Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным институтом сердца, легких и крови (R01 HL073965, IL) и (T32 HL007829-24, ISF). Авторы также хотели бы отметить, Научная машина магазин в Университете Иллинойса в Чикаго для генерации наших последних MPP потока камер.

Использование животных в наших исследованиях одобрено Университетом Иллинойса в Чикагском комитете по уходу за животными (#16-183).
1. Сборка модифицированной параллельной плитной камеры потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 ...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

Сосудистая система постоянно подвергается воздействию активных гемодинамических сил, которые активируют механочувствительные ионные каналы3,22, но физиологические роли этих каналов в сдвига стресс-индуцированной механотрансдукции только начинают поя...

Гемодинамические силы, генерируемые кровотоком, хорошо известны, играют важную роль в эндотелиальной и сосудистой функции1,2. Также хорошо известно, что несколько типов ионных каналовостро реагируют на изменения в стрессе сдвига 3,4,5, что приводит к гипотезе, что ионные каналы могут быть первичными датчиками стресса сдвига. Совсем недавно мы и другие показали, что механочувствительные ионные каналы играют важную роль в нескольких сдвига стресса чувствительных сосудистых функций, в том числе вазоактивной реакции на сдвига стресс6,7,8 , и развития ангиогенез9. Механизмы чувствительности сдвига-стресса ионных каналов, однако, почти полностью неизвестны. Этот пробел в знаниях, вероятно, объясняется технической сложностью выполнения электрофизиологических записей при четко определенном стрессе сдвига. В этой статье, таким образом, мы предоставляем шаг за шагом подробныйпротокол обычно выполняется в нашей лаборатории для достижения этой цели 6,7,10,11.
Общая цель этого метода заключается в том, чтобы в режиме реального времени исследование ионного канала механоактивации под четко определенным напряжением сдвига в физиологическом диапазоне. Это достигается путем изменения стандартной параллельной камеры потока пластины, чтобы электрофизиологические пипетки, которые будут опущены в камеру и доступа клеток, выращенных на нижней пластине в режиме реального времени воздействия потока, обеспечивая уникальный подход для достижения этой цели цель6,7,11. В отличие от стандартных параллельных камер потока пластин, описанных в предыдущих публикациях может быть использован для анализа изображений в режиме реального времени клеток, подверженных сдвига сил12 или других неинвазивных подходов13,14, но не для Электрофизиологии. Аналогичным образом, конус и пластины аппарата, другой мощный подход подвергать клетки сдвига стресс15,16 также не подходит для электрофизиологических записей. Таким образом, эти устройства потока не позволяют исследуемую чувствительность напряжения сдвига ионных каналов. Трудность в выполнении электрофизиологических записей под потоком является основной причиной скудности информации о механизмах, ответственных за эти решающие эффекты.
С точки зрения альтернативных подходов к достижению той же цели, нет ни одного, кто был бы столь точным или контролируемым. Некоторые более предыдущие изучения попытались зафиксировать деятельность канала иона под потоком путем подвергать действию клетки к потоку жидкости приходя от другого pipette принесенных к vicinity клетки от выше17,18. Это очень нефизиологическое, так как механические силы, генерируемые в этих условиях, имеют мало общего с физиологическими профилями сдвига стресса в кровеносных сосудах. Аналогичные опасения относятся к попыткам имитировать физиологический стресс сдвига путем перфузии открытых камер. Как подробно описано в нашем предыдущем исследовании10, открытый жидко-воздушный интерфейс создает многочисленные нарушения и рециркуляции, которые являются нефизиологическими. Для решения всех этих проблем, мы разработали модифицированную параллельную пластину (MPP) системы подачи, также именуемую "минимально инвазивным устройством потока" в наших предыдущих исследованиях6,7,10,11, от акрила и широко используется в нашей лаборатории. Однако, несмотря на то, что оригинальное описание дизайна было опубликовано почти 20 лет назад и является единственным устройством потока, которое позволяет выполнять электрофизиологические записи под четко определенным напряжением сдвига, эта методология не была принятые другими лабораториями и Есть только очень мало исследований, которые пытаются зафиксировать токи под потоком. Поэтому мы считаем, что предоставление подробного описания для использования камеры потока MPP будет большим подспорьем для исследований, которые заинтересованы в механочувствительных ионных каналов и сосудистой биологии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Стресс сдвига жидкости, как известно, играют важную роль в эндотелиальной функции. В большинстве сосудистых кроватей повышенный сдвига стресс от острого увеличения кровотока вызывает сигнальный каскад, приводящий к вазодилатации, тем самым облегчая механическую нагрузку на сосудистую стенку. Структура сдвига стресс также хорошо известно, является критическим фактором в развитии атеросклероза с ламинар сдвига стресс время атеропротектор и нарушенных сдвига стресс про-атерогенных. Хотя у нас есть детальное понимание различных промежуточных клеточных сигнальных путей, рецепторы, которые сначала переводят механический стимул в химических посредников, полностью не поняты. Механочувствительные ионные каналы имеют решающее значение для реагирования на сдвига и регулируют сигнализирующую ячейку, вызывающую таким образом производство вазоактивных посредников. Эти каналы являются одними из самых ранних активированных сигнальных компонентов для сдвига и были связаны с сдвига индуцированной вазодилатации путем поощрения производства оксида азота (например, внутренне выправляя Kи Кира и переходный потенциал рецепторов »TRP» каналы) и эндотелия гиперполяризующий фактор (например, Кир и кальций активированный K »KCa» каналов) и сдвига индуцированного сосудосуживаемого через неопределенный механизм, который включает в себя пьезо каналов. Понимание биофизического механизма, с помощью которого эти каналы активируются силами сдвига (т.е. непосредственно или через первичный механо-рецептор) может обеспечить потенциальные новые цели для решения патофизиологии, связанной с эндотелиальной дисфункцией и атерогенез. По-прежнему существует серьезная проблема для записи потокиндуированной активации ионных каналов в режиме реального времени с помощью электрофизиологии. Стандартные методы, позволяющие подвергнуть клетки четко определенному стрессу сдвига, таким как конус и реометр пластин и замкнутая камера потока параллельной пластины, не позволяют в режиме реального времени изучать активацию ионного канала. Целью этого протокола является описание модифицированной параллельной камеры потока пластины, которая позволяет в режиме реального времени электрофизиологической записи механочувствительных ионных каналов под четко определенным напряжением сдвига.

Несколько фотографий, показывающих различные виды камеры потока MPP на стадии микроскопа (верхняя панель) и схематическое представление камеры потока MPP (нижняя панель) показаны на рисунке 1. Схема тикатизирует размеры всего устройства и камеры потока. <s...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Электрофизиологические записи одноклеточных ионных токов под четко определенным сдвигами

Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы описать модифицированную камеру потока параллельных пластин для использования в исследовании активации в реальном времени механочувствительных ионных каналов сдвигами.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Использование модифицированной параллельной камеры потока пластин может помочь исследователям ответить на ключевые вопросы, относящиеся к функциональной реакции механочувствительных ионных каналов на стресс стрижки. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет в режиме реального времени исследования потока активированных ионных каналов в легко собранной, многоразовой параллельной камеры потока пластины. Чтобы начать процедуру, нанесите тонкий слой силиконового еластомного раствора по краям прямоугольного пространства части С и аккуратно поместите прямоугольное стекло крышки, кусок D, прямо на раствор еластомера, чтобы полностью покрыть открытое прямоугольное пространство куска C.Carefully стереть излишки силиконового еластомного раствора.Затем повторите процедуру прилипния прямоугольного стекла крышки, кусок F, к нижней части E и позвольте силиконовой еластомер решение вылечить на ночь при комнатной температуре. Теперь, собрать MPP поток камеры последовательно размещения каждого куска на вершине предыдущего, начиная с нижней камеры, кусок E, а затем кусок C, кусок B, а затем кусок А на вершине. Далее, выровнять винт отверстия каждого куска по углам и плотно винт куски вместе, чтобы предотвратить утечки происходят при администрировании потока в камеру потока MPP.В шесть-хорошо пластины, место от четырех до пяти, 12 миллиметров покрытия стеклянные круги в каждом хорошо. Сохранить клетки между 10%и 30% слияния, так что одиночные клетки могут быть доступны для электрофизиологических записей. Впоследствии инкубировать клетки в стандартных условиях культуры в течение не менее двух часов, чтобы клетки придерживаться, и не более 24 часов, как эндотелиальные клетки станут плоскими и трудно патч, когда посеяны в субвлияние в течение более 24 часов.Затем снимите стекло крышки, содержащее прилипаемые клетки, из колодец из шести хорошо пластины и быстро промыть в PBS. Затем перенесите крышку стекла с клетками на 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитров электрофизиологического раствора BAF. Немедленно перенесите крышку стекла с ячейками в камеру потока MPP.Перенесите круг крышки стекла на прямоугольное стекло крышки, кусок D, который придерживается части C камеры потока MPP. Добавьте раствор BAF, чтобы полностью погрузить круг крышки стекла и клетки. Впоследствии, положение крышки стеклянный круг на кусок D так, что клетки будут в соответствии с щели отверстия части B.Убедитесь, что крышка стеклянный круг придерживается кусок D через решение стеклянной адгезии, чтобы избежать нарушения положения крышки стекла круг потока приложения.Затем соберите камеру потока MPP, завинчивая части вместе в соответствующем порядке. Перенесите камеру на стадию микроскопа и немедленно пронизать камеру раствором BAF. Затем определите здоровую клетку с темной границей и очевидным ядром для эксперимента.Избегайте клеток, которые, как представляется, blubbing или клетки, которые находятся в контакте с другими клетками. Чтобы контролировать стресс от стрижки, создать систему гравитации перфузии, подключив 30 миллилитров закончил шприц цилиндр в трехмерный замок Luer оснащен микробортных труб. Затем прикрепите градуированный цилиндр к клетке Фарадея, окружающей электрофизиологическую установку, используя двустороннюю ленту.Перед вставкой трубки в камеру MPP предварительно заполните шприц и трубки раствором BAF. Затем вставьте трубки в отверстие камеры потока MPP части A.Pre-заполнить камеру потока MPP с раствором, таким образом, что он удаляется в вакуумном резервуаре. Остановите поток в камеру и пополнить градуированный цилиндр до верхней отметки.Рассчитайте скорость потока вручную с помощью секундомера, позволяя раствору протекать через камеру на данной высоте цилиндра шприца. Поднимите или опустите шприц, чтобы изменить поток и рассчитать стресс стрижки в параллельной камере, используя это уравнение. Повторите этот процесс до тех пор, пока не будет обнаружен желаемый уровень стресса, связанный с стрижкой.Впоследствии перенесите собранную камеру, содержащую прилипаемые клетки, на микроскопную стадию электрофизиологической установки. И вставьте трубки, предварительно заполненные раствором BAF, в отверстие кусок A.Then, заполнить камеру и мыть клетки с 10 миллилитров раствора BAF, одновременно. После того, как желаемая конфигурация патча будет успешно получена, позвольте течением канала стабилизироваться в статической ванне при комнатной температуре.Как только течения стабилизировались, применять стрижку в шаг-мудрый моды, что позволяет увеличение тока стабилизировать до следующего шага увеличения стресса стрижки. Удалите воздействие сдвига на клетки, остановив поток в камеру, позволяя механочувствительным течениям каналов вернуться к базовым течениям, наблюдаемым в статической ванне. Здесь показана репрезентативная необработанную запись кирового тока из первичной мезентерической эндотелиальной клетки мыши с заметным линейным внешним током утечки.Пандус отрицательных 140 до положительных 40 милливольт был применен к патчу более 400 миллисекунд. Ток утечки предотвращает анализ реальной активности канала Kir. Чтобы вычесть ток утечки, сначала вычислите линейную проводимость наклона тока утечки.Множественный наклон G соответствующими напряжениями всего необработавого следа для построения тока утечки на необработанных данных. Линия должна наложить наружную линейную утечку точно. Затем вычесть построенный ток утечки из всего следа так, что линейный внешний ток составляет около нуля пикоамперов на пикофарад, и реальный ток Кира может быть проанализирован.Самое главное помнить при попытке этой процедуры, чтобы правильно распоставить крышку стекла в камеру, так что клетки доступны для экспериментов. Кроме того, убедитесь, что крышка скольжения адекватно придерживается кусок D, так что поток жидкости не нарушает крышку стекла, содержащего клетки.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Единичных измерений Сотовые вакуолярных разрыв под действием внутриклеточных патогенов

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Получение одноклеточные подвесок для Cytofluorimetric анализа из различных регионов мышиной кожи

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Плоттеры и богомольцы

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...