Name: in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

Detta arbete finansierades av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke och det nationella institutet för åldrande (US National Institutes of Health; R01NS100366 och RF1AG057575 till MN), Fondation Leducq transatlantiska nätverk för excellensprogram och EU: s Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram (Grant nr 666881; SVDs @ Target). Vi vill också tacka Dan Xue för experthjälp med grafiska illustrationer.

Alla experiment godkändes av universitets kommittén för djur resurser (UCAR, protokoll nr 2011-023) vid University of Rochester och utfördes enligt NIH guide för vård och användning av försöksdjur.
1. beredning av Cisterna magna kanyl, huvud plåt och huvud hållare
<ol><li>Sterilisera alla kirurgiska instrument och huvudplattor före operationen. Anmärkning: fluorescerande spårämnen levereras direkt till CSF via en Cisterna magna kanylering. För detaljerade instruktioner om ...

<ol>
	<li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations.">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li><li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System:+A+Beginner's+Guide.">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li><li>Da Mesquita, ., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI:+a+new+target+for+fibrinolysis.">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain.">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li><li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain.">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension.">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glymphatic+System.">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI.">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li><li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI.">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport.">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li><li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia.">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li><li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders.">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li><li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain.">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain.">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100 (2016).</li><li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System.">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hit+&amp;+Run'+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+(TBI)+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation.">Hit &amp; Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li><li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system.">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li><li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice.">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).</li><li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury.">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li><li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain.">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li><li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice.">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li></ol>

Vi har beskrivit ett detaljerat protokoll för att utföra transkraniell CSF avbildning hos levande möss med hjälp av kommersiellt tillgängliga fluorescerande makroskop och tracers. Denna teknik är enkel och minimalt invasiva, men ändå kvantitativ. In vivo-avbildning korrelerar väl med känsliga metoder såsom vätske scintillationskontroller av radiostyrda spårämnen inklusive 3H-dextran och 14C-inulin efter cm leverans, samt med kvantifiering för ex vivo-sektion10<...

Cerebrospinalvätska (CSF) badar hjärnan och ryggmärgen och är involverad i att upprätthålla homeostas, leverera näringsämnen, och reglera intrakraniellt tryck1. CSF i subaraknoidalrummet går in i hjärnan genom ett nätverk av perivaskulära utrymmen (PVS) omgivande kortikala Arvika artärer och sedan flyter ner längs penetrerande arterioler2. En gång i parenkymet, CSF utbyten med interstitiell vätska (ISF), transporterar skadliga metaboliter såsom amyloid-β (Aβ) och tau protein aggregat ut ur hjärnan genom låg motståndskraft vit materia skrifter och perivenösa utrymmen2,3 . Denna väg är beroende av astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler och har därför kallats den Glial-lymfatiska (glymphatic) system4. Avfallsprodukter av neuropil slutligen rensas från CSF-ISF genom lymfkärl nära kranialnerver och i hjärnhinnorna ut mot livmoderhalsen lymfkörtlar5. Misslyckandet med detta system har varit inblandad i flera neurologiska sjukdomar som Alzheimers sjukdom6,7, traumatisk hjärnskada3, och ischemisk och hemorragisk stroke8.
CSF transport kan visualiseras genom infusion spårämnen i Cisterna magna (cm)9,10 och glymphatic studier i det förflutna har främst utnyttjat två-Photon mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonanstomografi (MRI)14,15,16,17och ex vivo Imaging3,6,11, 18 för att utvärdera spårkinetik. Två-Photon mikroskopi är en lämplig metod för detaljerad avbildning av CSF spårämnen i PVSs och parenkymet på grund av dess höga rumsliga upplösning, men det har ett smalt synfält och kräver en invasiv kranial fönster eller gallring av skallen. Ex vivo Imaging, i kombination med immunohistokemi, möjliggör multinivåanalyser som sträcker sig från enstaka celler upp till hela hjärnan19. Emellertid, processen för perfusion-fixering som krävs för att iaktta post-mortem vävnad producerar djupgående förändringar i CSF flödesriktning och kollapsar PVS, avsevärt ändra fördelningen och placeringen av spårämnen12. Slutligen, medan MRI kan spåra CSF flöde genom hela murin och mänskliga hjärnan, det saknar rumsliga och temporal upplösning av perivaskulära flödet.
En ny teknik, transkraniell makroskopisk avbildning, löser några av dessa begränsningar genom att möjliggöra bred fält avbildning av perivaskulär CSF transport i hela dorsala cortex av levande möss. Denna typ av avbildning görs med ett epifluorescerande makroskop med hjälp av en flerbandsfilterkub, en avstämbar LED-ljuskälla och högeffektiv CMOS-kamera10. Dessa uppställningar har möjlighet att lösa PVSs upp till 1-2 mm under skallytan och kan detektera fluoroforer upp till 5-6 mm under den kortikala ytan och lämnar skallen helt intakt10. Flerbandsfilter och lysdioder som snabbt kan finjustera magnetiseringsvåglängden möjliggör användning av flera fluoroforer som tillåter CSF att märkas med spår av olika molekylvikter och kemiska egenskaper i samma experiment.
Detta förfarande kräver en enkel, minimalt invasiv kirurgi för att exponera skallen och placera en lätt huvud plattan att stabilisera huvudet under fotografering sessionen. Tracers kan levereras in i cm utan att borra i skallen eller tränga in i kortikal vävnad med pipetter eller kanyl9,20. Båda CM kanylerna och huvud plattorna förblir stabila i flera dagar till veckor och underlättar mer komplexa experimentella konstruktioner jämfört med den klassiska slutpunkts visualiseringen. Detta protokoll beskriver hur transkrakala makroskopiska avbildning används för att studera glymphatic system funktion efter akut eller kronisk injektion av fluorescerande CSF Tracer i CM av anestetized/sova eller vakna möss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Bupivacaine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-M Systems Dental Cement Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9991371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine</td>
			<td>Prevantics</td>
			<td>B10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS Camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>ORCA Flash 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>University of Rochester</td>
			<td>No catalog #</td>
			<td>Custom made at the machine shop at the University of Rochester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insta-set Accelerator</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>BSI-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane - Fluriso</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>502017</td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc</td>
			<td>No catalog #, see link in comments</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 - Polyethylene .011&#34; x .024&#34; per ft., 100 ft. continuous</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>PE10 100 FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Macro Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Head Holder Plate (for mice)</td>
			<td>Narishige International USA Inc</td>
			<td>MAG-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use Needles, BD Medical</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable LED</td>
			<td>PRIOR Lumen 1600-LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>University of Rochester Vivarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

Cerebrospinalvätska (CSF) flöde i gnagare har till stor del studerats med hjälp av ex vivo kvantifiering av spårämnen. Tekniker som två-Photon mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRI) har möjliggjort in vivo kvantifiering av CSF flöde men de är begränsade av minskad avbildning volymer och låg rumslig upplösning, respektive. Nyligen arbete har funnit att CSF kommer in i hjärnan parenkymet genom ett nätverk av perivaskulära utrymmen som omger Arvika och penetrerande artärer i gnagare cortex. Detta perivaskulära inträde av CSF är en primär förare av glymphatic systemet, en väg inblandad i clearance av giftiga metaboliska lösta ämnen (t. ex., amyloid-β). Här illustrerar vi en ny makroskopiska Imaging teknik som möjliggör realtid, Mesoskopisk avbildning av fluorescerande CSF spår genom intakt skalle av levande möss. Denna minimalinvasiva metod underlättar en mängd experimentella konstruktioner och möjliggör enkel eller upprepad testning av CSF dynamik. Macroscopes har hög rumslig och temporal beslutsamhet och deras stor portal och arbetande distans tillåta för tänkbar fördriva tiden utför uppgiften på beteende anordningen. Denna avbildning metod har validerats med hjälp av två-Photon Imaging och fluorescens mätningar som erhållits från denna teknik starkt korrelerar med ex vivo fluorescens och kvantifiering av radio-märkta spårämnen. I detta protokoll beskriver vi hur transkraniell makroskopisk avbildning kan användas för att utvärdera glymphatic transport i levande möss, och erbjuder ett tillgängligt alternativ till mer kostsamma avbildningsmetoder.

CSF tillströmning är avbildad på ett epifluorescerande makroskop (figur 1a), vilket möjliggör Mesoskopisk avbildning av CSF spår transport i murina cortex. Hela-skalle huvud plattan tillåter visualisering av rostralt näsans ben, både frontal-och parietalben i mitten, och rostrala delen av interparietala benet caudally (figur 1b). Vid bildtagning kan nasofrontala, sagittal, koronala och lambdoida suturer lätt identifieras (figur 1c<...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy at JoVE.com

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Transcranial optisk avbildning tillåter wide-fält avbildning av cerebrospinalvätska transport i cortex av levande möss genom en intakt skalle.

In vivo avbildning av cerebrospinalvätska transport genom intakt mus skalle med Fluorescensmakroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Denna nya teknik för realtid mesoskopisk avbildning av florescent CSF spår genom intakt skalle av levande möss kan användas för att utvärdera glymphatic transport. Den största fördelen är att denna teknik möjliggör dynamiska mätningar av in-vivo intracisternal tracers till en bråkdel av kostnaden för andra bildframställning modaliteter. De förfaranden som krävs för att placera huvudet plattan på cisterna storsint kanyl är enkla och minimalt invasiva men kräver praxis för att utföras korrekt.Visuell demonstration av de kritiska stegen i denna metod krävs för att maximera bildkvaliteten och för att möjliggöra reproducerbara jämförelser mellan olika möss och experimentella grupper. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa våt halsen och huvudet med sterilt vatten och raka den fuktade pälsen. Torka av den exponerade huden med en spritsudd för att ta bort eventuellt kvarvarande hår och placera musen i en stereotaktisk ram ovanpå en temperaturkontrollerad rondell.Applicera salva på djurens ögon och rengör den exponerade huden med en Chlorhexidinsvabb. Efter 2 minuter ta bort Chlorhexidin med en alkohol torka och tillämpa en iodon lösning. När iodon har torkat injicera subkutan analgesi i toppen av skallen och halsen.Börjar vid den del av halsen som täcker occipital skorpan, gör en mittlinjen skära i överlycklig hud fortsätter rostrally mot intraorbital linjen. Utvidga snittet i lateralt till gränsen där den tidsmässiga muskeln skär in i skallen och ta bort alla av huden på fusiform snittet att exponera både frontal och parietal ben. Bevattna skallen med steril saltlösning, och använd bomullspinner för att rengöra ytan tills den är fri från skräp och hår.Efter att ha satt in cisterna storsint kanyl applicera en blandning av tandcement och cyanoakrylat lim på den ventrala sidan av huvudet plattan runt gränsen. Placera huvudet plattan på skallen så att den främre gränsen av plattan justeras med den bakre spetsen av näsbenet och den bakre gränsen anpassar sig till den främre aspekten av interparietal ben se till att sagittal suturen är centrerad och rak i förhållande till fönstret. Det är viktigt att se till att huvudplattan är säkrad och att den inte hindrar synfältet för cisternas storsint kannulation.Använd ett par droppar limaccelerator för att fixa placeringen av huvudplattan och fyll eventuella återstående luckor med cementblandningen. Limma cisternas storsinta kanyl på huvudplattan och använd huvudplattan för att placera musen i huvudhållaren i fast läge. Placera försiktigt musen och infusionspumpen som är fäst vid kanylen på en kärra för transport till makroskopet och placera huvudhållaren på makroskopets scen.Se till att linjen från sprutpumpen till cisterna storsint kanylen inte är spänd och att den inte har några kinks. Observera andningshastigheten och rosa färgning av slemmembranen för att bekräfta en bra syresättning. Slå på makroscopekameran och ljusavgivandedioden och starta liveläget.Justera bildfältets förstoring så att nasofrontal suturen överst på fältet och lambdoidsuturen längst ner tydligt kan visualiseras. Väl på plats tejpa huvudhållaren till makroscope scenen och fokusera makroskopet på den exponerade skallen tills fokalplanet är beläget på de laterala sidorna av parietalbenen posteriort till koronasuturerna. För CSF-tracerinfusion ställ in infusionspumpen på lämplig hastighet och volym och ställ in lämplig excitationsvåglängd och exponeringstid för spårämnet för varje kanal.Kontrollera sedan att den utlösande funktionen på makroskopet är korrekt innan du samtidigt inleder tracerinfusionen och bildåtergivningen. Under imaging den naso frontal, sagittal, koronal och lambdoid suturer kan lätt identifieras. När CSF spårämnet har infunderas i cisterna magnat spårämne fluorescens först observeras i stora pooler av subarachnoid CSF vid olfactofrontal cisternen och quadrigeminal cistern nära pineal recess och så småningom kring de mellersta cerebrala artärerna.CSF spårämnen sedan in i deras hjärna längs peri vaskulära utrymmen av kortikala peal grenar av mitten cerebral artär. CSF transport imaging efter traumatiska hjärnan skada avslöjar spårämne initialt vid olfactofrontal cistern men glymphatic tillströmningen längs den kortikala perivaskulära utrymmen är helt avskaffas på sidan av skadan. Kvantitativ analys vid in-vivo bilderna visar att det ipsilaterala tillströmningsområdet är minskat nästan en tredjedel jämfört med det kontralaterala halvklotet.För att undvika rörelse artefakter och förändringarna i fokalplanet ihåg att korrekt säkra huvudet plattan och huvudet plattan innehavaren och kontrollera anestesi nivå av djuret. Efter experimentet in-vivo imaging resultat kan ytterligare valideras genom att kvantifiera spårämnet penetration med hjälp av den faktiska Denna teknik möjliggör studier av det glymphatic systemet på ett fysiologiskt och minimalt invasivt sätt och kan hjälpa till att ta itu med framtida frågor om CSF hydrodynamik i hälsa och sjukdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Kronisk Imaging av Mouse syncentrum Använda en uttunnade skallen Förberedelser

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av cerebrospinalvätska från Gnagare Embryon för användning med Dissekerade cerebrala kortikala Explantat

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Dendritutskotten i mus Cortex Använda en förtunnad-skalle Förberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo Imaging av Födsel Cerebellar Granule Cell Migration Använda Confocal makroskopi

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Provberedning för analys av Endopeptidomic i mänskliga cerebrospinalvätska

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Övervakning av dygnsrytm klocka genuttryck i mus suprachiasmatiska kärnan med hjälp av fluorescens reportrar

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

En förbättrad metod för insamling av ryggmärgsvätska från sövda möss

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Bildbehandling och analys av neurofilament transport i struket Mus Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...