Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af national Heart, Lung og Blood Institute (R01 HL073965, IL) og (T32 HL007829-24, ISF). Forfatterne vil også gerne anerkende den videnskabelige maskine butik ved University of Illinois i Chicago for at generere vores nyeste MPP flow kamre.

Brugen af dyr i vores studier er godkendt af University of Illinois i Chicago Animal Care Committee (#16-183).
1. samling af det modificerede parallelle plade flow kammer
Bemærk: Se tabel 1 og figur 1 for MPP flow kammer brik-id'er. Se figur 1 for en skematisk detaljeret orientering af kammer stykker til montage.
<ol><li>For at overholde det rektangulære dækglas, stykk...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

Det vaskulære system er konstant udsat for aktive hæodynamiske kræfter, som aktiverer mekanisk følsomme ion kanaler3,22 men de fysiologiske roller af disse kanaler i shear stress-induceret mekanisotransduktion er kun begynder at dukke4,6,8. De mekanismer, der er ansvarlige for mekanisk følsomhed af shear stress-aktiverede kanaler forbliver ukendte. Den protokol, som...

Hemodynamic kræfter genereret af blodgennemstrømningen er velkendte at spille store roller i endotelog vaskulære funktion1,2. Det er også velkendt, at flere typer Ionkanaler reagerer akut på ændringer i forskydnings stress3,4,5 , hvilket fører til hypotesen om, at ion-kanaler kan være primære forskydnings sensorer. For nylig viste vi og andre, at mekanisk følsomme ion-kanaler spiller kritiske roller i flere forskydnings følsomme vaskulære funktioner, herunder vasoaktiv respons til forskydnings stress6,7,8 og udviklingsmæssige angiogenese9. Mekanismerne i den shear-stress følsomhed af ion-kanaler, dog, er næsten helt ukendt. Denne mangel på viden vil sandsynligvis skyldes de tekniske vanskeligheder ved at udføre elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede forskydnings stress. I denne artikel, derfor, vi giver en trin for trin detaljeret protokol rutinemæssigt udføres i vores laboratorium for at nå dette mål6,7,10,11.
Det overordnede mål med denne metode er at tillade realtids undersøgelse af ionkanal mekaniaktivering under veldefinerede forskydnings belastninger i det fysiologiske område. Dette opnås ved at ændre en standard parallel plade flow kammer for at tillade en elektrofysiologisk pipette, der skal sænkes ind i kammeret og adgang celler dyrket på bundpladen i realtid eksponering for flow, hvilket giver en unik tilgang til at opnå dette mål6,7,11. I modsætning hertil kan standard parallelle plade strømnings kamre, der er beskrevet i tidligere publikationer, anvendes til analyse af realtidsbilleder af celler, som eksponeres for forskydningskræfter12 eller andre ikke-invasive tilgange13,14 , men ikke til Elektrofysiologi. Tilsvarende, kegle og plade apparat, en anden kraftfuld tilgang til at udsætte celler til at forskyde stress15,16 er heller ikke egnet til elektrofysiologiske optagelser. Således, disse flow-anordninger tillader ikke undersøgelse af shear stress følsomhed af ion-kanaler. Vanskeligheden ved at udføre elektrofysiologiske optagelser under flow er hovedårsagen til den manglende information om de mekanismer, der er ansvarlige for disse afgørende virkninger.
Med hensyn til de alternative tilgange til at nå det samme mål, er der ingen, der er så nøjagtige eller kontrollerede. Nogle tidligere undersøgelser forsøgte at registrere ion kanal aktivitet under flow ved at udsætte cellerne for en strøm af væske, der kommer fra en anden pipette bragt i nærheden af en celle fra over17,18. Dette er meget ikke-fysiologisk, som de mekaniske kræfter genereret under disse betingelser har lidt til fælles med de fysiologiske profiler af shear stress i blodkarrene. Lignende betænkeligheder gælder for forsøg på at simulere fysiologiske forskydnings stress ved perfusion af åbne kamre. Som diskuteret i detaljer i vores tidligere undersøgelse10, en åben væske-luft interface skaber flere forstyrrelser og recirkulation, som er ikke-fysiologiske. For at imødegå alle disse bekymringer, har vi designet en modificeret parallel plade (MPP) flow kammer, også kaldet "minimalt invasiv flow anordning" i vores tidligere undersøgelser6,7,10,11, lavet fra akryl og flittigt brugt i vores laboratorium. Men på trods af det faktum, at den oprindelige beskrivelse af designet er blevet offentliggjort for næsten 20 år siden, og er den eneste flow anordning, der tillader udførelse elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede shear stress, denne metode er ikke blevet vedtaget af andre laboratorier, og der er kun meget få undersøgelser, der forsøger at optage strømme under flow. Vi mener derfor, at give en detaljeret beskrivelse til brug af MPP flow kammer vil være en stor hjælp til forsker, der er interesseret i mekanifølsomme ion-kanaler og vaskulær biologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Fluid shear stress er velkendt for at spille en stor rolle i endotelfunktion. I de fleste vaskulære senge, forhøjet shear stress fra akutte stigninger i blodgennemstrømningen udløser en signalering kaskade resulterer i vasodilatation derved lindre mekanisk stress på vaskulære væggen. Mønsteret af shear stress er også velkendt for at være en kritisk faktor i udviklingen af åreforkalkning med laminar shear stress er atheroprotective og forstyrret shear stress er Pro-atherogenic. Mens vi har en detaljeret forståelse af de forskellige mellemliggende celle signalerings veje, er de receptorer, der først oversætter den mekaniske stimulus til kemiske mediatorer, ikke helt forstået. Mekanisk følsomme Ionkanaler er afgørende for reaktionen til at forskyde og regulere forskydnings induceret celle signalering og dermed kontrollere produktionen af vasoaktive mediatorer. Disse kanaler er blandt de tidligste aktiverede signalerings komponenter til forskydning og har været forbundet med forskydnings induceret vasodilatation ved at fremme nitrogenoxid produktion (f. eks. indadtil rektificere K+ [KIR] og forbigående receptor potentiale [TRP] og endotelet hyperpolariserende faktor (f. eks. Kir-og Calcium aktiverede K+ [KCA]-kanaler) og forskydnings induceret vasokonstriktion gennem en ikke-fastlagt mekanisme, der involverer piezo-kanaler. Forståelse af den biofysiske mekanisme, hvormed disse kanaler aktiveres af forskydningskræfter (dvs. direkte eller gennem en primær mechano-receptor) kunne give potentielle nye mål for at løse Patofysiologi forbundet med endoteldysfunktion og atherogenesis. Det er stadig en stor udfordring at registrere flow-induceret aktivering af ion-kanaler i realtid ved hjælp af Elektrofysiologi. De standardmetoder til at eksponere celler til veldefinerede shear stress, såsom kegle og plade rheometer og lukket parallel plade flow kammer tillader ikke real time undersøgelse af ion kanal aktivering. Formålet med denne protokol er at beskrive et modificeret parallel plade flow kammer, der giver mulighed for realtids elektrofysiologisk optagelse af mekaniske følsomme Ionkanaler under veldefinerede forskydnings belastninger.

Flere fotografier, der viser forskellige visninger af MPP-gennemstrømnings kammeret på mikroskopet (øverste panel) og en skematisk gengivelse af MPP-gennemstrømnings kammeret (nederste panel), er vist i figur 1. Skematisk detaljer dimensionerne af hele enheden og flow kammer. Figur 2 viser et fotografi af tyngdekraften perfusion system til MPP flow kammer i vores laboratorium (øverste panel). Også vist er en skematisk gengi...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologiske optagelser af enkelt celle Ionstrømme under veldefinerede forskydnings belastninger

Formålet med denne protokol er at beskrive et modificeret parallel plade flow kammer til brug ved efterforskning af realtids aktivering af mekanifølsomme Ionkanaler ved hjælp af forskydningsbelastning.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Brug af den modificerede parallel plade flow kammer kan hjælpe forskerne besvare centrale spørgsmål vedrørende den funktionelle reaktion mechanosensitive ion kanaler til forskydning stress. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for real-time undersøgelse til at flyde aktiverede ion kanaler i en let samlet, genanvendelige parallel plade flow kammer. For at begynde proceduren, anvende et tyndt lag af silikone elastomer løsning omkring kanterne af det rektangulære rum i stykke C, og forsigtigt placere rektangulære dækglas, stykke D, direkte på elastomer opløsning til helt at dække den åbne rektangulære rum af stykke C.Omhyggeligt tørre overskydende silikone eomlaster opløsning.Gentag derefter proceduren for at holde det rektangulære dækglas, stykke F, til bunden af stykke E og lad silikoneelastomeropløsningen hærde natten over ved stuetemperatur. Nu samle MPP flow kammer ved sekventielt at placere hvert stykke på toppen af den foregående, begyndende med det nederste kammer, stykke E, derefter stykke C, stykke B, efterfulgt af stykke A på toppen. Dernæst justere skruen huller i hvert stykke i hjørnerne og stramt skrue stykkerne sammen for at forhindre lækager opstår under administration af flow til MPP flow kammer.I en seks-brønd plade, sted fire til fem, 12 millimeter dække glas cirkler i hver brønd. Gem cellerne mellem 10% og 30%sammenløbet, således at enkelte celler kan tilgås til elektrofysiologiske optagelser. Derefter inkuberes cellerne under standardkulturbetingelser i ikke mindre end to timer for at lade cellerne holde sig, og ikke mere end 24 timer, da endotelceller bliver flade og vanskelige at lappe, når de er seedet ved underkonfluenitet i mere end 24 timer.Fjern derefter et dækglas med de klæbende celler fra en brønd af den seks-brønds plade og skyl hurtigt i PBS. Derefter overføres dækglasset med celler til en 35 millimeter petriskål indeholdende to milliliter elektrofysiologisk BAF-opløsning. Overfør straks dækglasset med celler til MPP-strømningskammeret.Overfør dækglascirklen til det rektangulære dækglas, stykke D, som er tilklæbet til stykke C i MPP-strømningskammeret. Tilsæt BAF-opløsningen for helt at nedsænke dækglascirklen og cellerne. Placer derefter dækglascirklen på stykke D, så cellerne vil være i overensstemmelse med slidsåbningerne i stykke B.Sørg for, at dækglascirklen klæber til stykke D gennem opløsningsglasvedhæftning for at undgå afbrydelse af dækglascirklens position ved flowapplikationen.Derefter samles MPP flow kammer ved at skrue brikkerne sammen i den rigtige rækkefølge. Overfør kammeret til mikroskopet fase og straks gennemgå kammeret med BAF opløsning. Dernæst identificere en sund celle med en mørk kant og indlysende kerne til eksperimentet.Undgå celler, der ser ud til at være spæk eller celler, der er i kontakt med andre celler. For at kontrollere forskydningsstress skal du oprette et tyngdekraftsperfusionssystem ved at forbinde en 30 milliliter gradueret sprøjtecylinder til en trevejs Luer-lås udstyret med microbore-slanger. Dernæst vedhæfte den graduerede cylinder til Faraday buret omkring elektrofysiologi riggen ved hjælp af dobbeltsidet tape.Før slangen sættes i MPP-kammeret, fyldes sprøjten og slangen med BAF-opløsningen. Sæt derefter slangen ind i MPP-flowkammerets indløbshul i stykke A.Forfyld MPP-flowkammeret med opløsning, så det fjernes i vakuumbeholderen. Stop strømmen til kammeret og genopfyld den graduerede cylinder til topmærket.Beregn strømningshastigheden manuelt ved hjælp af et stopur ved at lade opløsningen flyde gennem kammeret i en given sprøjtecylinderhøjde. Hæv eller sænk sprøjten for at ændre strømmen og beregne forskydningsstressen i et parallelt kammer ved hjælp af denne ligning. Gentag denne proces, indtil et ønsket niveau af forskydningsstress er fundet.Overfør derefter et samlet kammer, der indeholder klæbende celler, til mikroskopstadiet i elektrofysiologiriggen. Og indsæt slangen, fyldt med BAF opløsning, i hullet i stykke A.Derefter fylde kammeret og vaske cellerne med 10 milliliter BAF opløsning, samtidig. Når den ønskede patch konfiguration er opnået, tillade kanal strømme til at stabilisere i et statisk bad ved stuetemperatur.Så snart strømmene har stabiliseret sig, anvende forskydning i en trinvis måde, så den øgede strøm til at stabilisere forud for det næste skridt i forskydning stress stigning. Fjern forskydningseksponeringen for cellerne ved at stoppe strømmen til kammeret, så mekanosensitive kanalstrømer kan vende tilbage til baseline strømme observeret i det statiske bad. Vist her er en repræsentativ rå optagelse af Kir strøm fra en primær mus mesenteric endotelcelle med bemærkelsesværdige lineære udadgående lækage strøm.En rampe på negative 140 til positive 40 millivolt blev påført plasteret over 400 millisekunder. Lækagestrøm forhindrer analyse af ægte Kir kanal aktivitet. Hvis du vil trække lækagestrøm, skal du først beregne den lineære hældningsledning af lækagestrøm.Flere G hældning ved tilsvarende spændinger af hele rå spor til plot lækage strøm på de rå data. Linjen skal overlejre den ydre lineære lækage nøjagtigt. Træk derefter den afbildede lækagestrøm fra hele sporingen, så den lineære udadgående strøm er omkring nul picoampere pr. picofarad, og den virkelige Kir-strøm kan analyseres.Det vigtigste at huske, når du forsøger denne procedure er at korrekt placere dækslet glas i kammeret, så cellerne er tilgængelige for eksperimenter. Sørg desuden for, at dækslet er tilstrækkeligt påklæbet til stykke D, således at væskestrømmen ikke forstyrrer dækglasset, der indeholder celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Single Cell Målinger af vacuolær Brud forårsaget af Intracellulære patogener

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Udarbejdelse af Single-celle suspensioner for cytofluorimetrisk Analyse fra forskellige musehud Regioner

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induktion af celledifferentiering og single cell imaging af<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Svømmer og sværmerceller

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...