Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
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この研究は、国立心臓、肺、血液研究所(R01 HL073965、IL)および(T32 HL07829-24、ISF)によって資金提供されました。著者らはまた、私たちの最新のMPPフローチャンバーを生成するために、シカゴのイリノイ大学の科学機械ショップを認めたいと思います。

私たちの研究で動物の使用は、シカゴ動物ケア委員会(#16-183)でイリノイ大学によって承認されています。
1. 修正平行板フローチャンバーの組み立て
注:MPP フローチャンバピースの図1および図 1を参照してください。組み立て用チャンバーピースの向きを詳述した回路図については、図1</st...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

血管系は常に活発な血行力にさらされ、メカノ感受性イオンチャネル3、22を活性化するが、せん断ストレス誘発メカノトランスダクションにおけるこれらのチャネルの生理的役割は、唯一の出現し始める 4,6,8.せん断応力活性化チャネルのメカノ感受性を担うメカニズムは未知の...

血流によって発生する血行力は、内皮および血管機能1、2において主要な役割を果たすることがよく知られている。また、いくつかのタイプのイオンチャネルがせん断応力3、4、5の変化に鋭く反応し、イオンチャネルが一次せん断応力センサになりうするという仮説を導くこともよく知られている。最近では、我々と他の人は、メカノ感受性イオンチャネルがせん断ストレス6、7、8に対する血管活性応答を含むいくつかのせん断ストレス感受性血管機能において重要な役割を果たすことを示した。、および発達血管新生9.しかし、イオンチャネルのせん断応力感受性のメカニズムはほとんど全く知られていない。この知識のギャップは、明確に定義されたせん断応力の下で電気生理学的記録を行うことの技術的な困難に起因する可能性が高い。したがって、この記事では、この目標6、7、10、11を達成するためにラボで日常的に実行される詳細なプロトコルを段階的に提供します。
この方法の全体的な目標は、生理学的範囲で明確に定義されたせん断ストレスの下でイオンチャネルメカノ活性化のリアルタイム調査を可能にすることです。これは、標準的な並列プレートフローチャンバを変更して、電気生理学的ピペットをチャンバ内に下げ、リアルタイムの流量の間に底板上で成長した細胞にアクセスできるようにすることで達成され、これを達成するためのユニークなアプローチを提供します。ゴール6,7,11.対照的に、以前の出版物に記載されている標準的な並列板流れ室は、せん断力12または他の非侵襲的アプローチ13、14に曝露された細胞のリアルタイムイメージング分析に使用することができるが、以下の場合には使用できない。電気 生理 学。同様に、コーン及び板装置は、せん断応力15、16に細胞を露出させる別の強力なアプローチも電気生理学的記録には適していない。したがって、これらの流れ装置は、イオンチャネルのせん断応力感度の調査を可能にしない。流れの下で電気生理学的記録を行うことの難しさは、これらの重要な効果を担当するメカニズムに関する情報の貧弱さの主な理由です。
同じ目標を達成するための代替アプローチに関しては、正確または制御されているものはありません。いくつかの以前の研究は、17、18の上から細胞の近くに持って来た別のピペットから来る液体の流れに細胞を露出することによって、流れの下でイオンチャネル活性を記録しようとしました。これらの条件下で発生する機械的力は、血管内のせん断ストレスの生理学的プロファイルとほとんど共通点を持たないため、これは非常に非生理学的である。同様の懸念は、開いているチャンバーの灌流によって生理的せん断ストレスをシミュレートする試みに適用されます。我々の以前の研究10で詳しく説明したように、開いた液体空気界面は、非生理学的である複数の妨害および再循環を作成する。これらすべての懸念に対処するために、我々は、我々の以前の研究6、7、10、11で「最小限に侵略的な流れ装置」とも呼ばれる修正された平行板(MPP)フローチャンバーを設計しました。アクリルから、私たちの研究室で広く使用されています。しかし、設計の元の説明はほぼ20年前に公開されており、明確に定義されたせん断応力の下で電気生理学的記録を行うことを可能にする唯一のフローデバイスであるという事実にもかかわらず、この方法論は行われていなかった。他のラボで採用され、流れの下で電流を記録しようとする研究はごくわずかです。したがって、MPPフローチャンバーを使用するための詳細な説明を提供することは、メカノ感受性イオンチャネルおよび血管生物学に興味を持っている研究に大きな助けになると信じています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

流体せん断応力は、内皮機能において大きな役割を果たすることがよく知られている。ほとんどの血管床では、血流の急激な増加によるせん断ストレスの上昇は、血管拡張を引き起こし、それによって血管壁の機械的ストレスを緩和するシグナル伝達カスケードを引き起こす。せん断ストレスのパターンは、層せん断ストレスがアテローム保護および乱れたせん断ストレスがプロアトロジェニックであるアテローム性動脈硬化症の発症の重要な要因であることもよく知られている。様々な中間細胞シグナル伝達経路を詳しく理解していますが、最初に機械的刺激を化学メディエーターに変換する受容体は完全には理解されていません。メカノ感受性イオンチャネルは、せん断に対する応答に不可欠であり、それによって血管活性メディエーターの産生を制御するせん断誘発細胞シグナル伝達を調節する。これらのチャネルは、せん断する最も初期の活性化シグナル伝達成分の一部であり、一酸化窒素産生を促進することによりせん断誘発性血管拡張にリンクされている(例えば、内側に整流K +[Kir]および一過性受容体電位[TRP]チャネル)および内皮過分極因子(例えば、Kirおよびカルシウム活性化K+[KCa]チャネル)およびピエゾチャネルを含む未決定のメカニズムを介してせん断誘発血管収縮。これらのチャネルがせん断力(すなわち、直接または一次メカノ受容体を介して)によって活性化される生物物理学的メカニズムを理解することは、内皮機能障害に関連する病態生理学を解決するための潜在的な新しい標的を提供する可能性があるそしてアテロジェネシス。電気生理学を用いて、イオンチャネルの流れ誘発活性化をリアルタイムで記録することは、依然として大きな課題です。円盤とプレートレオメータや閉じた平行プレートフローチャンバなど、明確に定義されたせん断応力に細胞をさらす標準的な方法では、イオンチャネル活性化のリアルタイム調査はできません。このプロトコルの目的は、明確に定義されたせん断応力の下でメカノセンシティブイオンチャネルのリアルタイム電気生理学的記録を可能にする修正された並列プレートフローチャンバを記述することです。

顕微鏡ステージ上のMPPフローチャンバーの異なるビューを示す複数の写真(上パネル)とMPPフローチャンバー(下パネル)の概略表現を図1に示す。回路図は、デバイス全体とフローチャンバの寸法を詳細にします。図2は、当研究室(上パネル)におけるMPP流れ室への重力灌流システムの写真を示す。また、灌流システムからの溶?...

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Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

明確に定義されたせん断応力下の単一細胞イオン電流の電気生理学的記録

このプロトコルの目的は、せん断応力によるメカノ感受性イオンチャネルのリアルタイム活性化を調査する上で使用する改変並列プレートフローチャンバを記述することです。

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

変更された平行プレートフローチャンバーの使用は、研究者がせん断応力にメカノイ感受性イオンチャネルの機能的応答に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、リアルタイムの調査が容易に組み立てられた、再利用可能な平行プレート流れチャンバ内の活性化イオンチャネルを流すことができるということです。手順を開始するには、ピースCの長方形のスペースの端の周りにシリコーンエラストマー溶液の薄い層を適用し、長方形のカバーガラス、ピースDをエラストマー溶液に直接直接置き、余分なシリコーンエラストマー溶液を完全に覆います。次に、長方形カバーガラス、ピースFを、ピースEの底部に付着させる手順を繰り返し、シリコーンエラストマー溶液を室温で一晩硬化させる。次に、MPPフローチャンバーを、下のチャンバー、ピースE、ピースC、ピースB、上部にピースAで始まり、各ピースを前の上に順番に配置して組み立てます。次に、各ピースのネジ穴をコーナーに合わせ、MPPフローチャンバーへの流れを管理しながら漏れが発生するのを防ぐために、ピースをしっかりとねじ込みます。6ウェルプレートに、各ウェルに4〜5、12ミリメートルのカバーガラス円を配置します。単一の細胞が電気生理学的記録のためにアクセスできるように、10%と30%の間の細胞を保存します。続いて、標準的な培養条件下で細胞を2時間以上培養して細胞が接着できるようにし、24時間以内に内皮細胞が平らになり、24時間以上亜調合で播種するとパッチが困難になる。次に、接着した細胞を含むカバーガラスを6ウェルプレートのウェルから取り出し、PBSで素早くすすぐすすめます。次に、2ミリリットルの電気生理学的BAF溶液を含む35ミリメートルのペトリ皿に細胞を含むカバーガラスを移す。すぐにMPPフローチャンバーに細胞とカバーガラスを転送します。カバーガラスの円を長方形のカバーガラス、ピースDに移し、MPPフローチャンバーのピースCに付着します。カバーガラスの円とセルを完全に水没させるためにBAF溶液を追加します。続いて、カバーガラスの円をピースDに配置して、セルがピースBのスリット開口部に合わせるようにします。次に、適当な順序でピースをねじ込むことによりMPP流室を組み立てます。チャンバーを顕微鏡の段階に移し、すぐにBAFの解決器を浸透する。次に、実験のための暗い境界線と明白な核を持つ健康な細胞を特定します。赤面しているように見えるセルや、他のセルと接触しているセルは避けてください。せん断応力を制御するには、30ミリリットルの段階的なシリンジシリンダーをマイクロボアチューブを取り付けた3方向ルアーロックに接続して重力灌流システムを設定します。次に、両面テープを使用して電気生理学リグを囲むファラデーケージに卒業したシリンダーを取り付けます。MPPチャンバーにチューブを挿入する前に、シリンジとチューブをBAF溶液で事前に充填してください。次に、MPPフローチャンバーの入口穴にチューブを挿入し、MPPフローチャンバーを真空貯留槽内で除去するような溶液で充填する。チャンバーへの流れを止め、上のマークに卒業したシリンダーを補充します。所定のシリンジシリンダー高さでチャンバを流れ込んで、ストップウォッチを使用して流量を手動で計算します。シリンジを上げるか下げて流れを変え、この方程式を使用して平行なチャンバのせん断応力を計算します。必要なレベルのせん断応力が見つかるまで、このプロセスを繰り返します。続いて、接着された細胞を含む組み立てチャンバーを電気生理学リグの顕微鏡段階に移す。そして、BAF溶液で事前充填されたチューブをピースA.の穴に挿入し、チャンバーを満たし、同時に10ミリリットルのBAF溶液で細胞を洗います。目的のパッチ構成が正常に取得されたら、チャネル電流を室温で静浴槽で安定させます。電流が安定したらすぐに、段階的にせん断を適用し、せん断応力が増加する次のステップの前に増加電流が安定することを可能にする。チャンバーへの流れを止めることによって細胞へのせん断暴露を取り除き、メカノイセンシティブチャネル電流が静的浴中に観察されたベースライン電流に戻ることを可能にする。ここに示されているのは、顕著な線形外向きリーク電流を有する主マウス腸間膜内皮細胞からのKir電流の代表的な生の記録である。マイナス140~プラス40ミリボルトのランプが400ミリ秒以上のパッチに適用されました。リーク電流は、実際のKirチャネル活動の分析を防止します。リーク電流を差し引くには、まずリーク電流の線形勾配伝導率を計算します。生データにリーク電流をプロットする生トレース全体の対応する電圧による複数のG傾斜。ラインは、外側の線形リークを正確にオーバーレイする必要があります。次に、プロットされたリーク電流をトレース全体から差し引いて、ピコパラッド当たり直線的な外向き電流がピコアンパー約になるようにし、実際のKir電流を解析することができます。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、細胞が実験のためにアクセスできるように、カバーガラスをチャンバーに適切に配置することです。また、カバースリップがピースDに十分に付着していることを確認し、液体の流れが細胞を含むカバーガラスを破壊しないようにしてください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

別のマウス皮膚の領域から細胞蛍光分析のための単一細胞懸濁液の調製

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;スイマーとスマーマー細胞

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...