Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
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이 작품은 국립 심장에 의해 투자 되었다, 폐, 혈액 연구소 (R01 HL073965, 일리노이) 그리고 (T32 HL007829-24, ISF). 저자는 또한 우리의 최신 MPP 흐름 챔버를 생성하기위한 시카고 일리노이 대학의 과학 기계 가게를 인정하고 싶습니다.

우리의 연구에서 동물의 사용은 시카고 동물 관리위원회 (#16-183)에서 일리노이 대학에 의해 승인됩니다.
1. 수정 된 병렬 플레이트 흐름 챔버의 조립
참고: MPP 유동 챔버 조각 의 경우 표 1 및 그림 1을 참조하십시오. 어셈블리용 챔버 조각의 방향을 자세히 설명하는 도식은 그림 1을 참조?...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

혈관 계통은 지속적으로 활성 혈역학적 힘에 노출되어, 이는 메카노민성 이온 채널3,22를 활성화하지만 전단 스트레스 유발 메카노 트랜스덕션에서 이러한 채널의 생리적 역할은 단지 등장하기시작 4,6,8. 전단 응력 활성화 채널의 메카노민성을 담당하는 메커니즘은 아직 알려지지 ?...

혈류에 의해 생성되는 혈역학적 힘은 내피 및 혈관 기능1,2에서중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 여러 유형의 이온 채널이 전단 응력 3,4,5의 변화에 급격하게 반응하여 이온 채널이 1차 전단 응력 센서가 될 수 있다는 가설을 세우고 있는 것으로 잘 알려져 있다. 최근에는, 저희와 다른 사람들은 메카노민성 이온 채널이 전단 스트레스에 대한 혈관 활성 반응을 포함하여 여러전단 스트레스 에 민감한 혈관 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다 6,7,8 , 발달 혈관 신생9. 그러나 이온 채널의 전단 응력 감도 메커니즘은 거의 완전히 알려지지 않았습니다. 지식의 이 격차는 잘 정의된 전단 응력 하에서 전기 생리학적 기록을 수행하는 기술적 어려움 때문일 가능성이 높습니다. 이 문서에서는, 따라서, 우리는 이 목표를 달성하기 위하여 우리의 실험실에서일상적으로 수행되는 단계별 상세한 프로토콜6,7,10,11을제공합니다 .
이 방법의 전반적인 목표는 생리학적 범위에서 잘 정의된 전단 응력 하에서 이온 채널 메카노활성화의 실시간 조사를 허용하는 것이다. 이는 전기 생리학적 파이펫이 챔버내로 낮아질 수 있도록 표준 병렬 플레이트 유량 챔버를 수정함으로써 달성되며, 이를 달성하기 위한 독특한 접근법을 제공하는 동안 바닥 판상에서 성장된 접근 세포와 접근 셀을 목표6,7,11. 대조적으로, 이전 간행물에 기술된 표준 병렬 플레이트 유량 챔버는 전단력12 또는 기타 비침습적 접근법13,14에 노출된 세포의 실시간 이미징 분석을 위해 사용될 수 있지만, 그렇지 않은 경우 전기 생리학. 유사하게, 원뿔 및 플레이트 장치는, 전단 응력(15,16)에 세포를 노출시키기 위한 또 다른 강력한 접근법은 또한 전기생리학적 기록에 적합하지 않다. 따라서, 이러한 유동 장치는 이온 채널의 전단 응력 민감도의 조사를 허용하지 않는다. 흐름 하에서 전기 생리학적 기록을 수행하는 데 어려움은 이러한 중요한 효과를 담당하는 메커니즘에 대한 정보의 빈약성에 대한 주된 이유입니다.
동일한 목표를 달성하기 위한 대체 접근 법의 관점에서 정확하거나 제어되는 방법은 없습니다. 몇몇 이전 연구는17,18이상에서 세포의 부근에 가져온 다른 파이펫에서 오는 액체의 스트림에 세포를 노출시킴으로써 흐름의 밑에 이온 채널 활동을 기록하기 위하여 시도했습니다. 이것은 매우 비 생리적, 이러한 조건 하에서 생성 된 기계적 힘은 혈관에서 전단 스트레스의 생리적 프로필과 거의 공통점이 없기 때문에. 유사한 관심사는 열린 챔버의 관류에 의한 생리적 전단 응력 시뮬레이션 시도에 적용됩니다. 우리의 이전 연구 10에서자세히 설명한 바와 같이, 열린 액체 공기 인터페이스는 비 생리학적인 여러 장애 및 재순환을 만듭니다. 이러한 모든 문제를 해결하기 위해, 우리는 또한 우리의 이전 연구에서 "최소 침습 흐름 장치"라고 수정 병렬플레이트 (MPP) 흐름 챔버를 설계 6,7,10,11,만든 아크릴에서 광범위하게 우리의 실험실에서 사용. 그러나, 디자인의 원래 설명이 거의 20 년 전에 출판되었다는 사실에도 불구하고 잘 정의 된 전단 응력하에서 전기 생리학적 기록을 수행 할 수있는 유일한 흐름 장치입니다, 이 방법론은되지 않았습니다 다른 실험실에서 채택하고 흐름에서 전류를 기록하려고 시도하는 연구는 거의 없습니다. 따라서 MPP 유량챔버 사용에 대한 상세한 설명을 제공하는 것은 메카노민성 이온 채널 및 혈관 생물학에 관심이 있는 연구에 큰 도움이 될 것이라고 믿습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

유체 전단 응력은 내피 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 대부분의 혈관 침대에서, 혈류의 급성 증가에서 높은 전단 스트레스는 혈관 확장의 결과로 신호 캐스케이드를 트리거하여 혈관 벽에 기계적 스트레스를 완화. 전단 응력의 패턴은 또한 잘 친동맥질성인 전단 응력과 함께 동맥경화증의 발달에 중요한 요인으로 알려져 있다. 우리는 다양한 중간 세포 신호 경로의 상세한 이해가 있는 동안, 화학 매개체로 기계적인 자극을 첫째로 번역하는 수용체는 완전히 이해되지 않습니다. 메카노민성 이온 채널은 전단 및 조절 전단 유도 세포 신호에 대한 반응에 매우 중요하며, 이에 따라 혈관활성 매개체의 생산을 조절한다. 이러한 채널은 전단에 가장 초기 활성화 된 신호 성분 중 이며 산화 질소 생산을 촉진 을 통해 전단 유도 혈관 확장에 연결 되었습니다 (예를 들어, 안쪽으로 정류 K+ [Kir] 및 과도 수용 체 잠재력 [TRP] 채널) 및 내피 과분극 인자(예를 들어, Kir 및 칼슘 활성화 K+ [KCa] 채널) 및 압전 채널을 수반하는 결정되지 않은 메커니즘을 통해 전단 유도 혈관 수축. 이러한 채널이 전단력에 의해 활성화되는 생물 물리학 적 메커니즘을 이해 (즉, 직접 또는 기본 메카노 수용체를 통해) 내피 기능 장애와 관련된 병리 생리학을 해결하기 위해 잠재적 인 새로운 목표를 제공 할 수 그리고 아히로제네시스. 전기 생리학을 사용하여 실시간으로 이온 채널의 흐름 유도 활성화를 기록하는 것은 여전히 주요 과제입니다. 원뿔 및 플레이트 레오미터 및 폐쇄형 평행 플레이트 유량챔버와 같이 셀을 잘 정의된 전단 응력에 노출하는 표준 방법은 이온 채널 활성화에 대한 실시간 연구를 허용하지 않습니다. 이 프로토콜의 목표는 잘 정의된 전단 응력 하에서 메카노감응이성 이온 채널의 실시간 전기생리학적 기록을 허용하는 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것입니다.

현미경 스테이지(상부 패널)에서 MPP 유동 챔버의 상이한 뷰를 보여주는 여러 장의 사진과 MPP 유동 챔버(하단 패널)의 개략적 표현이 도1에 도시되어 있다. 회로도는 전체 장치 및 유량 챔버의 치수를 자세히 설명합니다. 도 2는 당사의 실험실(상부 패널)에서 MPP 유동 챔버에 대한 중력 관류 시스템의 사진을 나타낸다. 또한 유량 ?...

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Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

잘 정의된 전단 응력 하에서 단세포 이온 전류의 전기 생리학적 기록

이 프로토콜의 목적은 전단 응력에 의한 메카노민성 이온 채널의 실시간 활성화를 조사하는 데 사용하기 위해 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것이다.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

수정된 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용하면 연구원이 응모에 대한 메카노감이온 채널의 기능적 반응과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실시간 조사가 쉽게 조립되고 재사용 가능한 병렬 플레이트 흐름 챔버에서 활성화된 이온 채널을 플로우할 수 있다는 것입니다. 절차를 시작하려면, 조각 C의 직사각형 공간의 가장자리에 실리콘 탄성 탄성 용액의 얇은 층을 적용하고 부드럽게 사각형 커버 유리, 조각 D를 배치, 완전히 조각 C.의 열린 직사각형 공간을 커버하기 위해 여분의 실리콘 엘라스토머 용액을 닦아.그런 다음 직사각형 커버 유리, 조각 F를 조각 E의 바닥에 고수하는 절차를 반복하고 실리콘 탄성탄용액이 실온에서 하룻밤 동안 치료할 수 있도록 합니다. 이제 MPP 유량 챔버를 조합하여 각 조각을 이전 위에 순차적으로 배치하여 하단 챔버, 조각 E, 조각 C, 조각 B, 그리고 상단에 조각 A로 시작하십시오. 다음으로, 각 조각의 나사 구멍을 모서리에 정렬하고 MPP 흐름 챔버로의 흐름을 관리하면서 누출이 발생하지 않도록 조각을 단단히 나사로 고정합니다.6웰 플레이트에 4~5, 12mm 커버 유리 원을 각 웰에 놓습니다. 10%와 30%의 결합 사이의 세포를 저장하여 단일 세포가 전기 생리학적 기록에 접근할 수 있도록 합니다. 이어서, 내피 세포가 평평해지고 24시간 이상 감속시 종자시 패치가 어려워지기 때문에, 세포가 부착할 수 있도록 2시간 이상 표준 배양 조건하에서 세포를 배양한다.다음으로, 6웰 플레이트의 우물에서 부착된 세포를 함유한 커버 글래스를 제거하고 PBS에서 빠르게 헹구는다. 그런 다음, 세포로 커버 글래스를 전기 생리적 BAF 용액 의 2 밀리리터를 포함하는 35mm 페트리 접시로 옮는다. 즉시 MPP 흐름 챔버에 셀커버 글래스를 전송합니다.커버 글래스 원을 MPP 플로우 챔버의 C 조각에 부착된 직사각형 커버 글래스, 조각 D로 옮겨. BAF 솔루션을 추가하여 커버 유리 원과 셀을 완전히 침수합니다. 이어서, 커버 글래스 원을 조각 D에 배치하여 세포가 조각 B.의 슬릿 개구부와 일치하도록 하여 커버 유리 원이 플로우 애플리케이션에 의해 커버 글래스 원의 위치의 중단을 피하기 위해 용액 유리 접착을 통해 D 조각을 부착하도록 한다.그런 다음, 적절한 순서로 조각을 함께 나사로 하여 MPP 흐름 챔버를 조립한다. 챔버를 현미경 단계로 옮기고 즉시 BAF 용액으로 챔버를 인내합니다. 다음으로, 실험을 위한 어두운 테두리및 명백한 핵을 가진 건강한 세포를 확인합니다.흐릿하게 보이는 세포 나 다른 세포와 접촉하는 세포를 피하십시오. 전단 응력을 제어하려면 30 밀리리터 졸업 한 주사기 실린더를 마이크로 보어 튜브가 장착 된 3 방향 Luer 잠금 장치로 연결하여 중력 관류 시스템을 설정합니다. 다음으로, 양면 테이프를 사용하여 전기 생리학 장비를 둘러싼 패라데이 케이지에 졸업 된 실린더를 부착합니다.MPP 챔버에 튜브를 삽입하기 전에 BAF 용액으로 주사기 및 튜브를 미리 채웁니다. 이어서, 튜브를 MPP 플로우 챔버 입구 구멍에 삽입하여 MPP 흐름 챔버를 용액으로 미리 채우므로 진공 저장소에서 제거된다. 챔버로의 흐름을 멈추고 졸업한 실린더를 맨 위 마크로 다시 채웁니다.주어진 주사기 실린더 높이에서 챔버를 통해 솔루션이 흐르도록 하여 스톱워치를 사용하여 수동으로 유량을 계산합니다. 주사기를 들어 올리거나 낮게 하여 흐름을 변경하고 이 방정식을 사용하여 병렬 챔버에서 전단 응을 계산합니다. 원하는 수준의 전단 응력이 발견될 때까지 이 과정을 반복합니다.이어서, 부착된 세포를 포함하는 조립된 챔버를 전기생리학 장비의 현미경 단계로 이송한다. 그리고 BAF 용액으로 미리 채워진 튜브를 A.Then 의 구멍에 삽입하고 챔버를 채우고 BAF 용액 10 밀리리터로 세포를 동시에 세척합니다. 원하는 패치 구성이 성공적으로 완료되면 실온에서 정적 욕조에서 채널 전류가 안정화되도록 합니다.전류가 안정화되는 즉시 전단을 단계별 방식으로 적용하여 다음 단계의 전단 응력 증가 이전에 증가된 전류가 안정화될 수 있도록 합니다. 챔버로의 흐름을 중지하여 세포에 대한 전단 노출을 제거하여, 메카노감감성 채널 전류가 정적 욕조에서 관찰된 기준선 전류로 돌아갈 수 있도록 합니다. 여기에 표시된 키르 전류의 대표적인 원시 기록은 주목할 만한 선형 외측 누설 전류를 가진 1차 마우스 막심 내피 세포로부터의 대표적인 원시 기록이다.400밀리초 이상 패치에 음수 140~40밀리볼트의 램프가 적용되었습니다. 누출 전류는 실제 Kir 채널 활동의 분석을 방지합니다. 누출 전류를 빼려면 먼저 누수 전류의 선형 경사 전도도를 계산합니다.원시 데이터의 누출 전류를 플롯하기 위해 전체 원시 추적의 해당 전압에 의해 여러 G 경사. 선은 바깥쪽 선형 누설을 정확하게 오버레이해야 합니다. 그런 다음, 전체 추적에서 플롯된 누설 전류를 빼서 선형 바깥쪽 전류가 피코파라드당 피코아페레가 0에 약하며 실제 커전류를 분석할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 세포가 실험에 접근할 수 있도록 챔버에 덮개 유리를 올바르게 배치하는 것입니다. 또한, 커버 슬립이 조각 D에 적절하게 부착되어 있는지 확인하여 유체 흐름이 세포를 포함하는 커버 유리를 방해하지 않도록 하십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...