Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL073965, IL) ve (T32 HL007829-24, ıSF) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar da en son MPP akış odaları oluşturmak için Chicago Illinois Üniversitesi 'nde bilimsel makine dükkanı kabul etmek istiyorum.

Çalışmalarda hayvanların kullanımı Chicago hayvan bakım Komitesi Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (#16-183).
1. modifiye paralel plaka akış odasının montajı
Not: Lütfen Tablo 1 ve ŞEKIL 1 için MPP akış odası parça kimlikleri bakın. Montaj için oda parçalarının oryantasyonunu ayrıntılarıyla açıklayan bir şematik için lütfen Şekil 1</s...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

Vasküler sistem sürekli aktif hemodinamik kuvvetlere maruz kalmaktadır, hangi mekanik duyarlı iyon kanalları etkinleştirmek,3,22 ama bu kanallar kesme stres kaynaklı mechanotransdution içinde fizyolojik rolleri sadece 4,6,8ortaya çıkmaya başlıyor. Kesme stres aktif kanalların mekanik sensitivitesi sorumlu mekanizmalar bilinmeyen kalır. Burada ayrıntılı p...

Kan akışının oluşturduğu hemodinamik kuvvetler, endotel ve vasküler fonksiyonların1,2' de önemli roller çalmaktadır. Aynı zamanda iyon kanallarının çeşitli türleri akut kayma stres değişiklikleri yanıt bilinmektedir3,4,5 hipotezi için iyon kanalları primer kesme stres sensörleri olabilir lider. Daha yakın zamanda, biz ve diğerleri mekanik duyarlı iyon kanalları çeşitli kesme stres duyarlı damar fonksiyonları kritik roller oynamak gösterdi, kırma stres vazoaktif yanıt dahil olmak üzere6,7,8 ve gelişimsel anjiyogenez9. Ancak, iyon kanallarının kesme-stres hassasiyeti mekanizmaları neredeyse tamamen bilinmiyor. Bu bilgi boşluğu, iyi tanımlanmış kayma stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi teknik zorluk nedeniyle muhtemeldir. Bu makalede, bu nedenle, bu hedefe ulaşmak için laboratuvarımızda rutin olarak gerçekleştirilen bir adım adım ayrıntılı protokol sunuyoruz6,7,10,11.
Bu yöntemin genel amacı, fizyolojik aralıkta iyi tanımlanmış kesme stres altında iyon kanal mechanoactivation gerçek zamanlı soruşturma sağlamak için. Bu, standart bir paralel plaka akış odası değiştirerek elde edilir bir elektrofizyolojik pipet odasına indirilerek ve erişim hücreleri alt plaka üzerinde gerçek zamanlı akımına maruz kalma sırasında yetiştirilen, bu elde etmek için benzersiz bir yaklaşım sağlar hedef6,7,11. Buna karşılık, önceki yayınlarda açıklanan standart paralel plaka akış odaları, kesme kuvvetlerine maruz kalan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme analizi için kullanılabilir12 veya diğer non-invaziv yaklaşımlar13,14 ama değil Elektrofizyoloji. Benzer şekilde, koni ve plaka aparatı, hücreleri açığa çıkarmak için başka bir güçlü yaklaşım15,16 kesme stres de elektrofizyolojik kayıtlar için uygun değildir. Böylece, bu akış cihazları iyon kanallarının kesme stres hassasiyeti araştırılması izin vermez. Akış altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesinde zorluk, bu önemli etkilerden sorumlu mekanizmalar hakkında bilgi sağlamlığı için ana nedenidir.
Aynı hedefe ulaşmak için alternatif yaklaşımlar açısından, doğru veya kontrollü olan hiçbiri vardır. Bazı önceki çalışmalar,17,18yukarıdakinden bir hücrenin yakınında getirilen başka bir pipet gelen sıvı akışına hücreleri göstererek akış altında iyon kanal etkinliğini kaydetmeye çalıştı. Bu son derece fizyolojik olmayan, bu koşullarda oluşturulan mekanik kuvvetler kan damarlarında kesme stres fizyolojik profilleri ile ortak az olduğu gibi. Benzer endişeler açık odaların perfüzyon fizyolojik kesme stres simüle girişimleri için geçerlidir. Daha önceki çalışma10' da ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, açık bir sıvı hava arayüzü, fizyolojik olmayan, birden fazla bozulma ve devridaim oluşturur. Tüm bu endişeleri gidermek için, daha önceki çalışmalarımız6,7,10,11, yapılan "minimal invazif akış cihazı" olarak da adlandırılan değiştirilmiş bir paralel plaka (MPP) akış odası tasarladık Akrilik ve yaygın laboratuvarımızda kullanılır. Ancak, tasarımın orijinal tanımı neredeyse 20 yıl önce yayınlandı olmasına rağmen ve iyi tanımlanmış kesme stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi sağlayan tek akış cihazdır, Bu metodoloji değil diğer laboratuvarlar tarafından benimsenmiştir ve akış altında akımları kaydetmek için girişim sadece çok az sayıda çalışmalar vardır. Bu nedenle, MPP akış odasını kullanmak için ayrıntılı bir açıklama sağlayan, mekanik duyarlı iyon kanalları ve vasküler biyoloji ile ilgilenen araştırmalar için büyük yardımcı olacaktır inanıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Sıvı kesme stres iyi endotel fonksiyonunda önemli bir rol oynamak için bilinmektedir. Çoğu vasküler yataklarda, kan akışındaki akut artışlardan kaynaklanan yüksek kesme gerilimi, damar duvarındaki mekanik stresin azaltılması için vazodilasyona neden olan sinyalizasyon basamaklarını tetikler. Kesme stres deseni de iyi bir ateroskleroz gelişiminde önemli bir faktör olarak bilinen laminar kesme stres atherokoruyucu ve rahatsız kesme stres Pro-atojik olmak. Biz çeşitli ara hücre sinyalizasyon yolları ayrıntılı bir anlayış var iken, ilk kimyasal mediatörlere mekanik uyarıcı tercüme reseptörleri tamamen anlaşılır değildir. Mekanik duyarlı iyon kanalları, böylece vazoaktif mediatörlerin üretimini kontrol etmek için kesme ve kesme kaynaklı hücre sinyalleme düzenleyen yanıt için önemlidir. Bu kanallar, kesme için en erken aktif sinyal bileşenleri arasındadır ve nitrik oksit üretimini teşvik ederek kesme kaynaklı vazodilasyona bağlanmıştır (örn., K+ [kır] ve geçici reseptör potansiyeli [TRP] kanallar) ve endotelyum hiperpolarizasyon faktörü (örn., kir ve kalsiyum aktive K+ [KCA] kanallar) ve piezo kanalları içeren belirlenmemiş bir mekanizma aracılığıyla kesme kaynaklı vazokonstriksiyon. Bu kanalların kesme kuvvetleri tarafından aktive edildiği Biyofizik mekanizmayı anlamak (örneğin, doğrudan veya birincil mekanik reseptör yoluyla), endotel disfonksiyon ile ilişkili patofisyolojisi çözmek için potansiyel yeni hedefler sağlayabilir ve Atherogenesis. Elektrofizyoloji kullanarak gerçek zamanlı iyon kanallarının akış kaynaklı aktivasyonunu kaydetmek için hala önemli bir sorundur. Hücreleri iyi tanımlanmış kesme stresine maruz bırakmak için standart yöntemler, örneğin koni ve plaka reometresi ve kapalı paralel plaka akış odası iyon kanalı aktivasyonunun gerçek zamanlı çalışmasına izin vermez. Bu protokolün amacı, iyi tanımlanmış kayma stres altında mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıt sağlayan değiştirilmiş bir paralel plaka akış odası açıklamak için.

Mikroskop aşamasında MPP akış odasının farklı görünümlerini gösteren birden fazla fotoğraf (üst panel) ve MPP akış odasının şematik gösterimi (alt panel) Şekil 1' de gösterilir. Şematik detaylar tüm cihaz ve akış odası boyutları. Şekil 2 , laboratuvarımızda (üst panel) MPP akış odasına yerçekimi perfüzyon sisteminin bir fotoğrafını gösterir. Ayrıca gösterilen akış sisteminin bir şemati...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

Bu protokolün amacı, kayma stresi ile mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı aktivasyonunu araştırırken kullanılmak üzere değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasını tarif etmektir.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Modifiye paralel plaka akış odasının kullanımı, araştırmacıların mechanosensitive iyon kanallarının işitme gerilimine işlevsel yanıtıyla ilgili anahtar soruları yanıtlamalarına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gerçek zamanlı araştırmanın, kolayca monte edilebilen, yeniden kullanılabilir paralel plaka akış odasında aktif iyon kanallarının akmasını sağlamasıdır. İşleme başlamak için, C parçasının dikdörtgen uzayının kenarlarına ince bir silikon elastomer çözeltisi uygulayın ve dikdörtgen kapak camı, D parçasını doğrudan elastomer çözeltisinin üzerine yerleştirin.Daha sonra, dikdörtgen kapak camı, Parça F, parça E altına yapıştırma prosedürü tekrarlayın ve silikon elastomer çözeltisi oda sıcaklığında bir gecede tedavi sağlar. Şimdi, mpp akış odasını sırayla her parçayı bir öncekinin üstüne yerleştirerek birleştirin, alt oda, E parçası, sonra C parçası, B parçası, ardından a parçası üstte. Daha sonra, köşelerde her parçanın vida deliklerini hizalayın ve MPP akış odasına akış uygulanırken sızıntıların oluşmasını önlemek için parçaları sıkıca vidalayın.Altı kuyulu bir tabakta, her kuyuya 4-5, 12 milimetrelik kapak lı cam daireler yerleştirin. Hücreleri %10 ile %30 arasında bir araya kaydedin, öyle ki elektrofizyolojik kayıtlar için tek hücrelere erişilebilebilir. Daha sonra, endothelial hücreler düz olacak ve 24 saatten fazla subfluency tohumlu zaman yama zor olacak gibi, en az iki saat için standart kültür koşulları altında hücreleri kuluçka.Daha sonra, altı kuyulu bir tabaktan yapışmış hücreleri içeren bir kapak camı çıkarın ve PBS'de hızlı bir şekilde durulayın. Daha sonra, hücrelerle birlikte kapak camı, iki mililitre elektrofizyolojik BAF çözeltisi içeren 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Hemen mpp akış odasına hücreleri ile kapak cam aktarın.Kapak cam daire dikdörtgen kapak cam, parça D, MPP akış odasının C parçası yapıştırılır aktarın. Kapak cam çemberini ve hücreleri tamamen batırmak için BAF çözeltisini ekleyin. Daha sonra, kapak cam çemberini D parçasına yerleştirin, öyle ki hücreler b.Kapak cam çemberinin akış uygulaması ile kapak cam çemberinin konumunun bozulmasını önlemek için solüsyon cam yapışmayoluyla D parçasına yapışmasını sağlayın.Daha sonra, parçaları uygun sırada birbirine vidalayarak MPP akış odasını monte edin. Odayı mikroskop aşamasına aktarın ve hemen hazneyi BAF çözeltisi ile perfitle edin. Daha sonra, deney için karanlık kenarlıklı ve bariz çekirdeği olan sağlıklı bir hücre tanımlayın.Blubbing gibi görünen hücrelerden veya diğer hücrelerle temas eden hücrelerden kaçının. Kesme stresini kontrol etmek için, 30 mililitrelik bir şırınga silindirini mikrodelik boru ile donatılmış üç yönlü Luer kilidine bağlayarak bir yerçekimi perfüzyon sistemi kurun. Daha sonra, mezun silindiri çift taraflı bant kullanarak elektrofizyoloji teçhizatını çevreleyen Faraday kafesine takın.Tüpü MPP haznesine takmadan önce şırıngayı ve tüpü BAF çözeltisi ile önceden doldurun. Daha sonra, boruyu MPP akış odası giriş deliğine yerleştirin A.Pre-dolgu mpp akış odasını vakum haznesinde çıkarılacak şekilde solüsyonla doldurun. Odaya akışı durdurun ve üst işareti mezun silindir yeniden doldurun.Çözümün belirli bir şırınga silindiri yüksekliğinde hazneden akmasını sağlayarak bir kronometre kullanarak akış hızını manuel olarak hesaplayın. Bu denklemi kullanarak akışı değiştirmek ve paralel bir odadaki kesme gerilimini hesaplamak için şırıngayı yükseltin veya düşürün. İstenilen kesme gerilimi bulunana kadar bu işlemi tekrarlayın.Daha sonra, elektrofizyoloji teçhizatMikroskop aşamasına bağlı hücreleri içeren bir monte oda aktarın. Ve baf çözeltisi ile önceden doldurulmuş boruyu A.Then parçasının deliğine yerleştirin, odayı doldurun ve hücreleri aynı anda 10 mililitre BAF çözeltisi ile yıkayın. İstenilen yama yapılandırması başarıyla elde edildikten sonra, kanal akımlarının oda sıcaklığında statik bir banyoda stabilize olmasını bekleyin.Akımlar stabilize olur olmaz, kesme geriliminin bir sonraki adımından önce artan akımın stabilize olmasını sağlayan, adım adım şeklinde kesme uygulayın. Mechanosensitive kanal akımlarının statik banyoda gözlenen temel akımlara dönmesini sağlayarak, bölmeye akışı durdurarak hücrelere yakalama maruziyetini kaldırın. Burada gösterilen belirgin doğrusal dışa sızıntı akımı ile birincil fare mezenterik endotel hücresinden Kir akımı temsili bir ham kaydıdır.Yama 400 milisaniyenin üzerinde negatif 140 ila pozitif 40 milivolt luk bir rampa uygulandı. Sızıntı akımı gerçek Kir kanal aktivitesinin analizini engeller. Sızıntı akımını çıkarmak için, önce sızıntı akımının doğrusal eğim iletkenliğini hesaplayın.Ham veri üzerinde sızıntı akımı arsa için tüm ham iz karşılık gelen gerilimler tarafından çoklu G eğimi. Çizgi tam olarak dışa doğrusal sızıntı bindirmegerekir. Daha sonra, doğrusal dışa doğrusal akım picofarad başına yaklaşık sıfır picoamperes ve gerçek Kir akımı analiz edilebilir böylece tüm iz çizilmiş sızıntı akımı çıkarın.Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, hücrelerin deneyler için erişilebilir olması için kapak camı odanın düzgün bir şekilde yerle bir etmektir. Buna ek olarak, kapak fişinin D parçasına yeterince yapıştığından, sıvı akışının hücreleri içeren kapak camı bozmayan bir şekilde yapıştırılmasından emin olun.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu<emVibrio parahaemolyticus</em&gt; Yüzücü ve Swarmer Hücreleri

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...