Name: pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הגנום קנדה, קרן מחקר אונטריו, ואת המוסדות הקנדיים לחקר הבריאות (מגב-142375, PJT-148802).

הניסויים המפורטים להלן צריכים לפעול לפי ההנחיות של המכון לבריאות הסביבה ולמשרד הבטיחות.
1. הגברה במאגר הספרייה
<ol><li>לדלל את ספריית ה-DNA המוכן מראש של הספרייה כדי 50 ng/μL ב TE (למשל, TKOv3).</li>
	<li>אלקטרופורף את הספרייה באמצעות תאים אלקטרומוסמכים. הגדר סכום כולל של ארבע תגובות אלקטרו?...

<ol>
	<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms.">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li><li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+(Review).">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+CRISPR/Cas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes.">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+execution,+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR/Cas9+screens.">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knock-out+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies.">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors.">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras.">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions.">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li><li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification.">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li><li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STBL2:+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences.">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li><li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAGEL:+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens.">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).</li><li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ.">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Pedregosa, F. V., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scikit-learn:+Machine+Learning+in+Python.">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li><li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213 (2011).</li><li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Am+I+ready+for+CRISPR?+A+user's+guide+to+genetic+screens.">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li><li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR/Cas9+technology.">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knock-out+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).</li><li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens.">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li><li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells.">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li><li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators:+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays.">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li></ol>

בשל הפשטות של השימוש שלה pliability גבוהה, הטכנולוגיה CRISPR כבר אומץ נרחב ככלי הבחירה עבור עריכת הגנום מדויק. ההקרנה CRISPR במאגר מספק שיטה לחקור אלפי רטבאליות גנטית בניסוי אחד. במסכים במאגר, ספריות sgRNA לשמש כברקודים מולקולריים, כמו כל רצף הוא ייחודי ממופה הגן המיועד. על ידי בידוד ה-DNA גנומית מאוכלוסי...

Crispr-Cas, קיצור עבור מקובצים באופן קבוע במרווחים של palindromic קצר ולאחר מכן ו crispr הקשורים נוקלאז, מורכב חלבון נוקלאז יחיד (למשל, Cas9) מורכב עם מדריך סינתטי RNA (sgrna). זה מורכב ribonucleoprotein מטרות האנזים Cas9 כדי לגרום להפסקות DNA כפול שנתקע על לוקוס גנומית מסוימת1. כפול תקועים הפסקות ניתן לתקן דרך הומולוגיה תיקון מכוון (HDR) או, בדרך כלל, באמצעות שאינם הומוולוגיים הצטרפות (NHEJ), שגיאה מועדת תיקון מנגנון כי תוצאות ההוספה ו/או מחיקות (INDELS) כי לעתים קרובות לשבש את פונקציית הגן 1. היעילות והפשטות של CRISPR מאפשר רמה בעבר בלתי מושג של גנומית מיקוד כי הרבה עולה מעל הגנום הקודם לעריכת טכנולוגיות [i.e., האצבעות אבץ נוקלאוסיס (הזפה) או שעתוק activator כמו הנוקלאוסים ( TALENS), שניהם סובלים ממורכבות עיצוב מוגבר, יעילות החצייה הנמוכה יותר, ומגבלות בתוך מעגל העריכה של הקולנוע2].
היישום מחקר בסיסי של CRISPR בודד מדריך מבוסס RNA הגנום המבוסס על עריכת מדענים ביעילות ובזול לחקור את הפונקציות של גנים בודדים וטופולוגיה של רשתות אינטראקציה גנטית. היכולת לבצע מסכי הגנום הפונקציונלי היה משופר מאוד על ידי שימוש במערכת CRISPR-Cas, במיוחד כאשר בהשוואה לטכנולוגיות מוקדמות יותר גנטי כגון התערבות RNA (RNAi) ומוטזיס גנים מלכודת. בפרט, rnai סובל השפעות גבוהות מחוץ למטרה ואת הנוק-אין שלם, וכתוצאה מכך רגישות נמוכה יותר וספציפיות לעומת crispr3,4,5, בעוד שיטות מלכודות גנטי ניתן רק בהפלואיד תאים עבור מסכי אובדן-פונקציה, הגבלת היקף דגמי התא שניתן לחקור6. היכולת של CRISPR לייצר הגן המלא לנקוש לכבות מספק מערכת חזקה יותר ביולוגית לחקור פנוטיפים מוטנטים, עם רעש נמוך, השפעות מינימליות מחוץ ליעד ופעילות עקבית על פני ריאגנטים5. Crispr-Cas9 sgrna ספריות המטרה הגנום האנושי כולו זמינים כעת נרחב, המאפשר דור סימולטני של אלפי גנים להוריד בניסוי אחד3,7,8,9 .
פיתחנו מאוד CRISPR-Cas9 הגנום-wide sgRNA בספריות ויראליות בשם טורונטו לנקוש-out (TKO) ספריות (זמין דרך Addgene) כי הם קומפקטי רצף ממוטב כדי להקל על ברזולוציה גבוהה מסכי גנומיקה תפקודית. הספרייה העדכנית ביותר, TKOv3, מטרות ~ 18,000 האדם בקידוד הגנים עם מדריכים 71,090 ממוטב לעריכת יעילות באמצעות נתונים אמפיריים10. בנוסף, TKOv3 זמין כספרייה חד-קומפוננטי (LCV2:: TKOv3, מזהה Addgene #90294) המבטא Cas9 ו sgRNAs על וקטור יחיד, הקלה על הצורך ליצור תאים Cas9 ביטוי יציב, המאפשר הגנום רחב לנקוש על פני מגוון רחב של סוגי תאים ממיונקים. TKOv3 זמין גם בווקטור ללא Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene מזהה 125517) והוא יכול להיות מנוצל בתאים לבטא Cas911.
הגנום-wide CRISPR-Cas9 לערוך אוכלוסיית התאים ניתן לחשוף לתנאי גדילה שונים, עם שפע של sgRNAs לאורך זמן ככמת על ידי הדור הבא רצף, מתן הבדיקה כדי להעריך את הירידה או העשרה של תאים עם המעקב גנטי רטבאליות. הספריות של CRISPR מעלף ניתן לרתום כדי לזהות גנים כי, על פי הטורבציה, לגרום לפגמים בכושר הסלולר, רגישות מתונה תרופות (למשל, גנים רגישים או עמידים), להסדיר ביטוי חלבון (למשל, עיתונאי), או נדרשים עבור מסוים פונקציית מסלול ומדינה. סלולרית12,13,14 לדוגמה, מסכי כושר דיפרנציאלי בקו התאים של סרטן יכול לזהות גם דלדול או הפחתה של אונאוגנים והעשרה או גידול של דכאי הגידול גנים3,14,15. באופן דומה, שימוש במינונים בינוניים של תרופות טיפוליות יכול לחשוף הן עמידות לסמים והן גנים הרגישות16,17.
בתנאי כאן הוא פרוטוקול הקרנה מפורטת עבור CRISPR-בקנה מידה-Cas9 אובדן הפונקציה של ההקרנה באמצעות הספריות של טורונטו-out (TKOv1 או v3) בתאי היונקים מהדור הספרייה, הקרנת ביצועים לניתוח נתונים. למרות שפרוטוקול זה הותאם במיוחד להקרנה באמצעות הספריות לדפיקה בטורונטו, ניתן להחילם ולהפוך לניתן להרחבה לכל הספריות הנמצאות במאגר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 micron filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C plate incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C shaking incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N Hydrochloric acid solution</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>HCL666.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-light transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cel culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>90293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>recommend passage number &#60;15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer to enhance transduction efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plates with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0544L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G (envelope plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 (packaging plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>400-160-UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C recovery medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRB Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #90203</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #125517</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard genomic DNA purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06 365 809 001</td>
			<td>Lipid based transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells

עריכת הגנום באמצעות מערכת crispr-Cas יש מתקדם מאוד את היכולת לערוך בדיוק את גנום של אורגניזמים שונים. בהקשר של תאים מיונקים, טכנולוגיה זו מייצגת את האמצעים החדשניים לבצע הגנום-רחב מסכים גנטיים למחקרים גנומיקה תפקודית. ספריות של rnas מדריך (sgrna) מיקוד כל מסגרות הקריאה הפתוחה להתיר את הדור נתיישב של אלפי רטבאליות גנטית בבריכה אחת של תאים שניתן הוקרן עבור פנוטיפים ספציפיים כדי לסבך את הפונקציה גן ותהליכים סלולריים ב דרך לא משוחדת ושיטתית. CRISPR-Cas מסכי לספק לחוקרים עם שיטה פשוטה, יעילה, זולה לחשוף את התוכניות הגנטיות עבור פנוטיפים סלולריים. יתר על כן, ניתוח דיפרנציאלי של מסכי שבוצעו קווי תאים שונים מסוגים שונים של סרטן יכול לזהות גנים כי הם הכרחיים בתאי הגידול, חשיפת מטרות פוטנציאליות עבור טיפולים ספציפיים נגד סרטן. ביצוע מסכי הגנום כלל בתאים אנושיים יכול להיות מרתיע, כמו זה כרוך בטיפול של עשרות מיליוני תאים ודורש ניתוח של קבוצות גדולות של נתונים. הפרטים של המסכים האלה, כגון אפיון קו התא, שיקולי הספרייה של CRISPR, והבנת המגבלות והיכולות של טכנולוגיית CRISPR במהלך הניתוח, מתעלמים לעתים קרובות. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ביצוע מוצלח של במאגר הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי מסכי.

מבט כולל על זרימת העבודה הקרנה CRISPR בקנה מידה של הגנום
איור 1 ממחיש סקירה של זרימת העבודה ההקרנה crispr במאגר, החל בזיהום של תאי היעד עם הספרייה crispr וירוס ב-משרד העניינים נמוך כדי להבטיח אירועים שילוב יחיד ייצוג ספריה ...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

מסכי נשירה עם מסך CRISPR מספקים לחוקרים שיטה פשוטה, יעילה וזולה לחקור את תפקוד השרשרת ברמה הגנום כולה. היתרון של CRISPR הוא האחריות שלו לערוך כל גן פשוט על ידי שינוי רצף המדריך. ספריות מדריכי CRISPR מאפשרות לחוקרים לחקור את כל הגנום של כל אורגניזם בניסוי אחד בצורה שיטתית ובלתי משוחדת.כיום, מסכי CRISPR משמשים לזיהוי גנים חיוניים על פני מאות סוגי סרטן אנושיים ולמפות אינטראקציות גנטיות. מסכים יכולים גם פרופיל מקיף תרופות כדי לחשוף מנגנוני סמים של פעולה. ספריות CRISPR המתוארות כאן מתמקדות בתאים אנושיים.עם זאת, ספריות מדריך המכוונות למינים אחרים, כגון עכבר, זמינות ו ניתן לסנן אותן באופן דומה. ביצוע מסכים ברחבי הגנום בתאים אנושיים יכול להיות מרתיע בפועל, כפי שהוא כרוך בטיפול של עשרות מיליונים בתאים ודורש ניתוח של קבוצות גדולות של נתונים. לפני הפעלת מסך, ודא שקווי התא מאופיינים בקפידה.זה כולל לדעת את הטוהר של קו התא שלך, הכפלת זמן, יעילות ההשתנה lentivirus, ורגישות לסוכני בחירת אנטיביוטיקה. הדגמה ויזואלית תספק תמונה של איך לטפל כמעט במיליוני התאים הנדרשים במסך ולעקוב אחר אלפי הפרעות באופן שיטתי. הדגימו את ההליך יהיו אנדראה חבסיד, כמאלדיפ אולך וראיין קלימי, כולם טכנאים מהמעבדה שלי.התחל בהפיכת SgRNA CRISPR מוכן לתאים אלקטרו-כשירים וגידולם בהתאם לכיווני כתב היד. כאשר מוכן לקצור את המושבות, להוסיף שבעה מיליליטר של LB עם קרבניצילין לכל צלחת ולגרד את המושבות עם מפזר התא. השתמש פיפלט 10 מיליליטר כדי להעביר את התאים שרוט לתוך בקבוק חרוט סטרילי של ליטר אחד, ולשטוף את הצלחת עם חמישה מיליליטר של LB עם קרבניצילין.שוב, להעביר את פתרון שטיפה לבקבוקון. צנטריפוגה התאים על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן, לקבוע את המשקל של גלולה רטובה. לטהר את ה-DNA פלסמיד באמצעות Maxi או מגה בקנה מידה פלסמיד טיהור ערכה.הכינו תאים לתרגום על ידי זריעת 293 תאי T ודגירה שלהם בן לילה. למחרת, להכין את תערובת פלסמיד transfection שלוש עבור צלחות 15 ס"מ. לחשב את כמות פלסמיד הדרושה עבור transfection אחד ולעשות תערובת של פלסמידים עבור מספר צלחות, ועוד אחד, להיות מומרים.לאחר מכן, הכינו ריג'נט transfection מבוסס שומנים עבור כל טרנספקט ומדיית סרום מופחתת aliquot לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר עבור מספר הלוחות להיות מנוכה. מוסיפים את רגנט ההטרדה, מערבבים בעדינות ומטוגים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים דנ"א לריג'נט ההטרמפציה ביחס של שלושה לאחד של רגנט טרנס-דביק למיקרוגרם של קומפלקס דנ"א.מערבבים את הפתרון בעדינות ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מוסיפים את תערובת ההטרנספיה לתאי האריזה ומדרגים אותם לפי הוראות כתב היד. ביום של קציר ויראלי, לבדוק את התאים עבור מורפולוגיה חריגה התמזגו כאינדיקציה של ייצור וירוס טוב, לקצור את lentivirus על ידי איסוף supernatant והעברתו צינור צנטריפוגה סטרילי.התחל בבחירת כיסוי ספריית RNA של מדריך CRISPR שיש לשמור לאורך המסך. בהתבסס על כיסוי הספריה, לקבוע את מספר התאים הדרושים כדי לשמור אותו לכל מדריך RNA ואת מספר התאים הדרושים לזיהום ב MOI 0.3. לאחר מכן, לקבוע את מספר הלוחות הנדרשים כדי להגדיר את הזיהום ולאחר מכן, לקצור ולזרע את התאים לכל צלחת.מוסיפים את הקסדימרין ברומיד לכל הצלחות ומוסיפים את נפח הנגיף הנדרש להקרנה ושליטה על שתי צלחות. אל תוסיף וירוס כדי לשלוט בווירוס. החלף אמצעי אחסון זה במדיה.מערבבים את הצלחות ביסודיות על ידי הטיה ומ מניחים את הצלחות באינקובטור, מוודאים שהן ברמה. לקצור תאים נגועים על פי הוראות כתב היד ולאסוף שלושה שכפולים של כדורי תאים מהתאים המפולגים להפקת DNA גנומי. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ולשטוף אותם עם PBS.סמן את הצינורות ולהקפיא לייבש את כדורי התא במינוס 80 מעלות צלזיוס. פצל את מאגר התאים הנגועים לשלוש קבוצות שכפול, הקפד לשמור על כיסוי ספריה בתוך כל שכפול. זרע את התאים בצפיפות שבדרך כלל ישמשו בעת הרחבתם.השתמש באותו מספר תאים עבור כל שכפול ואותו מספר תאים כולל בין שכפולים. המשך לעבור את התאים לקצור שלושה שכפולים של כדורי תאים מכל שכפול של תאים נגועים מאגר עד 15 עד 20 הכפלות תאים. בכל מעבר, לקצור את התאים מכל הלוחות בכל לשכפל אחד עם השני.סמן כל גלולה עם הזמן ושכפל את הכינוי. הגדר PCR1 על פי הוראות כתב היד עם סך של 100 מיקרוגרם של DNA גנומי ב 3.5 מיקרוגרם של DNA גנומי לכל תגובה 50 מיקרוליטר ולהגדיר תגובות זהות 50 מיקרוליטר כדי להשיג כיסוי הרצוי. הגדר תגובת צינור PCR אחת בהתאם לכיווני כתב היד.השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR1 המאגר כתבנית ולהשתמש בשילובי פריימר אינדקס ייחודיים עבור כל מדגם בודד כדי לאפשר צירוף של דגימות ספריית רצף. לאחר השלמת PCR, הפעל את מוצר צינור PCR על ג'ל 2%agarose במתח נמוך למשך שעה עד 1/2 שעות. דמיינו את המוצר על טרנסילומינטור עם אור כחול ובלו את רצועת זוג הבסיס 200.מטהרים את הדנ"א ומודדים את כמותו ואיכותו הן עם ספקטרופוטומטר והן עם פלואורומטר. ספריית RNA מדריך אידיאלי צריך להיות כל RNA מדריך יחיד מיוצג בכמויות דומות. ניתן להשתמש ברצף הדור הבא כדי לאשר שלספריה יש הפצה הדוקה של RNAs מדריך.ניתן להשתמש בניתוח אחזור מדויק כדי להעריך את ביצועי המסך. מסך בעל ביצועים גבוהים צריך לשחזר מספר רב של גנים חיוניים בגורם בסיס גדול משישה וקצב גילוי כוזב של פחות מ -5%עקומת האחזור המדויק צריכה להיות מרפק חד קו ישר לנקודת המסוף. גורם ביינס מייצג מדד ביטחון כי נוקאאוט הגן גורם פגם כושר.ציונים גבוהים מצביעים על ביטחון מוגבר, בעוד ציונים נמוכים מצביעים על כך שהנוקאאוט של הגנים מספק יתרונות צמיחה. בריכות נוקאאוט ברחבי הגנום ניתן לתרבת בנוכחות סוכן סמים עודף לחפש גנים התנגדות מדכא. כדי לבצע מסך בחירה חיובי עבור מדכא של בלוק תימידין, ספירות קריאה מנורמלות עבור כל RNAs מדריך ב T0 הם התווה נגד ספירת קריאה מנורמלת ממוצעת עבור דגימות שטופלו תימידין.פרט מפתח לביצוע מוצלח של מסכי CRISPR הוא שמירה על הפצה טובה של כל RNA מדריך, החל מ transfection של פלסמיד כדי ההעתקה של תאים. פעולה זו תמזער את הסיכוי לאפקטים אקראיים שיכולים להטות את ייצוג ה- RNA ולהוביל לתוצאות חיוביות או שליליות כוזבות. לאחר אימות מסך, יש לבצע ניסויים כדי לאשר כניסות מכיוון שהמסך הראשי מזהה רק כניסות פוטנציאליות.בהתאם לביולוגיה של הלהיטים, ניתן להשתמש בשיטות שונות. עריכת CRISPR, בשילוב עם רצף הדור הבא, אפשרה אובדן בקנה מידה של גנום של מסכי פונקציה במערכות מודל אנושי מגוונות. בשל הפשטות של CRISPR, סוגים אלה של מסכים נגישים כעת באופן נרחב לכל החוקרים, ומאפשרים ליותר מדענים להשתמש בשיטות גנטיות תפקודיות כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ומחלות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...