Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
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Ces travaux ont été financés par le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) et (T32 HL007829-24, ISF). Les auteurs aimeraient également remercier le Scientific Machine Shop de l'Université de l'Illinois à Chicago pour avoir généré nos dernières chambres de flux mPP.

L'utilisation d'animaux dans nos études est approuvée par l'Université de l'Illinois au Chicago Animal Care Committee (#16-183).
1. Assemblage de la chambre de flux de plaques parallèles modifiées
REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et la figure 1 pour les pièces d'information de la chambre de circulation des députés. Veuillez consulter la figure 1 pour un sché...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

Le système vasculaire est constamment exposé aux forces hémodynamiques actives, qui activent les canaux ioniques mécanosensibles3,22 mais les rôles physiologiques de ces canaux dans la mécanotransduction induite par le stress de cisaillement est seulement commence à émerger4,6,8. Les mécanismes responsables de la méchanosensibilité des canaux activés par le s...

Les forces hémodynamiques générées par le flux sanguin sont bien connues pour jouer des rôles majeurs dans la fonction endothéliale et vasculaire1,2. Il est également bien connu que plusieurs types de canaux ioniques répondent vivement aux changements dans le stress de cisaillement3,4,5 conduisant à l'hypothèse que les canaux ioniques peuvent être des capteurs de stress de cisaillement primaire. Plus récemment, nous et d'autres avons montré que les canaux ioniques mécanosensibles jouent des rôles critiques dans plusieurs fonctions vasculaires sensibles au stress de cisaillement, y compris la réponse vasoactive au stress de cisaillement6,7,8 , et l'angiogenèse développementale9. Les mécanismes de la sensibilité de cisaillement-stress des canaux d'ion, cependant, sont presque totalement inconnus. Cette lacune de connaissances est probablement due à la difficulté technique d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini. Dans cet article, par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé étape par étape régulièrement effectué dans notre laboratoire pour atteindre cet objectif6,7,10,11.
L'objectif global de cette méthode est de permettre l'investigation en temps réel de la mécanactivation du canal ionique sous un stress bien défini dans la gamme physiologique. Ceci est réalisé en modifiant une chambre parallèle standard d'écoulement de plaque pour permettre à une pipette électrophysiologique d'être abaissée dans la chambre et aux cellules d'accès cultivées sur la plaque inférieure pendant l'exposition en temps réel au flux, fournissant une approche unique pour réaliser ceci but6,7,11. En revanche, les chambres parallèles standard d'écoulement de plaque, décrites dans les publications précédentes peuvent être employées pour l'analyse en temps réel d'imagerie des cellules exposées aux forces de cisaillement12 ou à d'autres approches non-invasives13,14 mais pas pour Électrophysiologie. De même, l'appareil de cône et de plaque, une autre approche puissante pour exposer des cellules au stress de cisaillement15,16 n'est pas non plus approprié pour des enregistrements électrophysiologiques. Ainsi, ces dispositifs de débit ne permettent pas l'enquête sur la sensibilité au stress de cisaillement des canaux ioniques. La difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous le flux est la principale raison du manque d'informations sur les mécanismes responsables de ces effets cruciaux.
Pour ce qui est des approches alternatives pour atteindre le même objectif, il n'y en a aucune qui soit aussi précise ou contrôlée. Certaines études antérieures ont tenté d'enregistrer l'activité des canaux ioniques sous le flux en exposant les cellules à un flux de liquide provenant d'une autre pipette apportée à proximité d'une cellule de plus de17,18. C'est très non physiologique, car les forces mécaniques générées dans ces conditions ont peu en commun avec les profils physiologiques du stress de cisaillement dans les vaisseaux sanguins. Des préoccupations similaires s'appliquent aux tentatives de simuler le stress physiologique du cisaillement par perfusion de chambres ouvertes. Comme nous l'avons vu en détail dans notre étude précédente10, une interface à ciel liquide ouvert crée de multiples perturbations et recirculation, qui ne sont pas physiologiques. Pour répondre à toutes ces préoccupations, nous avons conçu une chambre de débit de plaque parallèle modifiée (MPP), également appelée « dispositif d'écoulement mini-invasif » dans nos études antérieures6,7,10,11, faite de l'acrylique et largement utilisé dans notre laboratoire. Cependant, en dépit du fait que la description originale de la conception a été publiée il y a près de 20 ans et qu'elle est le seul dispositif d'écoulement qui permet d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini, cette méthodologie n'a pas été adopté par d'autres laboratoires et il n'y a que très peu d'études qui tentent d'enregistrer les courants en cours d'écoulement. Nous croyons, par conséquent, que fournir une description détaillée de l'utilisation de la chambre de débit MPP sera d'une grande aide pour les chercheurs qui s'intéressent aux canaux ioniques mécanosensibles et la biologie vasculaire.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Le stress de cisaillement de fluide est bien connu pour jouer un rôle important dans la fonction endothéliale. Dans la plupart des lits vasculaires, le stress élevé de cisaillement des augmentations aigues du flux sanguin déclenche une cascade de signalisation ayant pour résultat la vasodilatation atténcitant ainsi le stress mécanique sur la paroi vasculaire. Le modèle de l'effort de cisaillement est également bien connu pour être un facteur critique dans le développement de l'athérosclérose avec l'effort laminaire de cisaillement étant atheroprotective et le stress perturbé de cisaillement étant pro-atherogenic. Bien que nous ayons une compréhension détaillée des différentes voies intermédiaires de signalisation cellulaire, les récepteurs qui traduisent d'abord le stimulus mécanique en médiateurs chimiques ne sont pas complètement compris. Les canaux ioniques mécanosensibles sont essentiels à la réponse au cisaillement et régulent la signalisation cellulaire induite par le cisaillement contrôlant ainsi la production de médiateurs vasoactifs. Ces canaux sont parmi les premiers composants de signalisation activés à cisaillement et ont été liés à la vasodilatation induite par le cisaillement par la promotion de la production d'oxyde nitrique (p. ex., rectification intérieure de Ket potentiel récepteur transitoire [TRP] canaux) et facteur d'hyperpolarisation de l'endothélium (p. ex., canaux K et K activés par le calcium) et vasoconstriction induite par le cisaillement par un mécanisme indéterminé qui implique des canaux piézoïdes. Comprendre le mécanisme biophysique par lequel ces canaux sont activés par des forces de cisaillement (c.-à-d. directement ou par un récepteur mécano-récepteur primaire) pourrait fournir de nouvelles cibles potentielles pour résoudre la pathophysiologie associée au dysfonctionnement endothélial et l'athérogenèse. Il est encore un défi majeur d'enregistrer l'activation induite par le flux des canaux ioniques en temps réel en utilisant l'électrophysiologie. Les méthodes standard pour exposer les cellules à un stress bien défini, comme le rhéomètre de cône et de plaque et la chambre d'écoulement parallèle fermée de plaque ne permettent pas l'étude en temps réel de l'activation de canal d'ion. Le but de ce protocole est de décrire une chambre de flux de plaque parallèle modifiée qui permet l'enregistrement électrophysiologique en temps réel des canaux ioniques mécanosensibles sous le stress bien défini de cisaillement.

Plusieurs photographies montrant des vues différentes de la chambre d'écoulement du MPP à l'étape du microscope (panneau supérieur) et une représentation schématique de la chambre d'écoulement du MPP (panneau inférieur) sont présentées à la figure 1. Le schéma détaille les dimensions de l'ensemble de l'appareil et de la chambre d'écoulement. La figure 2 montre une photographie du système de perfusion gravitationne...

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Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d'écoulement de plaque pour l'usage en étudiant l'activation en temps réel des canaux d'ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

L’utilisation de la chambre d’écoulement parallèle modifiée de plaque peut aider des chercheurs à répondre aux questions clés relatives à la réponse fonctionnelle des canaux iion mécanosensibles au stress de cisaillement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une enquête en temps réel pour couler les canaux iion activés dans une chambre d’écoulement parallèle facilement assemblée et réutilisable. Pour commencer la procédure, appliquez une fine couche de solution élastomer en silicone sur les bords de l’espace rectangulaire de la pièce C, et placez doucement le verre rectangulaire de couverture, pièce D, directement sur la solution élastomères pour couvrir complètement l’espace rectangulaire ouvert de la pièce C.Essuyez soigneusement l’excès de solution d’élastomères en silicone.Ensuite, répétez la procédure d’adhésion du verre rectangulaire de couverture, pièce F, au fond de la pièce E et permettre à la solution élastomères de silicone de guérir toute la nuit à température ambiante. Maintenant, assemblez la chambre de flux MPP en plaçant séquentiellement chaque pièce sur le dessus de la précédente, en commençant par la chambre inférieure, pièce E, puis pièce C, pièce B, suivie de la pièce A sur le dessus. Ensuite, alignez les trous de vis de chaque pièce aux coins et vissez étroitement les morceaux ensemble pour empêcher les fuites de se produire tout en administrant le flux à la chambre d’écoulement de MPP.Dans une assiette de six puits, placer de quatre à cinq, 12 millimètres couvrir les cercles de verre dans chaque puits. Sauver les cellules entre 10% et 30% confluence, de sorte que les cellules simples peuvent être consultés pour les enregistrements électrophysiologiques. Par la suite, incuber les cellules dans des conditions de culture standard pendant pas moins de deux heures pour permettre aux cellules d’adhérer, et pas plus de 24 heures, car les cellules endothéliales deviendront plates et difficiles à patcher lorsqu’elles sont ensemencées au sous-fluent pendant plus de 24 heures.Ensuite, retirez un verre de couverture contenant les cellules adhérentes d’un puits de la plaque de six puits et rincez rapidement dans PBS. Ensuite, transférez le verre de couverture avec des cellules dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant deux millilitres de solution électrophysiologique de BAF. Transférez immédiatement le verre de couverture avec des cellules à la chambre d’écoulement de MPP.Transférer le cercle de verre de couverture dans le verre rectangulaire de couverture, pièce D, qui est adhéré à la pièce C de la chambre d’écoulement MPP. Ajouter la solution BAF pour submerger complètement le cercle de verre de couverture et les cellules. Par la suite, placez le cercle de verre de couverture sur la pièce D de telle sorte que les cellules seront en ligne avec les ouvertures de fente de la pièce B.Assurez-vous que le cercle de verre de couverture adhère à la pièce D par l’adhérence en verre de solution pour éviter la perturbation de la position du cercle de verre de couverture par l’application de flux.Ensuite, assemblez la chambre d’écoulement du député en vissant les pièces ensemble dans l’ordre approprié. Transférez la chambre au stade du microscope et infusez immédiatement la chambre avec la solution BAF. Ensuite, identifiez une cellule saine avec une bordure foncée et un noyau évident pour l’expérience.Évitez les cellules qui semblent être des graisses ou des cellules qui sont en contact avec d’autres cellules. Pour contrôler le stress du cisaillement, installez un système de perfusion par gravité en connectant un cylindre de seringue gradué de 30 millilitres à une serrure Luer à trois sens équipée d’un tube de microbore. Ensuite, attachez le cylindre gradué à la cage de Faraday entourant la plate-forme d’électrophysiologie à l’aide de ruban adhésif à double face.Avant d’insérer le tube dans la chambre du député, pré-remplir la seringue et le tube avec la solution BAF. Ensuite, insérez le tube dans le trou d’entrée de la chambre d’écoulement du député de la pièce A.Pré-remplissez la chambre d’écoulement du député avec une solution, de sorte qu’il est enlevé dans le réservoir de vide. Arrêtez le flux vers la chambre et remplissez le cylindre gradué jusqu’à la marque supérieure.Calculez le débit manuellement à l’aide d’un chronomètre en permettant à la solution de circuler à travers la chambre à une hauteur de cylindre de seringue donnée. Soulevez ou abaissez la seringue pour modifier le débit et calculer le stress de cisaillement dans une chambre parallèle à l’aide de cette équation. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un niveau désiré de stress de cisaillement soit trouvé.Par la suite, transférez une chambre assemblée contenant des cellules adhérentes au stade du microscope de la plate-forme d’électrophysiologie. Et insérer le tube, pré-rempli de solution BAF, dans le trou de la pièce A.Then, remplir la chambre et laver les cellules avec 10 millilitres de solution BAF, simultanément. Une fois que la configuration de patch désirée est obtenue avec succès, laissez les courants de canal se stabiliser dans un bain statique à température ambiante.Dès que les courants se sont stabilisés, appliquez le cisaillement d’une manière pas à pas, permettant à l’augmentation du courant de se stabiliser avant la prochaine étape de l’augmentation du stress de cisaillement. Éliminez l’exposition au cisaillement des cellules en arrêtant le flux vers la chambre, ce qui permet aux courants de canaux mécanosensibles de revenir aux courants de base observés dans le bain statique. Montré ici est un enregistrement brut représentatif du courant kir à partir d’une cellule endothéliale mésentérique de souris primaire avec courant de fuite linéaire notable vers l’extérieur.Une rampe de 140 à 40 millivolts positifs a été appliquée au patch sur 400 millisecondes. Le courant de fuite empêche l’analyse de l’activité réelle du canal Kir. Pour soustraire le courant de fuite, calculez d’abord la conductance linéaire de la pente du courant de fuite.Pente de G multiple par les tensions correspondantes de la trace brute entière pour tracer le courant de fuite sur les données brutes. La ligne doit superposer la fuite linéaire vers l’extérieur exactement. Ensuite, soustrayez le courant de fuite tracé de toute la trace de sorte que le courant extérieur linéaire est d’environ zéro picoamperes par picofarad, et le courant kir réel peut être analysé.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de positionner correctement le verre de couverture dans la chambre afin que les cellules soient accessibles pour des expériences. En outre, assurez-vous que le bordereau de couverture est adéquatement adhéré à la pièce D, de sorte que le flux de liquide ne perturbe pas le verre de couverture contenant des cellules.

Research

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