Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון (R01 HL073965, IL) ו (T32 HL007829-24, קרן הלאומית). המחברים גם רוצה להכיר את המכונה המדעית חנות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו להפקת שלנו האחרונים שלנו לתאי זרימה.

השימוש בבעלי חיים בלימודים שלנו מאושר על ידי אוניברסיטת אילינוי בוועדת הטיפול בבעלי חיים בשיקגו (16-183).
1. הרכבת לשכת הזרם של הלוח המקביל המתוקן
הערה: נא עיין בטבלה 1 ובאיור 1 עבור מזהי החלקים הקאמריים של זרימת MPP. אנא התייחס <strong ...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

מערכת כלי הדם נחשפת כל הזמן לכוחות המטדינאמיים הפעילים, המפעילים את ערוצי היון המכניים3,22 אך התפקידים הפיזיולוגיים של הערוצים הללו בהטיה הנגרמת רק . מתחילים להופיע4,6,8 המנגנונים האחראים לרגישות המנגנון של ?...

כוחות הומודינמיים המופקים על ידי זרימת הדם ידועים לשחק תפקידים מרכזיים בפונקציה אנדותל ובתפקוד כלי דם1,2. כמו כן ידוע גם כי מספר סוגים של ערוצי יונים בחריפות להגיב לשינויים בלחץ הטיה3,4,5 המוביל ההשערה כי ערוצי יון יכול להיות ראשי מתח להטות חיישנים. לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי ערוצי היונים הרגישים מאוד לשחק תפקידים קריטיים בכמה פונקציות המתח להטות-לחץ רגיש, כולל התגובה vasoactive כדי להטות את הלחץ6,7,8 ואנגיוגנזה התפתחותי9. לעומת זאת, המנגנונים של רגישות ההטיה של ערוצי היונים אינם ידועים כמעט לחלוטין. פער הידע הזה עשוי להיות בשל הקושי הטכני של ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת לחץ גזירה מוגדר היטב. במאמר זה, לכן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול מפורט באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג את המטרה הזאת6,7,10,11.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר חקירה בזמן אמת של ערוץ יון מכונאי תחת מוגדר להדגיש הטיה בטווח הפיזיולוגי. זה מושגת על ידי שינוי תא מקביל לוחית הלוח המקביל כדי לאפשר לצינורות אלקטרופיזיולוגיה להיות מופחת לתוך התאים לתאי הגישה גדל על הלוח התחתון בזמן חשיפה ממשית לזרום, מתן גישה ייחודית כדי להשיג את זה . מטרה6,7,11 לעומת זאת, תאים סטנדרטיים מקבילים לוחות הלוח, המתואר בפרסומים קודמים ניתן להשתמש עבור ניתוח הדמיה בזמן אמת של תאים חשופים כוחות הטיה12 או אחרים שאינם פולשנית גישות13,14 אבל לא עבור אלקטרופיזיולוגיה. באופן דומה, חרוט ומכשיר צלחת, עוד גישה רבת עוצמה כדי לחשוף את התאים כדי להטות את הלחץ15,16 הוא גם לא מתאים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לפיכך, מתקני זרימה אלה אינם מאפשרים את החקירה של הטיית הרגישות של ערוצי יונים. הקושי בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתחת לזרימה הוא הסיבה העיקרית לפאולעיר המידע על המנגנונים האחראים להשפעות הקריטיות הללו.
מבחינת הגישות החלופיות להשגת אותה מטרה, אין כאלה מדויקים או מבוקרים. כמה מחקרים קודמים ניסו להקליט את הפעילות ערוץ יון תחת הזרימה על ידי חשיפת תאים לזרם של נוזל המגיע מצינורות אחרים הביא לקרבת תא מ17,18. זה מאוד לא פיזיולוגי, כמו כוחות מכניים שנוצרו בתנאים אלה יש מעט משותף עם פרופילים פיזיולוגיים של מתח הטיה בכלי הדם. חששות דומים חלים על ניסיונות לדמות לחץ הטיה פיסיולוגיים על ידי הפרזיה של התאים הפתוחים. כפי שנדונו בפירוט במחקר המוקדם שלנו10, ממשק פתוח באוויר הנוזלי יוצר הפרעות מרובות, שאינן פיזיולוגיות. כדי לטפל בכל החששות האלה, עיצבנו לוחית מקבילית שונה (MPP) תא זרימה, המכונה גם "מכשיר הזרמת מינימלית פולשנית" במחקרים המוקדמים שלנו6,7,10,11, עשה מאקריליק ושימוש נרחב במעבדה שלנו. עם זאת, למרות העובדה כי התיאור המקורי של העיצוב פורסם כמעט לפני 20 שנה והוא מכשיר הזרימה היחיד המאפשר ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת מוגדרים היטב להדגיש הטיה, מתודולוגיה זו לא היתה שאומצה על-ידי מעבדות אחרות ויש רק מעט מחקרים שמנסים להקליט זרמים בזרם. אנו מאמינים, אפוא, כי מתן תיאור מפורט עבור שימוש בחדר הזרימה MPP יהיה לעזר רב למחקרים המעוניינים בערוצי יון ומכנירגישים וביולוגיה כלי דם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

מתח הטיית נוזלים ידוע לשחק תפקיד מרכזי בפונקציה אנדותל. ברוב מיטות כלי הדם, מתח הטיה מוגבר מגדילה חריפה בזרימת הדם מעורר אשד איתות וכתוצאה מכך ובכך מקלה על לחץ מכני על הקיר כלי הדם. הדפוס של מתח הטיה ידוע גם להיות גורם קריטי בפיתוח טרשת עורקים עם מלבינו להטות את הלחץ להיות atherop, מופרע להטות מתח להיות pro-atherגנטית. בעוד יש לנו הבנה מפורטת של מסלולים שונים של תא ביניים איתות, הקולטנים הראשונים לתרגם את הגירוי המכני לתוך מגשרים כימיים לא מובנים לחלוטין. ערוצי יונים מכניתרגישים באופן קריטי לתגובה להטיה ולוויסות איתות התא המושרה להטיה ובכך שליטה בייצור מגשרים של vasoactive. ערוצים אלה הם בין הרכיבים המוקדמים ביותר המופעל איתות כדי להטות וקושרו המושרה להטות הנגרמת באמצעות קידום הייצור תחמוצת החנקן (g., מבפנים לתקן K+ [קיר] פוטנציאל קולטן ארעי [trp] ערוצים) ו מקדם היפרפרזת היתר (למשל, קיר והפעלת סידן K+ [kca] ערוצים) ו להטות המושרה באמצעות מנגנון לא נקבע המערבת ערוצי piezo. הבנת המנגנון הביופיזיקלי שדרכו ערוצים אלה מופעלים על-ידי כוחות הטיה (כלומר, ישירות או באמצעות קולטן מכונאי ראשי) יכול לספק מטרות חדשות פוטנציאליות כדי לפתור את הפתופסולוגיה הקשורים בתפקוד האנדותל ו atherogenesis. זה עדיין האתגר העיקרי להקליט הפעלת זרימה המושרה של ערוצי יון בזמן אמת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. השיטות הסטנדרטיות לחשוף תאים למתח הטיה מוגדר היטב, כגון חרוט ולוחית הצלחת ומתח מקביל לוחית הלוח לא מאפשרים מחקר בזמן אמת של הפעלת ערוץ יונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר תא זרימה שונה של הלוח המקביל המאפשר הקלטה בזמן אמת אלקטרופיסיולוגית של ערוצי יון מכונאי מוגדר תחת לחץ הטיה מוגדרים היטב.

תצלומים מרובים המציגים תצוגות שונות של תא הזרימה MPP על הבמה המיקרוסקופ (הפאנל העליון) וייצוג סכמטי של תא הזרימה MPP (הפאנל התחתון) מוצגים באיור 1. הסכמטי מפרט את הממדים של המתקן כולו ותאי הזרימה. איור 2 מראה תצלום של מערכת הכבידה של המערכת לחדר...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

השימוש בתא זרימת הלוח המקביל שונה יכול לעזור לחוקרים לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתגובה תפקודית של ערוצי יון מכניים כדי להפיג מתח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקירה בזמן אמת להזרים תעלות יון מופעלות בתא זרימת לוח מקבילי קל להרכבה לשימוש חוזר. כדי להתחיל את ההליך, להחיל שכבה דקה של פתרון אלסטומר סיליקון סביב הקצוות של החלל המלבני של חתיכת C, בעדינות למקם את זכוכית כיסוי מלבני, חתיכת D, ישירות על פתרון אלסטומר כדי לכסות לחלוטין את החלל המלבני הפתוח של חתיכת C.בזהירות למחוק עודף סיליקון אלסטומר פתרון.לאחר מכן, חזור על ההליך להקפדה על זכוכית הכיסוי המלבנית, חתיכת F, לתחתית חתיכת E ולאפשר פתרון אלסטומר סיליקון לרפא לילה בטמפרטורת החדר. עכשיו, להרכיב את תא הזרימה MPP על ידי הצבת ברצף כל חתיכה על גבי הקודם, החל התא התחתון, חתיכה E, אז חתיכה C, חתיכה B, ואחריו חתיכה A בחלק העליון. לאחר מכן, ליישר את חורי הבורג של כל חתיכה בפינות בחוזקה לדפוק את החלקים יחד כדי למנוע דליפות להתרחש בעת מתן זרימה לתא הזרימה MPP.בצלחת שש בארות, מניחים ארבעה עד חמישה, 12 מילימטר לכסות עיגולי זכוכית בכל באר. שמור את התאים בין 10% ל- 30%confluency, כך שניתן יהיה לגשת לתאים בודדים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחר מכן, הדגירה את התאים בתנאי תרבות סטנדרטיים במשך לא פחות משעה כדי לאפשר לתאים לדבוק, ולא יותר מ 24 שעות, כמו תאים אנדותל יהפוך שטוח וקשה לתקן כאשר זרע בתת מודע במשך יותר מ 24 שעות.לאחר מכן, להסיר כיסוי המכיל את התאים דבק מ באר של צלחת שש באר במהירות לשטוף PBS. לאחר מכן, להעביר את זכוכית הכיסוי עם תאים לצלחת פטרי 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של פתרון BAF אלקטרופיזיולוגי. מיד להעביר את זכוכית הכיסוי עם תאים לתא הזרימה MPP.מעבירים את עיגול זכוכית הכיסוי לזכוכית הכיסוי המלבנית, חתיכת D, אשר דבק חתיכת C של תא זרימה MPP. הוסף את פתרון BAF כדי להטביע לחלוטין את מעגל הזכוכית המכסה ואת התאים. לאחר מכן, למקם את עיגול זכוכית כיסוי על חתיכת D כך התאים יהיו בקו אחד עם פתחי חריץ של חתיכת B.ודא כי מעגל זכוכית כיסוי דבק חתיכת D באמצעות הידבקות זכוכית פתרון, כדי למנוע שיבוש של המיקום של עיגול זכוכית הכיסוי על ידי יישום הזרימה.לאחר מכן, להרכיב את תא הזרימה MPP על ידי בורג החלקים יחד בסדר המתאים. מעבירים את התא לשלב המיקרוסקופ ומעבירים מיד את התא בתתא BAF. לאחר מכן, לזהות תא בריא עם גבול כהה וגרעין ברור לניסוי.הימנע מתאים שנראים כמו בלוף או תאים במגע עם תאים אחרים. כדי לשלוט בלחץ גזירה, להגדיר מערכת חיסון כבידה על ידי חיבור 30 מיליליטר סיים צילינדר מזרק למנעול לואר משולש מצויד צינורות microbore. לאחר מכן, חבר את הצילינדר המסוים לכלוב פאראדיי המקיף את אסדת האלקטרופיזיולוגיה באמצעות קלטת דו-צדדית.לפני החדרת הצינורות בתא MPP, למלא מראש את המזרק צינורות עם פתרון BAF. לאחר מכן, הכנס את הצינורות לתוך חור הכניסה תא זרימה MPP של חתיכת A.Pre-למלא את תא הזרימה MPP עם פתרון, כך שהוא מוסר במאגר ואקום. עצרו את הזרימה לתא ומילוי הצילינדר המסוים לסימן העליון.חשב את קצב הזרימה באופן ידני באמצעות שעון עצר בכך שתאפשר לפתרון לזרום דרך התא בגובה גליל מזרק נתון. הרם או הנך את המזרק כדי לשנות את הזרימה ולחשב את הלחץ הגזירה בתא מקביל באמצעות משוואה זו. חזור על תהליך זה עד שנמצאת רמה רצויה של מתח גזירה.לאחר מכן, להעביר תא מורכב המכיל תאים דבקים לשלב המיקרוסקופ של אסדת האלקטרופיזיולוגיה. ולהכניס את הצינור, מלא מראש עם פתרון BAF, לתוך החור של חתיכת A.Then, למלא את התא ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של פתרון BAF, בו זמנית. לאחר שתצורת התיקון הרצויה מתקבלת בהצלחה, אפשרו לזרמים בתעלה להתייצב באמבטיה סטטית בטמפרטורת החדר.ברגע שהזרמים התייצבו, יש למרוח את ההמהר בצורה צעדית, ולאפשר לזרם המוגבר להתייצב לפני השלב הבא של עליית הלחץ. הסר את החשיפה הגזירה לתאים על ידי עצירת הזרימה לתא, המאפשר זרמי ערוץ מכני לחזור זרמים בסיסיים שנצפו באמבטיה הסטטית. מוצג כאן הוא הקלטה גולמית מייצגת של זרם קיר מתא אנדותל קסנתל עכבר ראשי עם זרם דליפה חיצונית ליניארית בולטת.רמפה של 140 עד 40 מילי-וולטים חיוביים הוחלה על התיקון מעל 400 אלפיות שנייה. זרם הדליפה מונע ניתוח של פעילות ערוץ קיר אמיתית. כדי להפחית את זרם הדליפה, חשב תחילה את מוליכות השיפוע ליניארי של זרם הדליפה.שיפוע G מרובים על ידי מתחים מתאימים של כל עקבות גלם כדי להתוות זרם דליפה על הנתונים הגולמיים. הקו צריך כיסוי הדליפה ליניארית כלפי חוץ בדיוק. לאחר מכן, הפחת את זרם הדליפה המותווה מכל העקבות כך שהזרם החיצוני ליניארי יהיה בערך אפס פיקומפר לכל פיקופראד, ו ניתן לנתח את זרם הקיר האמיתי.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא למקם כראוי את זכוכית הכיסוי בתא, כך התאים נגישים לניסויים. בנוסף, ודא כי להחליק את הכיסוי הוא דבק כראוי חתיכת D, כך זרימת נוזלים אינו משבש את זכוכית הכיסוי המכיל תאים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...