Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (R01 HL073965, IL) y (T32 HL007829-24, ISF). Los autores también quieren reconocer a la Tienda de Máquinas Científicas de la Universidad de Illinois en Chicago por generar nuestras últimas cámaras de flujo MPP.

El uso de animales en nuestros estudios está aprobado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Illinois en Chicago (#16-183).
1. Montaje de la Cámara de Flujo de Placas Paralelas Modificadas
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Figura 1 para los iDE de piezas de cámara de flujo MPP. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema que detalla la orientación de las piez...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

El sistema vascular está constantemente expuesto a fuerzas hemodinámicas activas, que activan los canales iónicos mecanosensibles3,22, pero las funciones fisiológicas de estos canales en la mecanotransducción inducida por el estrés de cizallamiento es sólo empezando a emerger4,6,8. Los mecanismos responsables de la mecanosensibilidad de los canales activados por t...

Las fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo son bien conocidas por desempeñar un papel importante en la función endotelial y vascular1,2. También es bien sabido que varios tipos de canales iónicos responden agudamente a los cambios en la tensión de cizallamiento3,4,5 lo que lleva a la hipótesis de que los canales iónicos pueden ser sensores de tensión de cizallamiento primarios. Más recientemente, nosotros y otros mostramos que los canales iónicos mecanosensitive desempeñan un papel crítico en varias funciones vasculares sensibles al estrés de cizallamiento, incluyendo la respuesta vasoactiva a la tensión de cizallamiento6,7,8 , y la angiogénesis del desarrollo9. Los mecanismos de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos, sin embargo, son casi totalmente desconocidos. Es probable que esta brecha de conocimiento se deba a la dificultad técnica de realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión cortante bien definida. En este artículo, por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado paso a paso realizado rutinariamente en nuestro laboratorio para lograr este objetivo6,7,10,11.
El objetivo general de este método es permitir la investigación en tiempo real de la mecanoactivación del canal iónico bajo tensión de cizallamiento bien definida en el rango fisiológico. Esto se logra modificando una cámara de flujo de placa paralela estándar para permitir que una pipeta electrofisiológica se baje en la cámara y las células de acceso cultivadas en la placa inferior durante la exposición en tiempo real al flujo, proporcionando un enfoque único para lograr esto meta6,7,11. Por el contrario, las cámaras de flujo de placas paralelas estándar, descritas en publicaciones anteriores, se pueden utilizar para el análisis de imágenes en tiempo real de células expuestas a fuerzas de cizallamiento12 u otros enfoques no invasivos13,14, pero no para Electrofisiología. Del mismo modo, el aparato de cono y placa, otro enfoque poderoso para exponer las células a la tensión de cizallamiento15,16 tampoco es adecuado para grabaciones electrofisiológicas. Por lo tanto, estos dispositivos de flujo no permiten la investigación de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos. La dificultad para realizar grabaciones electrofisiológicas bajo flujo es la razón principal de la escasez de información sobre los mecanismos responsables de estos efectos cruciales.
En cuanto a los enfoques alternativos para lograr el mismo objetivo, no hay ninguno que sea tan preciso o controlado. Algunos estudios anteriores intentaron registrar la actividad del canal iónico bajo flujo exponiendo las células a una corriente de líquido procedente de otra pipeta traída a las proximidades de una célula desde más de17,18. Esto es altamente no fisiológico, ya que las fuerzas mecánicas generadas en estas condiciones tienen poco en común con los perfiles fisiológicos de tensión cortante en los vasos sanguíneos. Preocupaciones similares se aplican a los intentos de simular la tensión de cizallamiento fisiológica por perfusión de cámaras abiertas. Como se discutió en detalle en nuestro estudio anterior10, una interfaz de aire líquido abierto crea múltiples perturbaciones y recirculación, que no son fisiológicas. Para abordar todas estas preocupaciones, hemos diseñado una cámara de flujo de placa paralela modificada (MPP), también conocida como el "dispositivo de flujo mínimamente invasivo" en nuestros estudios anteriores6,7,10,11, hecho de acrílico y ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. Sin embargo, a pesar de que la descripción original del diseño se ha publicado hace casi 20 años y es el único dispositivo de flujo que permite realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión de cizallamiento bien definida, esta metodología no ha sido adoptados por otros laboratorios y sólo hay muy pocos estudios que intenten registrar corrientes bajo flujo. Creemos, por lo tanto, que proporcionar una descripción detallada para el uso de la cámara de flujo MPP será de gran ayuda para las investigaciones que están interesadas en canales iónicos mecanosensitive y biología vascular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Se sabe que la tensión de cizallamiento fluido desempeña un papel importante en la función endotelial. En la mayoría de los lechos vasculares, el estrés de cizallamiento elevado por aumentos agudos en el flujo sanguíneo desencadena una cascada de señalización que resulta en vasodilatación, aliviando así el estrés mecánico en la pared vascular. El patrón de estrés por cizallamiento también es bien conocido por ser un factor crítico en el desarrollo de la aterosclerosis con el estrés de cizallamiento laminar siendo ateroprotector y perturbado estrés de cizallamiento siendo pro-aterogénico. Si bien tenemos una comprensión detallada de las diversas vías de señalización de células intermedias, los receptores que primero traducen el estímulo mecánico en mediadores químicos no se entienden completamente. Los canales iónicos sensibles al mecano sensible son críticos para la respuesta a la cizalladura y regulan la señalización celular inducida por cizallamiento, controlando así la producción de mediadores vasoactivos. Estos canales se encuentran entre los primeros componentes de señalización activados para cortar y se han relacionado con vasodilatación inducida por cizallamiento mediante la promoción de la producción de óxido nítrico (por ejemplo, rectificación interna de K+ [Kir] y potencial de receptor transitorio [TRP] (p. ej., canales K+ [KCa] activados por Kir y calcio) y vasoconstricción inducida por cizallamiento a través de un mecanismo indeterminado que implica canales piezoeléctricos. Comprender el mecanismo biofísico por el cual estos canales son activados por fuerzas cortantes (es decir, directamente o a través de un receptor mecano primario) podría proporcionar posibles nuevos objetivos para resolver la fisiopatología asociada con la disfunción endotelial y la atrogénesis. Sigue siendo un desafío importante para registrar la activación inducida por el flujo de canales iónicos en tiempo real utilizando la electrofisiología. Los métodos estándar para exponer las células a tensión de cizallamiento bien definida, como el reómetro de cono y placa y la cámara de flujo de placa paralela cerrada no permiten el estudio en tiempo real de la activación del canal iónico. El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada que permite el registro electrofisiológico en tiempo real de canales iónicos sensibles a la tensión de cizallamiento bien definido.

En la Figura 1se muestran varias fotografías que muestran diferentes vistas de la cámara de flujo MPP en la etapa del microscopio (panel superior) y una representación esquemática de la cámara de flujo MPP (panel inferior). El esquema detalla las dimensiones de todo el dispositivo y la cámara de flujo. La Figura 2 muestra una fotografía del sistema de perfusión por gravedad a la cámara de flujo MPP en nuestro laboratorio...

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Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Grabaciones electrofisiológicas de corrientes de iones de una sola célula bajo estrés de cizallamiento bien definido

El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

El uso de la cámara de flujo de placa paralela modificada puede ayudar a los investigadores a responder preguntas clave relacionadas con la respuesta funcional de los canales iónicos mecanosensibles al estrés de cizallamiento. La principal ventaja de esta técnica es que permite que la investigación en tiempo real fluya canales iónicos activados en una cámara de flujo de placa paralela fácilmente montada y reutilizable. Para comenzar el procedimiento, aplique una fina capa de solución de elastómero de silicona alrededor de los bordes del espacio rectangular de la pieza C, y coloque suavemente el vidrio de la cubierta rectangular, la pieza D, directamente sobre la solución de elastómero para cubrir completamente el espacio rectangular abierto de la pieza C.Limpie cuidadosamente el exceso de solución de elastómero de silicona.A continuación, repita el procedimiento para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza F, en la parte inferior de la pieza E y permita que la solución de elastómero de silicona se cure durante la noche a temperatura ambiente. Ahora, monte la cámara de flujo MPP colocando secuencialmente cada pieza en la parte superior de la anterior, comenzando con la cámara inferior, la pieza E, luego la pieza C, la pieza B, seguida de la pieza A en la parte superior. A continuación, alinee los orificios de tornillo de cada pieza en las esquinas y atornille firmemente las piezas para evitar que se produzcan fugas mientras se administra el flujo a la cámara de flujo MPP.En una placa de seis pozos, coloque círculos de vidrio de cubierta de cuatro a cinco, 12 milímetros en cada pozo. Guarde las células entre 10% y 30% de confluencia, de modo que se pueda acceder a células individuales para grabaciones electrofisiológicas. Posteriormente, incubar las células en condiciones de cultivo estándar durante no menos de dos horas para permitir que las células se adhieran, y no más de 24 horas, ya que las células endoteliales se volverán planas y difíciles de parchear cuando se siembran en la subconfluencia durante más de 24 horas.A continuación, retire un vaso de cubierta que contenga las células adheridas de un pozo de la placa de seis pozos y enjuague rápidamente en PBS. A continuación, transfiera el vaso de la cubierta con las células a un plato petri de 35 milímetros que contenga dos mililitros de solución electrofisiológica de BAF. Transfiera inmediatamente el vidrio de la cubierta con las células a la cámara de flujo MPP.Transfiera el círculo de vidrio de la cubierta al vidrio de la cubierta rectangular, pieza D, que se adhiere a la pieza C de la cámara de flujo MPP. Agregue la solución BAF para sumergir completamente el círculo de vidrio de la cubierta y las células. Posteriormente, coloque el círculo de vidrio de la cubierta en la pieza D de manera que las células estén en línea con las aberturas de hendidura de la pieza B.Asegúrese de que el círculo de vidrio de la cubierta se adhiere a la pieza D a través de la adhesión del vidrio de la solución para evitar la interrupción de la posición del círculo de vidrio de la cubierta por la aplicación de flujo.A continuación, monte la cámara de flujo MPP atornillando las piezas en el orden adecuado. Transfiera la cámara a la etapa del microscopio e infuda inmediatamente la cámara con solución BAF. A continuación, identifique una célula sana con un borde oscuro y un núcleo obvio para el experimento.Evite las células que parecen estar sonrojadas o las células que están en contacto con otras células. Para controlar la tensión de cizallamiento, configure un sistema de perfusión por gravedad conectando un cilindro de jeringa graduada de 30 mililitros a una cerradura Luer de tres vías equipada con tubos de microbore. A continuación, conecte el cilindro graduado a la jaula de Faraday que rodea la plataforma de electrofisiología con cinta adhesiva de doble cara.Antes de insertar el tubo en la cámara MPP, rellene previamente la jeringa y el tubo con solución BAF. A continuación, inserte el tubo en el orificio de entrada de la cámara de flujo MPP de la pieza A.Precarte la cámara de flujo MPP con solución, de manera que se esté retirando en el depósito de vacío. Detenga el flujo a la cámara y rellene el cilindro graduado hasta la marca superior.Calcule el caudal manualmente utilizando un cronómetro permitiendo que la solución fluya a través de la cámara a una altura de cilindro de jeringa dada. Levante o baje la jeringa para alterar el flujo y calcular la tensión de cizallamiento en una cámara paralela utilizando esta ecuación. Repita este proceso hasta que se encuentre el nivel deseado de tensión de cizallamiento.Posteriormente, transfiera una cámara montada que contenga células adheridas a la etapa del microscopio de la plataforma de electrofisiología. E inserte el tubo, precargado con solución BAF, en el agujero de la pieza A.Then, llene la cámara y lave las celdas con 10 mililitros de solución BAF, simultáneamente. Una vez que la configuración de parche deseada se obtenga con éxito, permita que las corrientes de canal se estabilicen en un baño estático a temperatura ambiente.Tan pronto como las corrientes se hayan estabilizado, aplique la cizalladura de una manera gradual, permitiendo que el aumento de la corriente se estabilice antes del siguiente paso del aumento del estrés de cizallamiento. Elimine la exposición al cizallamiento a las células deteniendo el flujo a la cámara, permitiendo que las corrientes de canal mecanosensibles vuelvan a las corrientes basales observadas en el baño estático. Aquí se muestra una grabación en bruto representativa de kir actual de una célula endotelial mesentérica del ratón primario con corriente de fuga externa lineal notable.Se aplicó una rampa de 140 a 40 milivoltios positivos al parche durante 400 milisegundos. La corriente de fuga impide el análisis de la actividad real del canal Kir. Para restar corriente de fuga, primero calcule la conductividad de pendiente lineal de la corriente de fuga.Múltiples pendientes G por voltajes correspondientes de toda la traza bruta para trazar la corriente de fuga en los datos sin procesar. La línea debe superponer la fuga lineal externa exactamente. A continuación, restar la corriente de fuga trazada de toda la traza para que la corriente externa lineal sea aproximadamente cero picoamperios por picofarad, y se pueda analizar la corriente Kir real.Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es colocar correctamente el vidrio de la cubierta en la cámara para que las células sean accesibles para los experimentos. Además, asegúrese de que el resbalón de la cubierta esté adecuadamente adherido a la pieza D, de modo que el flujo de fluido no interrumpa el vidrio de la cubierta que contiene las células.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

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