Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do coração, pulmão e sangue (R01 HL073965, IL) e (T32 HL007829-24, ISF). Os autores também gostariam de reconhecer a oficina de máquinas científicas na Universidade de Illinois, em Chicago, por gerar nossas mais recentes câmaras de fluxo MPP.

O uso de animais em nossos estudos é aprovado pela Universidade de Illinois no Comitê de cuidados de animais de Chicago (#16-183).
1. montagem da câmara de fluxo de placa paralela modificada
Nota: Refira por favor a tabela 1 e a Figura 1 para IDs da parte da câmara de fluxo MPP. Por favor, consulte a Figura 1 para um esquemático detalhando a orientação de peças de câ...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

O sistema vascular está constantemente exposto a forças hemodinâmicas ativas, que ativam os canais deíons mecanosensíveis,22 mas os papéis fisiológicos desses canais na mecanotransdução induzida por estresse de cisalhamento são apenas começando a emergir4,6,8. Os mecanismos responsáveis pela mecanosensibilidade dos canais ativados por estresse de cisalhamento...

As forças hemodinâmicas geradas pelo fluxo sanguíneo são bem conhecidas por desempenhar papéis importantes na função endotelial e vascular1,2. É sabido igualmente que diversos tipos de canaletas do íon respondem agudamente às mudanças no esforço de tesoura3,4,5 que conduzem à hipótese que os canais de íon podem ser sensores preliminares do esforço de tesoura. Mais recentemente, nós e outros mostramos que os canais iônicos mecanosensíveis desempenham papéis críticos em várias funções vasculares sensíveis ao cisalhamento-stress, incluindo a resposta vasoativa ao estresse de cisalhamento6,7,8 e angiogênese do desenvolvimento9. Os mecanismos da sensibilidade do cisalhamento-stress de canaletas do íon, entretanto, são quase totalmente desconhecidos. Esta lacuna de conhecimento é susceptível de ser devido à dificuldade técnica de realizar gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido. Neste artigo, portanto, fornecemos um protocolo detalhado passo a passo rotineiramente realizado em nosso laboratório para atingir esse objetivo6,7,10,11.
O objetivo geral deste método é permitir a investigação em tempo real da mecanoativação do canal iônico estresse de cisalhamento bem definido na faixa fisiológica. Isto é conseguido modificando uma câmara paralela padrão do fluxo da placa para permitir que uma pipeta eletrofisiológicos seja abaixada na câmara e as pilhas do acesso crescidas na placa inferior durante a exposição do tempo real ao fluxo, fornecendo uma aproximação original para conseguir este objetivo6,7,11. Em contrapartida, as câmaras de fluxo de placas paralelas padrão, descritas em publicações anteriores, podem ser utilizadas para a análise de imagens em tempo real de células expostas a forças de cisalhamento12 ou outras abordagens não invasivas13,14, mas não para Eletrofisiologia. Similarmente, o cone e o instrumento da placa, uma outra aproximação poderosa para expor pilhas ao esforço de cisalhamento15,16 não são igualmente apropriados para gravações electrofisiológicas. Assim, estes dispositivos de fluxo não permitem a investigação da sensibilidade de tensão de cisalhamento de canais iônicos. A dificuldade em realizar gravações eletrofisiológicas fluxo é a principal razão para a escassez de informações sobre os mecanismos responsáveis por esses efeitos cruciais.
Em termos das abordagens alternativas para atingir o mesmo objetivo, não há nenhum que são tão precisos ou controlados. Alguns estudos anteriores tentaram registrar a atividade do canal iônico fluxo, expondo as células a um fluxo de líquido proveniente de outra pipeta trazida para a vizinhança de uma célula de acima de17,18. Isto é altamente não-fisiológico, como as forças mecânicas geradas nestas condições têm pouco em comum com os perfis fisiológicos de tensão de cisalhamento nos vasos sanguíneos. As preocupações similares aplicam-se às tentativas de simular o stress fisiológico da tesoura pela perfusão de câmaras abertas. Como discutido em detalhe em nosso estudo mais adiantado10, uma relação aberta do líquido-ar cria distúrbios e recirculação múltiplos, que são não-physiological. Para endereçar todas estas preocupações, nós projetamos uma câmara paralela modificada do fluxo da placa (MPP), igualmente referida como o "dispositivo minimamente invasor do fluxo" em nossos estudos mais adiantados6,7,10,11, feitos de acrílico e amplamente utilizado em nosso laboratório. No entanto, apesar do fato de que a descrição original do projeto foi publicada há quase 20 anos e é o único dispositivo de fluxo que permite a realização de gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido, esta metodologia não foi adotados por outros laboratórios e há poucos estudos que tentam registrar correntes fluxo. Acreditamos, portanto, que fornecer uma descrição detalhada para o uso da câmara de fluxo MPP será de grande ajuda para pesquisas que estão interessadas em canais iônicos mecanosensíveis e biologia vascular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

O stress de cisalhamento fluido é bem conhecido por desempenhar um papel importante na função endotelial. Na maioria das camas vasculares, o estresse de cisalhamento elevado de aumentos agudos no fluxo sanguíneo desencadeia uma cascata de sinalização resultando em vasodilatação, aliviando assim o estresse mecânico na parede vascular. O padrão de estresse de cisalhamento também é bem conhecido por ser um fator crítico no desenvolvimento da aterosclerose com estresse de cisalhamento laminar sendo aterogênico e perturbado o estresse de cisalhamento sendo pró-aterogénico. Quando nós tivermos uma compreensão detalhada das várias vias intermediárias da sinalização da pilha, os receptores que traduzem primeiramente o estímulo mecânico em mediadores químicos não são compreendidos completamente. Os canais de íons mecanosensíveis são fundamentais para a resposta ao cisalhamento e regulam a sinalização celular induzida por cisalhamento, controlando assim a produção de mediadores vasoativos. Esses canais estão entre os primeiros componentes de sinalização ativados para cisalhamento e foram vinculados à vasodilatação induzida por cisalhamento por meio da promoção da produção de óxido nítrico (por exemplo, retificando internamente K+ [Kir] e potencial de receptor transitório [TRP] canais) e fator de hiperpolarização do endotélio (por exemplo, canais Kir e K+ [KCA] ativados por cálcio) e vasoconstrição induzida por cisalhamento por meio de um mecanismo indeterminado que envolve canais piezo. Compreender o mecanismo biofísico pelo qual esses canais são ativados por forças de cisalhamento (ou seja, diretamente ou através de um Mecano-receptor primário) poderia fornecer potenciais novos alvos para resolver a fisiopatologia associada à disfunção endotelial e aterogênese. Ainda é um grande desafio para registrar a ativação induzida por fluxo de canais iônicos em tempo real usando eletrofisiologia. Os métodos padrão para expor as células à tensão de cisalhamento bem definida, como o Reômetro de cone e placa e a câmara de fluxo de placa paralela fechada, não permitem o estudo em tempo real da ativação do canal iônico. O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada que permita a gravação eletrofisiológica em tempo real de canais de íons mecanosensíveis estresse de cisalhamento bem definido.

Várias fotografias que mostram diferentes pontos de vista da câmara de fluxo MPP no estágio do microscópio (painel superior) e uma representação esquemática da câmara de fluxo MPP (painel inferior) são mostradas na Figura 1. O esquemático detalha as dimensões de todo o dispositivo e a câmara de fluxo. A Figura 2 mostra uma fotografia do sistema de perfusão por gravidade para a câmara de fluxo MPP em nosso laboratór...

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Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Gravações electrofisiológicas de correntes do íon da único-pilha o esforço de tesoura bem definido

O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada para uso na investigação da ativação em tempo real de canais de íons mecanosensíveis por tensão de cisalhamento.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

O uso da câmara de fluxo de placas paralelas modificadas pode ajudar os pesquisadores a responder a perguntas-chave relativas à resposta funcional dos canais de íons mecanosensíveis ao estresse de cisalhamento. A principal vantagem desta técnica é que ela permite que a investigação em tempo real flua canais de íons ativados em uma câmara de fluxo de placa paralela facilmente montada e reutilizável. Para iniciar o procedimento, aplique uma fina camada de solução de elastômero de silicone ao redor das bordas do espaço retangular da peça C, e coloque suavemente o vidro de tampa retangular, peça D, diretamente na solução elastômero para cobrir completamente o espaço retangular aberto da peça C.Limpe cuidadosamente o excesso de solução de elastômero de silicone.Em seguida, repita o procedimento para adricar o vidro de tampa retangular, peça F, até o fundo da peça E e permitir que a solução de elastômero de silicone cure durante a noite à temperatura ambiente. Agora, monte a câmara de fluxo MPP colocando sequencialmente cada peça em cima da anterior, começando com a câmara inferior, peça E, em seguida, peça C, peça B, seguida pela peça A na parte superior. Em seguida, alinhe os orifícios de parafuso de cada peça nas curvas e aparasse firmemente as peças para evitar que vazamentos ocorram enquanto administram o fluxo para a câmara de fluxo MPP.Em uma placa de seis poços, coloque quatro a cinco, 12 milímetros de vidro de cobertura em cada poço. Salve as células entre 10% e 30% de confluência, de tal forma que células únicas possam ser acessadas para gravações eletrofisiológicas. Posteriormente, incubar as células em condições de cultura padrão por pelo menos duas horas para permitir que as células aderam, e não mais do que 24 horas, pois as células endoteliais se tornarão planas e difíceis de remendar quando semeadas em subconfluência por mais de 24 horas.Em seguida, remova um vidro de cobertura contendo as células aderidas de um poço da placa de seis poços e enxágue rapidamente em PBS. Em seguida, transfira o vidro de cobertura com células para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução eletrofisiológica BAF. Transfira imediatamente o vidro de cobertura com células para a câmara de fluxo MPP.Transfira o círculo de vidro de cobertura para o vidro de cobertura retangular, peça D, que é aderido à peça C da câmara de fluxo MPP. Adicione a solução BAF para submergir completamente o círculo de vidro de cobertura e as células. Posteriormente, posicione o círculo de vidro de cobertura na peça D de tal forma que as células estejam alinhadas com as aberturas de fenda da peça B.Certifique-se de que o círculo de vidro de cobertura adere à peça D através da solução de aderência de vidro para evitar a interrupção da posição do círculo de vidro de cobertura pela aplicação de fluxo.Em seguida, monte a câmara de fluxo MPP aparafusando as peças na ordem apropriada. Transfira a câmara para o estágio do microscópio e perfunda imediatamente a câmara com a solução BAF. Em seguida, identifique uma célula saudável com uma borda escura e núcleo óbvio para o experimento.Evite células que parecem estar fazendo blubbing ou células que estejam em contato com outras células. Para controlar o estresse da cisalhamento, configure um sistema de perfusão de gravidade conectando um cilindro de seringa graduado de 30 mililitros a uma trava Luer de três vias equipada com tubos de microbore. Em seguida, conecte o cilindro graduado à gaiola de Faraday em torno da plataforma de eletrofisiologia usando fita dupla face.Antes de inserir a tubulação na câmara MPP, preencha a seringa e tubos com solução BAF. Em seguida, insira a tubulação no orifício de entrada da câmara de fluxo MPP da peça A.Preencha a câmara de fluxo MPP com solução, de tal forma que ela esteja sendo removida no reservatório de vácuo. Pare o fluxo para a câmara e recarrete o cilindro graduado até a marca máxima.Calcule a taxa de fluxo manualmente usando um cronômetro permitindo que a solução flua através da câmara a uma determinada altura do cilindro de seringa. Levante ou baixe a seringa para alterar o fluxo e calcular o estresse da cisalhamento em uma câmara paralela usando esta equação. Repita este processo até encontrar um nível desejado de estresse de tesoura.Posteriormente, transfira uma câmara montada contendo células aderidas para o estágio do microscópio da plataforma de eletrofisiologia. E insira a tubulação, pré-preenchida com solução BAF, no orifício da peça A.Então, encha a câmara e lave as células com 10 mililitros de solução BAF, simultaneamente. Uma vez que a configuração de patch desejada seja obtida com sucesso, permita que as correntes do canal se estabilizem em um banho estático à temperatura ambiente.Assim que as correntes se estabilizarem, aplique a tesoura de forma escalada, permitindo que a corrente aumentada se estabilize antes do próximo passo do aumento do estresse da tesoura. Remova a exposição da cisalhamento às células parando o fluxo para a câmara, permitindo que as correntes de canais mecanosensíveis retornem às correntes de base observadas no banho estático. Mostrado aqui é uma gravação bruta representativa da corrente Kir de uma célula mesentórica endotelial do rato primário com notável corrente de vazamento linear para fora.Uma rampa de 140 negativos para 40 mililitros positivos foi aplicada no patch acima de 400 milissegundos. A corrente de vazamento impede a análise da atividade real do canal Kir. Para subtrair a corrente de vazamento, primeiro calcule a condutância linear da corrente de vazamento.Inclinação G múltipla por tensões correspondentes de todo o traço bruto para traçar a corrente de vazamento nos dados brutos. A linha deve sobrepor exatamente o vazamento linear externo. Em seguida, subtraia a corrente de vazamento plotada de todo o traço para que a corrente externa linear seja cerca de zero picoamperes por picofarad, e a corrente Kir real pode ser analisada.A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é posicionar corretamente o vidro de cobertura na câmara para que as células sejam acessíveis para experimentos. Além disso, certifique-se de que o deslizamento da tampa está adequadamente aderido à peça D, de tal forma que o fluxo de fluido não interrompa o vidro de cobertura contendo células.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Indução de diferenciação celular e imagens de células<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer e Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...