем течет вниз по проникающим артериолям2. Оказавшись в паренхиме, CSF обменивается с интерстициальной жидкостью (ISF), несущей вредные метаболиты, такие как амилоидные (АЗ) и тау-протеины агрегаты из мозга через низкое сопротивление белого вещества трактов и перипетие пространства2,3 . Этот путь зависит от астроглиальных aquaporin-4 (АЗП4) каналов и, следовательно, был назван глиально-лимфатической (глимфатической) системы4. Отходы продуктов нейропила в конечном счете, очищается от CSF-ISF через лимфатические сосуды вблизи черепных нервов и в очернениях к шейки лимфатических узлов5. Отказ этой системы был замешан в нескольких неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера6,7, черепно-мозговая травма3, и ишемический и геморрагический инсульт8.
CSF транспорт может быть визуализирован путем вливание трассаторов в цистерны Magna (CM)9,10 и глимфатические исследования в прошлом в основном использовали два фотона микроскопии4,11,12, 13, магнитно-резонансная томография (МРТ)14,15,16,17,и ex vivo изображений3,6,11, 18 для оценки трассикккин кинетики. Двухфотонная микроскопия является подходящим методом для детальной визуализации трассаторов CSF в PVS и паренхимы из-за его высокого пространственного разрешения, однако, он имеет узкое поле зрения и требует инвазивного черепного окна или истончение черепа. Ex vivo визуализации, в сочетании с иммуногистохимии, позволяет многоуровневый анализ, начиная от одиночных клеток до всего мозга19. Тем не менее, процесс перфузии-фиксации, которая необходима для наблюдения посмертной ткани производит глубокие изменения в направлении потока CSF и разрушает PVS, значительно изменяя распределение и расположение трассировок12. Наконец, в то время как МРТ может отслеживать поток CSF по всему мурин и человеческого мозга, ему не хватает пространственного и временного разрешения периваскулярного потока.
Новая методика, транскраниальная макроскопическая визуализация, решает некоторые из этих ограничений, позволяя широкое поле изображения периваскулярного переноса CSF во всей коре дорсальной коры живых мышей. Этот тип изображения делается с эпифлуоресцентным макроскопом с использованием многополосного фильтра куба, tunable светодиодный источник света, и высокоэффективная камера CMOS10. Эти установки способны решать PVSs до 1-2 мм ниже поверхности черепа и может обнаружить фторфоры до 5-6 мм ниже корковой поверхности, оставляя череп полностью нетронутыми10. Многополосные фильтры и светодиоды, которые могут быстро настроить волнообразную длину возбуждения, позволяют использовать несколько фторофоров, позволяющих маркировать CSF трассирами различных молекулярных весов и химических свойств в одном эксперименте.
Эта процедура требует простой, минимально инвазивной хирургии, чтобы разоблачить череп и поместить леглегчайшую головную пластину, чтобы стабилизировать голову во время сеанса визуализации. Трассы могут быть доставлены в CM без бурения в череп е или проникать в корковую ткань пипетками или канюлями9,20. Оба канюли CM и головные пластины остаются стабильными в течение нескольких дней до нескольких недель и облегчить более сложные экспериментальные проекты по сравнению с классической визуализации конечных точек. Этот протокол описывает, как транскраниальная макроскопическая визуализация используется для изучения функции глимфатической системы после острой или хронической инъекции флуоресцентного трассировщика CSF в CM анестезиозных/спящих или бодрствуенных мышей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

Спинномозговая жидкость (CSF) поток у грызунов в значительной степени были изучены с помощью ex vivo количественной оценки трассаторов. Такие методы, как двухфотонная микроскопия и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволили ввиво количественно осваить поток CSF, но они ограничены уменьшением объемов изображений и низким пространственным разрешением, соответственно. Недавняя работа показала, что CSF входит в мозг паренхимы через сеть периваскулярных пространств, окружающих pial и проникающих артерий коры грызунов. Этот периваскулярный вход CSF является основным фактором глимфатической системы, пути, замешанного в очистке токсичных метаболических растворов (например, амилоида-Я). Здесь мы иллюстрируем новый макроскопический метод визуализации, который позволяет в режиме реального времени, мезоскопические изображения флуоресцентных трассаторов CSF через нетронутый череп живых мышей. Этот минимально инвазивный метод облегчает множество экспериментальных конструкций и позволяет однократное или повторное тестирование динамики CSF. Макроскопы имеют высокое пространственное и временное разрешение, а их большое гантри и рабочее расстояние позволяют выполнять изображения при выполнении задач на поведенческих устройствах. Этот подход к визуализации был проверен с помощью двухфотонных изображений и измерений флуоресценции, полученных из этой техники, которые сильно коррелируют с флуоресценцией ex vivo и количественной оценкой радиомаркированных трассировок. В этом протоколе мы описываем, как транскраниальные макроскопические изображения могут быть использованы для оценки глимфатического переноса у живых мышей, предлагая доступную альтернативу более дорогостоящим методам визуализации.

Приток CSF изображен на эпифлуоресцентном макроскопе(рисунок 1A),который позволяет мезоскопическую визуализацию переноса трассировщика CSF в морской коре. Пластина головы всего черепа позволяет визуализировать ростральные носовые кости, как лобные, так и теменовые кости...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Транскраниальная оптическая визуализация позволяет широкополевую визуализацию спинномозговой жидкости переноса в коре живых мышей через нетронутый череп.

В Vivo Изображение цереброспинальной жидкости транспорт через Череп мыши Intact с помощью флуоресценции Макроскопия

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Этот новый метод для реального времени мезоскопической визуализации флуоресцентных следов CSF через нетронутый череп живых мышей может быть использован для оценки глимфатического транспорта. Основным преимуществом является то, что этот метод позволяет динамические измерения in-vivo intracisternal трассировщиков на долю от стоимости других условий изображения. Процедуры, необходимые для поставить головную пластину на канюлю cisterna magna, просты и минимально инвазивны, но требуют правильной практики.Визуальная демонстрация критических шагов этого метода необходима для максимизации качества изображения и обеспечения воспроизводимых сравнений между различными мышами и экспериментальными группами. После подтверждения отсутствия реакции на щипать ногой мокрую шею и голову стерильной водой и побрить увлажненный мех. Протрите обитаемую кожу спиртовой мазком, чтобы удалить остаточные волосы и поместить мышь в стереотаксическую рамку поверх контролируемой температурой площадки.Нанесите мазь на глаза животных и очистите обитаемую кожу хлоргексидином. Через 2 минуты снимите хлоргексидин с спиртовой салфеткой и нанесите раствор иодона. Когда иодон высохнет, введать подкожной анальгезии в верхней части черепа и шеи.Начиная с части шеи, которая покрывает затылочной коры, сделать средней линии сократить в чрезмерной кожи продолжается ростральный к интраорбитальной линии. Расширьте разрез боковой к границе, где височная мышца вставляет в череп и удалить всю кожу фузиформного разреза, чтобы разоблачить как лобные, так и теменные кости. Орошать череп стерильным солевым раствором и использовать ватные тампоны для очистки поверхности до тех пор, пока он не освободится от мусора и волос.После вставки цистерны magna cannula нанесите смесь зубного цемента и цианоакрилатного клея на вентриалистическую сторону головной пластины вокруг границы. Поместите головную пластину на череп так, чтобы передняя граница пластины выравнивается с задней кончиком носовой кости, а задняя граница выравнивается с передним аспектом межпариетальной кости, убедившись, что sagittal шов по центру и прямо по отношению к окну. Важно убедиться, что головная пластина защищена и что она не препятствует поле зрения цистерны великой каннуляции.Используйте пару капель клея ускоритель, чтобы исправить положение головной пластины и заполнить все оставшиеся пробелы с цементной смесью. Клей цистерна магна канюли на головную пластину и использовать головную пластину, чтобы поместить мышь в держатель головы в фиксированном положении. Аккуратно поместите мышь и инфузионный насос, прикрепленный к канюле, на тележку для транспортировки к макроскопу и поместите держатель головы на сцену макроскопа.Убедитесь, что линия от шприц-насоса до канюли cisterna magna не подтянута и что у нее нет изломов. Наблюдайте частоту дыхания и розовую окраску слизистых оболочек, чтобы подтвердить хорошую оксигенацию. Включите макроскоп камеры и светоизлучающих диодов и начать жить режиме.Отрегулируйте увеличение поля изображения так, чтобы насофронтальный шов в верхней части поля и шов лямбдоида внизу можно было четко визуализировать. После того, как на месте ленты держатель головы на стадии макроскопа и сосредоточить макроскоп на открытый череп, пока фокусная плоскость находится на боковых сторонах теменной кости задней корональных швов. Для CSF трассировщик инфузии установить инфузионный насос до соответствующей скорости и объема и установить соответствующую длину волны возбуждения и время экспозиции для трассировщика для каждого канала.Затем убедитесь, что функция срабатывания на макроскопе является правильной, прежде чем одновременно инициировать вливание трассировщика и визуализацию. Во время визуализации лобных, сагитталовых, корональных и лямбдоидных швов можно легко определить. После того, как CSF трассировщик был проникнут в цистерна magna трассировщик флуоресценции впервые наблюдается в больших бассейнах субарахноидов CSF на olfactofrontal цистерны и четырехглавой цистерны вблизи шишковидной ниши и в конечном итоге окружающих средних мозговых артерий.CsF трассировщики затем войти в их мозг вдоль пери сосудистых пространств корковых грушевидных ветвей средней мозговой артерии. CSF транспортной визуализации после черепно-мозговой травмы показывает трассировщик первоначально на olfactofrontal цистерны, но глимфатический приток вдоль корковых периваскулярных пространств полностью отменена на стороне травмы. Количественный анализ на снимках in-vivo показывает, что площадь притока ипсилатеральных уменьшилась почти на треть по сравнению с контралатеральным полушарием.Чтобы избежать движения артефактов и изменений в фокусной плоскости не забудьте правильно обеспечить головную пластину и держатель головной пластины и проверить уровень анестезии животного. После эксперимента результаты визуализации in-vivo могут быть дополнительно проверены путем количественной оценки проникновения трассировщика с использованием фактического Этот метод позволяет изучать глимфатической системы в физиологической и минимально инвазивной манере и может помочь решить будущие вопросы о гидродинамике CSF в области здравоохранения и болезней.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Изоляция цереброспинальной жидкости из грызунов эмбрионов для использования с расчлененный коры головного мозга Экспланты

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Экс Vivo Препараты неповрежденной вомероназального органа и аксессуаров обонятельная луковица

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Пробоподготовки для анализа Endopeptidomic в цереброспинальной жидкости человека

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

В естественных условиях Мониторинг суточного часов экспрессии генов в мыши Супрахиазмальное ядро с помощью флуоресценции Репортеры

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Усовершенствованный метод для коллекции спинномозговой жидкости от наркотизированных мышей

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...