Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos; R01NS100366 y RF1AG057575 a MN), el Programa de Redes Transatlánticas de Excelencia De la Fundación Leducq y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la UE (concesión no 666881; SVDs-target). También nos gustaría dar las gracias a Dan Xue por la asistencia de expertos con ilustraciones gráficas.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales (UCAR, Protocolo No. 2011-023) en la Universidad de Rochester y realizados de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de la cánula cisterna magna, la placa de la cabeza y el soporte para la cabeza
<ol><li>Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y placas de cabeza antes de la cirugía. NOTA: Los trazadores fluorescentes se entregan dire...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Hemos descrito un protocolo detallado para realizar imágenes transcraneales de LSC en ratones vivos utilizando macroscopios y trazadores fluorescentes disponibles comercialmente. Esta técnica es simple y mínimamente invasiva, pero cuantitativa. La imagen in vivo se correlaciona bien con métodos sensibles como el recuento de centelleo líquido de tracdores radiomarcados, incluidos 3H-dextran y 14C-inulin después de la administración de CM, y con cuantificación de sección coronal ex vivo<sup c...

El líquido cefalorraquídeo (LCR) baña el cerebro y la médula espinal y participa en el mantenimiento de la homeostasis, el suministro de nutrientes y la regulación de la presión intracraneal1. El LESO en el espacio subaracnoideo entra en el cerebro a través de una red de espacios perivasculares (PVS) que rodean las arterias cortales corticales y luego fluye a lo largo de las arterias penetrantes2. Una vez en el parénquima, el Líquido Cefalrea (CSF) intercambia con fluido intersticial (ISF), llevando metabolitos nocivos como el amiloide y los agregados de proteína tau del cerebro a través de vías de materia blanca de baja resistencia y espacios peligrosos2,3 . Esta vía depende de los canales astrogliales de la aquaporina-4 (AQP4) y, por lo tanto, se ha llamado el sistema glial-linfático (ginfotico)4. Los productos de desecho del neuropil se eliminan en última instancia del LIF-ISF a través de vasos linfáticos cerca de los nervios craneales y en las meninges hacia los ganglios linfáticos cervicales5. El fallo de este sistema ha estado implicado en varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer6,7, lesión cerebral traumática3,y accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico8.
El transporte del LSCa se puede visualizar infundiendo marcadores en la cisterna magna (CM)9,10 y estudios glinfoticos en el pasado han utilizado principalmente la microscopía de dos fotones4,11,12, 13, imágenes por resonancia magnética (RM)14,15,16,17y imágenes ex vivo3,6,11, 18 para evaluar la cinética del trazador. La microscopía de dos fotones es un método adecuado para la toma de imágenes detalladas de los trazadores de LSN en pvSpres y el parénquima debido a su alta resolución espacial, sin embargo, tiene un campo de visión estrecho y requiere una ventana craneal invasiva o adelgazamiento del cráneo. La imagen ex vivo, en combinación con la inmunohistoquímica, permite análisis multinivel que van desde células individuales hasta todo el cerebro19. Sin embargo, el proceso de fijación de perfusión que se requiere para observar el tejido post mortem produce cambios profundos en la dirección del flujo de LSN y colapsa el PVS, alterando significativamente la distribución y la ubicación de los trazadores12. Finalmente, mientras que la RMN puede rastrear el flujo de LSF a través de todo el cerebro murino y humano, carece de resolución espacial y temporal del flujo perivascular.
Una nueva técnica, la imagen macroscópica transcraneal, resuelve algunas de estas limitaciones al permitir imágenes de campo amplio del transporte de LSC perivascular en toda la corteza dorsal de ratones vivos. Este tipo de imágenes se realiza con un macroscopio epifluorescente utilizando un cubo de filtro multibanda, una fuente de luz LED ajustable y una cámara CMOS de alta eficiencia10. Estas configuraciones son capaces de resolver PVS hasta 1-2 mm por debajo de la superficie del cráneo y pueden detectar fluoróforos de hasta 5-6 mm por debajo de la superficie cortical mientras dejan el cráneo completamente intacto10. Los filtros multibanda y los LED que pueden ajustar rápidamente la longitud de onda de excitación permiten el uso de múltiples fluoróforos, lo que permite etiquetar el LSC con marcadores de diferentes pesos moleculares y propiedades químicas en el mismo experimento.
Este procedimiento requiere una cirugía simple y mínimamente invasiva para exponer el cráneo y colocar una placa de cabeza ligera para estabilizar la cabeza durante la sesión de diagnóstico por imágenes. Los trazadores se pueden entregar en el CM sin perforar el cráneoo penetrar el tejido cortical con pipetas o cánulas 9,20. Tanto las cánulas CM como las placas de cabeza permanecen estables durante varios días a semanas y facilitan diseños experimentales más complejos en comparación con la visualización clásica de punto final. Este protocolo describe cómo se utilizan imágenes macroscópicas transcraneales para estudiar la función del sistema ginfogático después de la inyección aguda o crónica de un marcador fluorescente de LSN fluorescente en el CM de ratones anestesiados/dormidos o despiertos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

El flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en roedores se ha estudiado en gran medida utilizando la cuantificación ex vivo de los trazadores. Técnicas como la microscopía de dos fotones y la resonancia magnética (RM) han permitido la cuantificación in vivo del flujo de LSN, pero están limitadas por la reducción de los volúmenes de imágenes y la baja resolución espacial, respectivamente. Trabajos recientes han encontrado que el LCH entra en el parénquima cerebral a través de una red de espacios perivasculares que rodean las arterias pial y penetrantes de la corteza de roedores. Esta entrada perivascular del LIF es un factor principal del sistema ginfotico, una vía implicada en el aclaramiento de solutos metabólicos tóxicos (p. ej., amiloide). Aquí, ilustramos una nueva técnica de imagen macroscópica que permite imágenes mesoscópicas en tiempo real de trazadores fluorescentes de CSF a través del cráneo intacto de ratones vivos. Este método mínimamente invasivo facilita una multitud de diseños experimentales y permite realizar pruebas únicas o repetidas de la dinámica del CSF. Los macroscopios tienen una alta resolución espacial y temporal y su gran pórtico y distancia de trabajo permiten la creación de imágenes mientras realizan tareas en dispositivos de comportamiento. Este enfoque de imagen ha sido validado utilizando mediciones de imágenes y fluorescencia de dos fotones obtenidas a partir de esta técnica se correlacionan fuertemente con la fluorescencia ex vivo y la cuantificación de trazadores radiomarcados. En este protocolo, describimos cómo se pueden utilizar imágenes macroscópicas transcraneales para evaluar el transporte ginfogático en ratones vivos, ofreciendo una alternativa accesible a las modalidades de imagen más costosas.

La afluencia de LSF se muestra en un macroscopio epifluorescente (Figura1A),que permite la toma de imágenes mesoscópicas del transporte del trazador de LSF en la corteza murina. La placa de cabeza de cráneo entero permite la visualización de los huesos nasales rostrales, tanto los huesos frontales como parietales en el centro, y la porción rostral del hueso interparietal caudalmente (Figura1B). Durante las imágenes, las suturas nasofrontal, sagital, corona...

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In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Las imágenes ópticas transcraneales permiten imágenes de campo amplio del transporte de líquido cefalorraquídeo en la corteza de ratones vivos a través de un cráneo intacto.

En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Esta nueva técnica para la toma de imágenes mesoscópicas en tiempo real de trazas florescentes de lesc a través del cráneo intacto de ratones vivos se puede utilizar para evaluar el transporte glimático. La principal ventaja es que esta técnica permite mediciones dinámicas de trazadores intracisternales in-vivo a una fracción del costo de otras modalidades de imagen. Los procedimientos necesarios para colocar la placa de la cabeza en la cánula magna cisterna son simples y mínimamente invasivos, pero requieren que la práctica se realice correctamente.La demostración visual de los pasos críticos de este método es necesaria para maximizar la calidad de la imagen y permitir comparaciones reproducibles entre diferentes ratones y grupos experimentales. Después de confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pies mojar el cuello y la cabeza con agua estéril y afeitar el pelaje humedecido. Limpie la piel expuesta con un hisopo de alcohol para eliminar cualquier vello residual y coloque el ratón en un marco estereotáctico encima de una almohadilla de temperatura controlada.Aplicar pomada en los ojos de los animales y limpiar la piel expuesta con un hisopo de clorhexidina. Después de 2 minutos, retire la clorhexidina con una toallita con alcohol y aplique una solución de iodona. Cuando la iodona se ha secado inyectar analgesia subcutánea en la parte superior del cráneo y el cuello.Comenzando en la parte del cuello que cubre la corteza occipital, haz un corte de línea media en la piel superada continuando rostralmente hacia la línea intraorbital. Extiende la incisión lateralmente hasta el borde donde el músculo temporal se inserta en el cráneo y extrae toda la piel de la incisión fusiforme para exponer los huesos frontal y parietal. Irrigar el cráneo con solución salina estéril, y utilizar hisopos de algodón para limpiar la superficie hasta que esté libre de escombros y pelo.Después de insertar la cánula magna cisterna aplicar una mezcla de cemento dental y pegamento de cianoacrilato en el lado ventral de la placa de la cabeza alrededor del borde. Coloque la placa de la cabeza sobre el cráneo de modo que el borde anterior de la placa se alinee con la punta posterior del hueso nasal y el borde posterior se alinee con el aspecto anterior del hueso interparietal asegurándose de que la sutura sagital esté centrada y recta en relación con la ventana. Es importante asegurarse de que la placa de la cabeza está asegurada y que no obstruye el campo de visión de la cánula magna de las cisternas.Utilice un par de gotas de acelerador de pegamento para fijar la posición de la placa de la cabeza y llenar los huecos restantes con la mezcla de cemento. Pegue la cánula diferencial magna a la placa de la cabeza y utilice la placa de la cabeza para colocar el ratón en el soporte de la cabeza en una posición fija. Coloque cuidadosamente el ratón y la bomba de infusión unidas a la cánula en un carro para su transporte al macrósco y coloque el soporte de cabeza en el escenario del macroscopio.Asegúrese de que la línea de la bomba de la jeringa a la cánula magna cisterna no esté tensa y que no tenga torceduras. Observe la frecuencia respiratoria y la coloración rosa de las membranas mucosas para confirmar una buena oxigenación. Encienda la cámara del macroscopio y el diodo emisor de luz e inicie el modo en vivo.Ajuste el aumento del campo de imagen para que se pueda visualizar claramente la sutura nasofrontal en la parte superior del campo y la sutura lambdoid en la parte inferior. Una vez en su lugar, el soporte de la cabeza a la etapa del macroscopio y enfoca el macroscopio en el cráneo expuesto hasta que el plano focal se encuentre en los lados laterales de los huesos parietales posteriores a las suturas coronales. Para la perfusión del trazador CSF, ajuste la bomba de perfusión a la velocidad y el volumen adecuados y establezca la longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición adecuados para el trazador para cada canal.A continuación, compruebe que la función de activación del macroscopio es correcta antes de iniciar simultáneamente la perfusión del trazador y la toma de imágenes. Durante la toma de imágenes se pueden identificar fácilmente las suturas naso frontal, sagital, coronal y lambdoide. Una vez que el trazador de líquido cefaéreo se ha infundido en la cisterna magna, la fluorescencia trazadora se observa por primera vez en grandes piscinas de lecnteide CSF en la cisterna olftica y la cisterna cuadreminal cerca del receso pineal y, finalmente, rodeando las arterias cerebrales medias.Luego, los trazadores de líquido cefasequiífos entran en su cerebro a lo largo de los espacios perículares de las ramas pelales corticales de la arteria cerebral media. Las imágenes de transporte de líquido cefalofes después de una lesión cerebral traumática revelan un trazador inicialmente en la cisterna oxifrontal, pero la afluencia glimática a lo largo de los espacios perivasculares corticales se suprime por completo en el lado de la lesión. El análisis cuantitativo en las imágenes in-vivo demuestra que el área de afluencia ipsilateral se reduce casi un tercio en comparación con el hemisferio contralateral.Para evitar artefactos de movimiento y los cambios en el plano focal, recuerde fijar correctamente la placa de la cabeza y el soporte de la placa de la cabeza y comprobar el nivel de anestesia del animal. Después del experimento, los resultados de las imágenes in-vivo se pueden validar aún más cuantificando la penetración del trazador utilizando la técnica real Esta técnica permite el estudio del sistema glimático de una manera fisiológica y mínimamente invasiva y puede ayudar a abordar futuras preguntas sobre la hidrodinámica del SEF en la salud y la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

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Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

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De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

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Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

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During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

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En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

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Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...