Name: pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door Genome Canada, het Ontario Research Fund en de Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).

De hieronder beschreven experimenten moeten de richtlijnen van het Instituut voor milieu gezondheid en veiligheid volgen.
1. gepoolde CRISPR sgRNA lentivirale bibliotheek plasmide versterking
<ol><li>Verdun de kant-en-klare CRISPR sgRNA plasmide DNA-bibliotheek tot 50 ng/μL in TE (bijv. TKOv3).</li>
	<li>Electroporate de bibliotheek met behulp van elektrocompetente cellen. Stel in totaal vier elektroporation reacties in zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Voeg 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliothee...

<ol>
	<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms.">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li><li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+(Review).">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+CRISPR/Cas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes.">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+execution,+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR/Cas9+screens.">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knock-out+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies.">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors.">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras.">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions.">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li><li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification.">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li><li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STBL2:+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences.">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li><li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAGEL:+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens.">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).</li><li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ.">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Pedregosa, F. V., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scikit-learn:+Machine+Learning+in+Python.">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li><li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213 (2011).</li><li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Am+I+ready+for+CRISPR?+A+user's+guide+to+genetic+screens.">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li><li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR/Cas9+technology.">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knock-out+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).</li><li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens.">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li><li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells.">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li><li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators:+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays.">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li></ol>

Vanwege de eenvoud van gebruik en hoge buigbaarheid, is CRISPR-technologie op grote schaal goedgekeurd als het instrument van keuze voor precieze genoom bewerking. Gepoolde CRISPR-screening biedt een methode om duizenden genetische verstoringen te ondervragen in één experiment. In gepoolde schermen dienen sgRNA-bibliotheken als moleculaire barcodes, omdat elke sequentie uniek is en wordt toegewezen aan het beoogde gen. Door het genomisch DNA van de celpopulatie te isoleren, kunnen genen die het fenotype van belang vero...

CRISPR-CAS, kort voor geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen en CRISPR-geassocieerde nuclease, bestaat uit een enkelvoudig Nuclease eiwit (bijv. Cas9) in complex met een synthetische gids RNA (sgRNA). Dit RiboNucleoProteïne complex richt zich op het Cas9 enzym om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te induceren bij een specifieke genomische Locus1. Dubbel-gestrande pauzes kunnen worden gerepareerd via homologie gerichte reparatie (HDR) of, meer in het algemeen, door niet-homologeuze end-aansluiting (NHEJ), een foutgevoelig reparatie mechanisme dat resulteert in inbrengen en/of verwijderingen (INDELS) die vaak de genfunctie verstoren 1. de efficiëntie en eenvoud van crispr maakt een eerder onbereikbaar niveau van genomische targeting mogelijk dat ver overtreft eerdere genoom bewerkings technologieën [d.w.z. zink vinger nucleasen (znf) of transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen ( TALENS), die beide lijden aan een verhoogde ontwerp complexiteit, lagere transfectie-efficiëntie en beperkingen in multiplex Gene Editing2].
De basis onderzoekstoepassing van CRISPR single-Guide RNA-gebaseerde genoom Editing heeft wetenschappers toegestaan om de functies van individuele genen en de topologie van genetische interactie netwerken efficiënt en voordelig te ondervragen. De mogelijkheid om functionele genoom-brede schermen uit te voeren is sterk verbeterd door het gebruik van het CRISPR-CAS systeem, vooral in vergelijking met eerdere genetische perturbatie technologieën zoals RNA interferentie (RNAi) en Genval mutagenese. In het bijzonder lijdt RNAi aan hoge doel effecten en onvolledige knockdown, wat resulteert in een lagere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met crispr3,4,5, terwijl gentrap methoden alleen haalbaar zijn in haploïde cellen voor verlies-van-functie schermen, beperking van het bereik van celmodellen die kunnen worden verhoord6. Het vermogen van CRISPR om volledige genknock-out te genereren biedt een meer biologisch robuust systeem om Mutante fenotypes te ondervragen, met weinig ruis, minimale off-target effecten en consistente activiteit over reagentia5. Crispr Cas9 sgrna-bibliotheken die het hele menselijke genoom targeten, zijn nu algemeen beschikbaar, waardoor gelijktijdige opwekking van duizenden genknock-outs in een enkel experiment3,7,8,9 .
We hebben unieke CRISPR-Cas9 Genome-wide sgRNA lentivirale bibliotheken ontwikkeld, de Toronto knock-out (TKO) bibliotheken (beschikbaar via Addgene) die compact en sequence-geoptimaliseerd zijn om functionele genomics schermen met hoge resolutie te faciliteren. De nieuwste bibliotheek, TKOv3, richt zich op ~ 18.000 humane eiwit codering genen met 71.090 gidsen geoptimaliseerd voor het bewerken van efficiëntie met empirische data10. Daarnaast is TKOv3 beschikbaar als een bibliotheek met één component (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) die Cas9 en sgRNAs uitdrukken op een enkele vector, waardoor de noodzaak voor het genereren van stabiele Cas9-uitstellende cellen wordt verlicht, zodat het genoom-brede knock-out over een breed scala aan celtypen van zoogdieren. TKOv3 is ook beschikbaar in een vector zonder Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) en kan worden gebruikt in cellen die Cas911uitdrukken.
Een genoom-brede CRISPR Cas9 bewerkte celpopulatie kan worden blootgesteld aan verschillende groeiomstandigheden, waarbij de overvloed aan Sgrna's in de tijd wordt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing, waardoor een uitlezen wordt gegeven om de drop-out of verrijking van cellen te beoordelen met traceerbare genetische Verstoringen. CRISPR knock-out bibliotheken kunnen worden aangewend om genen te identificeren die, na perturbatie, cellulaire fitness defecten veroorzaken, matige geneesmiddel gevoeligheid (bijv. gevoelige of resistente genen), eiwit expressie reguleren (bijv., reporter), of zijn vereist voor een bepaalde Pathway functie en cellulaire toestand12,13,14. Differentiële fitness schermen in een kankercel lijn kunnen bijvoorbeeld zowel de uitputting als de reductie van oncogenen en verrijking of een toename van de tumor suppressors genen3,14,15identificeren. Evenzo kan het gebruik van tussenliggende doses therapeutische geneesmiddelen zowel de resistentie van de drug en sensibilisatie genen16,17onthullen.
Hier is een gedetailleerd screening protocol voor CRISPR-Cas9 verlies-van-functie screening met behulp van de Toronto knock-out libraries (TKOv1 of v3) in zoogdiercellen van bibliotheek generatie, screening van prestaties tot gegevensanalyse. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor screening met behulp van de Toronto knock-out Bibliotheken, het kan worden toegepast en schaalbaar te worden tot alle CRISPR sgRNA gepoolde bibliotheken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 micron filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C plate incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C shaking incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N Hydrochloric acid solution</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>HCL666.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-light transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cel culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>90293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>recommend passage number &#60;15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer to enhance transduction efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plates with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0544L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G (envelope plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 (packaging plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>400-160-UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C recovery medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRB Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #90203</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #125517</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard genomic DNA purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06 365 809 001</td>
			<td>Lipid based transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells

Genoom bewerking met het crispr-CAS-systeem heeft de mogelijkheid om de genomen van verschillende organismen nauwkeurig te bewerken enorm uitgebreid. In de context van zoogdiercellen vertegenwoordigt deze technologie een nieuw middel om Genome-brede genetische schermen voor functionele genomics-onderzoeken uit te voeren. Bibliotheken van Guide RNAs (sgRNA) gericht op alle open Lees frames toestaan de facile generatie van duizenden genetische verstoringen in een enkele pool van cellen die kunnen worden gescreend voor specifieke fenotypes om de genfunctie en cellulaire processen in een zonder vooringenomen en systematische wijze. CRISPR-CAS schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de genetische blauwdrukken voor cellulaire fenotypes te achterhalen. Bovendien kan differentiële analyse van schermen uitgevoerd in verschillende cellijnen en van verschillende kankersoorten genen identificeren die contextueel essentieel zijn in tumorcellen, waardoor potentiële doelen voor specifieke therapieën tegen kanker worden onthuld. Het uitvoeren van genoom-brede schermen in menselijke cellen kan ontmoedigend zijn, omdat dit de behandeling van tientallen miljoenen cellen inhoudt en een analyse van grote gegevenssets vereist. De details van deze schermen, zoals de karakterisering van de cellijn, overwegingen van CRISPR Library en het begrijpen van de beperkingen en mogelijkheden van CRISPR-technologie tijdens de analyse, worden vaak over het hoofd gezien. Hier is een gedetailleerd protocol voor de succesvolle prestaties van gegroepeerde genoom-Wide CRISPR Cas9 gebaseerde schermen.

Overzicht van de CRISPR-screening-workflow voor genoom schaal
Afbeelding 1 illustreert een overzicht van de gepoolde crispr-screening-werkstroom, beginnend met infectie van doelcellen met crispr Library lentivirus bij een lage Moi om te zorgen voor enkelvoudige integratie gebeurtenissen en adequate bibliotheek representatie (meestal 200-tot 1000 -fold). Na infectie worden cellen beh...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPR gescreende drop-out schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de ketenfunctie op genoombreed niveau te ondervragen. Het voordeel van CRISPR is de pliability om elk gen te bewerken door simpelweg de geleidesequentie te veranderen. CRISPR-gidsbibliotheken stellen onderzoekers in staat om het hele genoom van een organisme in één experiment op een onbevooroordeelde, systematische manier te ondervragen.Momenteel worden CRISPR-schermen gebruikt om essentiële genen in honderden menselijke kankers te identificeren en genetische interacties in kaart te brengen. Schermen kunnen ook volledig profiel drugs om drugs mechanismen van actie te onthullen. De HIER beschreven CRISPR-bibliotheken richten zich op menselijke cellen.Handleidingbibliotheken die zich richten op andere soorten, zoals muis, zijn echter beschikbaar en kunnen op dezelfde manier worden gescreend. Het uitvoeren van genoombrede schermen in menselijke cellen kan in de praktijk ontmoedigend zijn, omdat het gaat om de behandeling van tientallen miljoenen cellen en vereist analyse van grote sets gegevens. Voordat u een scherm start, moet u ervoor zorgen dat de cellijnen zorgvuldig worden gekarakteriseerd.Dit omvat het kennen van de zuiverheid van uw cellijn, verdubbelingstijd, lentivirus transductie-efficiëntie, en gevoeligheden voor antibiotica selectiemiddelen. Een visuele demonstratie geeft een beeld van hoe je praktisch omgaat met de miljoenen cellen die nodig zijn in een scherm en op systematische wijze duizenden verstoringen bijhouden. Het aantonen van de procedure zal Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh, en Ryan Climie, alle technici van mijn laboratorium.Begin met het transformeren van de kant-en-klare CRISPR sgRNA plasmid in elektrocompetent cellen en groeien ze volgens manuscript richtingen. Wanneer klaar om de kolonies te oogsten, voeg zeven milliliter LB met carbenicilline aan elke plaat en schraap de kolonies af met de celstroder. Gebruik een pipet van 10 milliliter om de geschraapte cellen over te brengen in een steriele conische kolf van één liter en spoel de plaat af met vijf milliliter LB met carbenicilline.Breng de spoeloplossing opnieuw over op de kolf. Centrifugeren de cellen volgens manuscript richtingen, en dan, bepalen het gewicht van de natte pellet. Zuiver het plasmide DNA met behulp van een Maxi of Mega schaal plasmid zuivering kit.Bereid cellen voor op transfectie door 293 T-cellen te zaaien en ze 's nachts uit te broeden. Bereid de volgende dag het drie transfectieplasmidemengsel voor platen van 15 centimeter. Bereken de hoeveelheid plasmide die nodig is voor een transfectie en maak een mix van plasmiden voor het aantal platen, plus een, te transfecteren.Bereid vervolgens een op lipide gebaseerde transfectiereageagens voor elke transfectie en aliquot-verlaagde serummedia in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor het aantal platen dat moet worden doorgesneden. Voeg het transfectiereagens toe, meng voorzichtig en broed vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg na de incubatie DNA toe aan het transfectiereagens bij een drie-op-één verhouding van transfectiereagensagens tot microgrammen DNA-complex.Meng de oplossing voorzichtig en laat 30 minuten op kamertemperatuur. Voeg het transfectiemengsel toe aan verpakkingscellen en ontcubeer ze volgens de handschriftaanwijzing. Op de dag van de virale oogst, controleer de cellen op abnormale en gesmolten morfologie als een indicatie van een goede virusproductie, en oogst het lentivirus door het verzamelen van de supernatant en het overbrengen van het naar een steriele centrifuge buis.Begin met het selecteren van de CRISPR-gids RNA-bibliotheekdekking die op het hele scherm moet worden onderhouden. Op basis van de dekking van de bibliotheek, bepalen het aantal cellen die nodig zijn om het te onderhouden per gids RNA en het aantal cellen die nodig zijn voor infectie op MOI 0.3. Bepaal vervolgens het aantal platen dat nodig is om de infectie op te zetten en vervolgens de cellen op elke plaat te oogsten en te zaaien.Voeg hexadimethrine bromide toe aan alle platen en voeg het vereiste virusvolume toe om twee platen te screenen en te controleren. Voeg geen virus toe om er een te controleren. Vervang dat volume door media.Meng de platen grondig door te kantelen en plaats de platen in een couveuse, zodat ze vlak zijn. Oogst geïnfecteerde cellen volgens manuscriptaanwijzingen en verzamel drie replica's van celpellets uit de gepoolde cellen voor genomische DNA-extractie. Centrifugeren de cellen op 500 keer g gedurende vijf minuten en was ze met PBS.Label de buizen en vries droog de cel pellets op min 80 graden Celsius. Splits de groep geïnfecteerde cellen op in drie gerepliceerde groepen, zodat u de dekking van de bibliotheek binnen elke replicaten behoudt. Zaad de cellen op een dichtheid die normaal gesproken zou worden gebruikt bij het uitbreiden van hen.Gebruik hetzelfde aantal cellen voor elke repliceren en hetzelfde totale aantal cellen tussen replica's. Doorgaan met de doorgang van de cellen en oogst drie replica's van celpellets uit elke replicate van gepoolde geïnfecteerde cellen voor maximaal 15 tot 20 celverdubbelingen. Bij elke passage, oogst de cellen van alle platen in elke repliceren met elkaar.Label elke pellet met de tijd en repliceren aanduiding. Stel PCR1 op volgens de handschriftaanwijzing met in totaal 100 microgram genomisch DNA op 3,5 microgram genomisch DNA per 50-microliterreactie en stel identieke 50-microliterreacties op om de gewenste dekking te bereiken. Stel één PCR buisreactie volgens manuscriptrichtingen in.Gebruik vijf microliter van het gepoolde PCR1-product als sjabloon en gebruik unieke indexprimercombinaties voor elk afzonderlijk monster om het bundelen van sequencing-bibliotheekmonsters mogelijk te maken. Na het voltooien van de PCR, voer de PCR buis product op een 2%agarose gel bij lage spanning voor een tot 1 1/2 uur. Visualiseer het product op een blauw licht transilluminator en accijns op de 200 base pair band.Zuiver het DNA en meet de kwantiteit en kwaliteit met zowel een spectrofotometer als een fluorometer. Een ideale gids RNA bibliotheek moet elke gids RNA vertegenwoordigd op vergelijkbare hoeveelheden. De volgende generatie sequencing kan worden gebruikt om te bevestigen dat de bibliotheek een strakke distributie van gids RNAs heeft.Precisiehernvoudige analyse kan worden gebruikt om de schermprestaties te evalueren. Een goed presterend scherm moet een groot aantal essentiële genen herstellen met een basisfactor groter dan zes en een valse detectiesnelheid van minder dan 5%De precisieherinneringscurve moet een scherpe elleboog en een rechte lijn naar het eindpunt hebben. De Bayes factor vertegenwoordigt een vertrouwensmaat dat het gen knock-out resulteert in een fitness defect.Hoge scores wijzen op meer vertrouwen, terwijl lage scores suggereren dat de gen knock-out groeivoordelen biedt. Genoom-brede knock-out zwembaden kunnen worden gekweekt in de aanwezigheid van overtollige drug agent om te zoeken naar suppressor resistentie genen. Om een positief selectiescherm voor suppressor van thymidineblok uit te voeren, worden de genormaliseerde gelezen tellingen voor alle gidsRNAs bij T0 uitgezet tegen gemiddelde-genormaliseerde gelezen tellingen voor thymidine-behandelde steekproeven.Een belangrijk detail voor het succesvol uitvoeren van CRISPR-schermen is het handhaven van een goede verdeling van elke gids RNA, vanaf transfectie van het plasmide tot transductie van cellen. Dit minimaliseert de kans op willekeurige effecten die gids RNA representatie kunnen scheeftrekken en leiden tot vals-positieve of negatieve resultaten. Na een schermvalidatie moeten experimenten worden uitgevoerd om treffers te bevestigen, omdat het primaire scherm alleen potentiële treffers identificeert.Afhankelijk van de biologie van de hits kunnen verschillende methoden worden gebruikt. CRISPR-bewerking, gecombineerd met de volgende generatie sequencing, heeft genoom-schaal verlies van functieschermen in diverse menselijke modelsystemen mogelijk gemaakt. Door de eenvoud van CRISPR zijn dit soort schermen nu breed toegankelijk voor alle onderzoekers, waardoor meer wetenschappers functionele genetische methoden kunnen gebruiken om biologische processen en ziekten te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen maatregel chromatine toegankelijkheid in zoogdiercellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...