Name: pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

この研究は、ゲノムカナダ、オンタリオ州研究基金、およびカナダ保健研究所(MOP-142375、PJT-148802)によって支援されました。

以下に概説する実験は、研究所の環境保健安全局のガイドラインに従うべきである。
1. プールされたCRISPR sgRNAレンチウイルスライブラリープラスミド増幅
<ol><li>既製のCRISPR sgRNAプラスミドDNAライブラリーをTEで50ng/μL(例えば、TKOv3)に希釈します。</li>
	<li>エレクトロコンピテントセルを使用してライブラリを電気ポレートします。以下に説明するように合計4つのエレク?...

<ol>
	<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms.">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li><li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+(Review).">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+CRISPR/Cas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes.">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+execution,+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR/Cas9+screens.">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knock-out+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies.">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors.">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras.">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions.">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li><li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification.">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li><li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STBL2:+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences.">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li><li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAGEL:+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens.">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).</li><li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ.">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Pedregosa, F. V., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scikit-learn:+Machine+Learning+in+Python.">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li><li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213 (2011).</li><li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Am+I+ready+for+CRISPR?+A+user's+guide+to+genetic+screens.">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li><li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR/Cas9+technology.">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knock-out+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).</li><li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens.">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li><li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells.">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li><li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators:+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays.">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li></ol>

使用の簡易性および高い準備性のために、CRISPRの技術は精密なゲノム編集のための選択の用具として広く採用されている。プールされたCRISPRスクリーニングは、単一の実験で何千もの遺伝的摂動を尋問する方法を提供する。プールされたスクリーンでは、sgRNAライブラリは分子バーコードとして機能し、各配列は一意であり、標的遺伝子にマッピングされます。細胞集団からゲノムDNAを分離?...

CRISPR-Casは、クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピートおよびCRISPR関連ヌクレアーゼの略で、合成ガイドRNA(sgRNA)と複合体内の単一のヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9)から構成される。このリボヌクレオタンパク質複合体は、Cas9酵素を標的とし、特定のゲノム遺伝子座1で二本鎖DNA破断を誘導する。二本鎖の切断は、相同性指向修復(HDR)を介して修復することができ、より一般的には、非相同エンド結合(NHEJ)を介して、遺伝子機能を頻繁に破壊する挿入および/または欠失(INDELS)をもたらすエラーが発生しやすい修復メカニズム1.CRISPRの効率性とシンプルさは、以前のゲノム編集技術(すなわち、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZNF)または転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ()をはるかに上回る、これまで達成不可能なレベルのゲノムターゲティングを可能にします。TALENS)は、いずれも設計の複雑さの増大、トランスフェクション効率の低下、多重遺伝子編集2の限界に苦しんでいる。
CRISPRシングルガイドRNAベースのゲノム編集の基礎研究アプリケーションは、科学者が効率的かつ安価に個々の遺伝子の機能と遺伝的相互作用ネットワークのトポロジーを問うことを可能にしました。機能的ゲノムワイドスクリーンを実行する能力は、特にRNA干渉(RNAi)や遺伝子トラップ変異などの以前の遺伝的摂動技術と比較した場合、CRISPR-Casシステムの使用によって大幅に強化されました。特に、RNAiは高いオフターゲット効果と不完全なノックダウンに苦しんでおり、CRISPR3、4、5に比べて感度と特異性が低く、遺伝子トラップ法はハプロイドでのみ実現可能です。機能喪失画面のセルは、尋問可能なセルモデルの範囲を制限する 6.完全な遺伝子ノックアウトを生成するCRISPRの能力は、低ノイズ、最小限のオフターゲット効果と試薬5全体の一貫した活性で、変異型の現象型を調知するためのより生物学的に堅牢なシステムを提供します。ヒトゲノム全体を標的とするCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーが広く利用可能となり、1回の実験で何千もの遺伝子ノックアウトを同時に生成できる3、7、8、9.
トロントノックアウト(TKO)ライブラリー(Addgeneを通じて入手可能)と呼ばれる独自のCRISPR-Cas9ゲノムワイドsgRNAレンチウイルスライブラリを開発し、高解像度機能ゲノミクススクリーンを容易にするためにコンパクトでシーケンス最適化されています。最新のライブラリTKOv3は、経験データ10を使用して効率を編集するために最適化された71,090ガイドを持つ〜18,000人のヒトタンパク質コード遺伝子を対象としています。さらに、TKOv3は、単一のベクター上でCas9およびsgRNAを発現する1成分ライブラリ(LCV2:TKOv3、Addgene ID#90294)として利用可能であり、安定したCas9発現細胞を生成する必要性を緩和し、幅広いゲノムワイドノックアウトを可能にする。哺乳類細胞型。TKOv3は、Cas9(pLCKO2::TKOv3、アディジーンID#125517)を持たないベクターでも利用可能であり、Cas911を発現する細胞で利用することができる。
ゲノム全体のCRISPR-Cas9編集細胞集団は、次世代シーケンシングによって時間の経過とともに定量化されたsgRNAの豊富さと異なる増殖条件にさらされる可能性があります。摂 動。CRISPRノックアウトライブラリーは、摂動時に細胞フィットネス欠陥を引き起こし、中程度の薬物感受性(例えば、感受性または耐性遺伝子)、タンパク質発現を調節する(例えば、レポーター)、または特定の遺伝子を同定するために利用することができる。経路機能および細胞状態12、13、14。例えば、癌細胞株における差動適合性スクリーンは、腫瘍遺伝子および濃縮の枯渇または減少または腫瘍抑制遺伝子3、14、15の増加の両方を同定することができる。同様に、治療薬の中間用量を使用すると、薬剤耐性および感量遺伝子16、17の両方を明らかにすることができる。
ここでは、ライブラリー生成からデータ解析までの哺乳類細胞におけるトロントノックアウトライブラリー(TKOv1またはv3)を用いてゲノムスケールCRISPR-Cas9の機能喪失スクリーニングのための詳細なスクリーニングプロトコルを提供します。このプロトコルは、トロントノックアウトライブラリを使用してスクリーニング用に最適化されていますが、適用でき、すべてのCRISPR sgRNAプールライブラリにスケーラブルにすることができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 micron filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C plate incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C shaking incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N Hydrochloric acid solution</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>HCL666.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-light transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cel culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>90293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>recommend passage number &#60;15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer to enhance transduction efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plates with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0544L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G (envelope plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 (packaging plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>400-160-UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C recovery medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRB Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #90203</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #125517</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard genomic DNA purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06 365 809 001</td>
			<td>Lipid based transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells

CRISPR-Casシステムを用いてゲノム編集を行い、様々な生物のゲノムを精密に編集する能力を大幅に向上させています。哺乳類細胞の文脈では、この技術は、機能的ゲノミクス研究のためのゲノム全体の遺伝的スクリーンを実行するための新しい手段を表す。すべての開いた読み取りフレームを標的とするガイドRNA(sgRNA)のライブラリは、遺伝子機能および細胞プロセスを含む特定の表現型をスクリーニングすることができる細胞の単一プール内の何千もの遺伝的摂動の顔の生成を可能にする公平で体系的な方法。CRISPR-Casスクリーンは、細胞の型示体の遺伝的青写真を明らかにするために、簡単で効率的で安価な方法を研究者に提供します。さらに、様々な細胞株や異なるがんタイプから行われるスクリーンの微分解析により、腫瘍細胞に文脈的に不可欠な遺伝子を同定し、特定の抗癌治療の潜在的な標的を明らかにすることができます。ヒト細胞でゲノム全体のスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の処理を伴い、大規模なデータセットの分析を必要とするので、困難な場合があります。セルラインの特性認識、CRISPR ライブラリの考慮事項、解析中の CRISPR テクノロジの制限と機能の理解など、これらの画面の詳細は見落とされることがよくあります。ここでは、プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9ベースの画面の正常なパフォーマンスのための詳細なプロトコルを提供します。

ゲノムスケールCRISPRスクリーニングワークフローの概要
図1は、単一の統合イベントと適切なライブラリ表現(通常200~1000)を確保するために、低MOIでCRISPRライブラリーレンチウイルスを持つ標的細胞の感染から始まる、プールされたCRISPRスクリーニング作業フローの概要を示しています。-...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPRスクリーニングされたドロップアウトスクリーンは、ゲノム全体のレベルで連鎖機能を問い合せるためのシンプルで効率的で安価な方法を研究者に提供します。CRISPRの利点は、単にガイド配列を変更することによって任意の遺伝子を編集するその柔軟性です。CRISPRガイドライブラリは、研究者が公平で体系的な方法で1つの実験で任意の生物のゲノム全体を尋問することを可能にします。現在、CRISPRスクリーンは、何百ものヒト癌にまたがって必須遺伝子を同定し、遺伝的相互作用をマッピングするために使用されています。スクリーンはまた、薬物を包括的にプロファイリングして、薬物の作用機序を明らかにすることもできる。ここで説明するCRISPRライブラリは、ヒト細胞を標的とする。ただし、マウスなどの他の種を対象としたガイドライブラリも利用可能であり、同様にスクリーニングすることができます。ヒト細胞でゲノムワイドスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の取り扱いを伴い、大量のデータセットの分析を必要とするため、実際には困難な場合があります。画面を開始する前に、細胞のラインが慎重に特徴付けられていることを確認してください。これには、細胞株の純度、倍の時間、レンチウイルスの導入効率、抗生物質選択剤に対する感受性を知ることなどが含まれます。視覚的なデモンストレーションでは、画面に必要な数百万のセルを実際に処理し、体系的に何千もの摂動を追跡する方法の画像を提供します。手順を実証するには、アンドレア・ハブシド、カマルディープ・アウラク、ライアン・クリミー、私の研究室のすべての技術者になります。まず、既製のCRISPR sgRNAプラスミドを電気コンピテントセルに変換し、原稿の指示に従って成長させることから始めます。コロニーを収穫する準備ができたら、各プレートにカルベニシリンを含むLBの7ミリリットルを追加し、細胞スプレッダーでコロニーを削り取ります。10ミリリットルのピペットを使用して、掻き取った細胞を無菌の1リットル円錐形フラスコに移し、5ミリリットルのLBでプレートをカルベニシリンで洗い流します。再度、リンス溶液をフラスコに移す。原稿の方向に従って細胞を遠心分離し、次いで、湿ったペレットの重量を決定する。マキシまたはメガスケールプラスミド精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。293個のT細胞を播種し、一晩インキュベートしてトランスフェクション用の細胞を調製します。翌日、3つのトランスフェクションプラスミド混合物を15センチメートルプレート用に調製します。1回のトランスフェクションに必要なプラスミドの量を計算し、プレート数にプラス1を加えて、トランスフェクションするプラスミドの混合物を作ります。次に、トランスフェクションおよびアリコート還元血清培地ごとに、トランスフェクションされるプレート数に対して個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに脂質ベースのトランスフェクション試薬を調製する。トランスフェクション試薬を加え、軽く混ぜ、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、トランスフェクション試薬とDNA複合体のマイクログラムに対するトランスフェクション試薬の3対1の比率で、トランスフェクション試薬にDNAを添加する。溶液をやさしく混ぜ、室温で30分間放置します。トランスフェクション混合物を包装細胞に加え、原稿の指示に従ってインキュベートします。ウイルス収穫の日に、良好なウイルス産生の指標として異常および融合形態の細胞をチェックし、上清を収集し、滅菌遠心分離管に移すことによってレンチウイルスを収穫する。まず、画面全体に維持されるCRISPRガイドRNAライブラリカバレッジを選択します。ライブラリのカバレッジに基づいて、ガイドRNAあたりの維持に必要な細胞数とMOI 0.3での感染に必要な細胞数を決定します。次に、感染をセットアップするために必要なプレートの数を決定し、その後、収穫し、各プレートに細胞を播種します。すべてのプレートにヘキサジメトリン臭化物を加え、スクリーニングに必要な量のウイルスを加え、2つのプレートを制御します。ウイルスを制御するウイルスを追加しないでください。そのボリュームをメディアに置き換えます。プレートを傾けて十分に混ぜ、プレートをインキュベーターに入れ、レベルを確認します。原稿の方向に従って感染した細胞を収穫し、ゲノムDNA抽出のためにプールされた細胞から細胞ペレットの3つの複製を収集する。500回gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄します。チューブにラベルを付け、セルペレットをマイナス80°Cで凍結乾燥させます。感染した細胞のプールを 3 つのレプリケート グループに分割し、各レプリケート内でライブラリのカバレッジを維持します。細胞を拡大するときに通常使用される密度でセルをシードします。各レプリケートに同じ数のセルを使用し、レプリケートの間に同じセルの合計数を使用します。細胞を通過し続け、最大15〜20細胞の倍増のためにプールされた感染細胞の各複製から細胞ペレットの3つの複製を収穫する。各通路で、それぞれのすべてのプレートから細胞を収穫し、互いに複製する。各ペレットに時間をラベル付けし、指定を複製します。50マイクロリットル反応あたり3.5マイクログラムのゲノムDNAで合計100マイクログラムのゲノムDNAを持つ原稿の指示に従ってPCR1を設定し、望ましいカバレッジを達成するために同一の50マイクロリットル反応を設定します。原稿の方向に従って1つのPCRチューブ反応を設定します。プールされた PCR1 製品の 5 マイクロリットルをテンプレートとして使用し、各サンプルに固有のインデックスプライマーの組み合わせを使用して、シーケンシング ライブラリ サンプルのプーリングを可能にします。PCRを完了した後、1〜1時間半の低電圧で2%アガロースゲルでPCRチューブ製品を実行します。青いライトのトランイルミニューターで製品を視覚化し、200ベースのペアバンドを物品化します。分光光度計と蛍光計の両方でDNAを浄化し、その量と品質を測定します。理想的なガイドRNAライブラリは、同様の量で表されるすべての単一のガイドRNAを持っている必要があります。次世代シーケンシングを使用して、ライブラリにガイドRNAの密な分布があることを確認できます。精密リコール分析を使用して、画面のパフォーマンスを評価できます。高性能スクリーンは、6より大きい基本因子で多数の必須遺伝子を回収し、5%未満の誤検出率を持つ必要があります精密リコール曲線は、鋭い肘と終点への直線を持っている必要があります。ベイズ因子は、遺伝子ノックアウトがフィットネスの欠陥をもたらすという信頼度測定を表します。高いスコアは自信の向上を示し、低スコアは遺伝子ノックアウトが成長優位性を提供することを示唆している。ゲノムワイドノックアウトプールは、抑制性遺伝子を探すために過剰な薬剤の存在下で培養することができる。チミジンブロックのサプレッサーに対して正の選択画面を実行するために、T0における全ガイドRNAの正規化読み取りカウントは、チミジン処理サンプルの平均正規化読み取りカウントに対してプロットされる。CRISPRスクリーンを正常に実行するための重要な詳細は、プラスミドのトランスフェクションから細胞の導入まで、各ガイドRNAの良好な分布を維持することです。これは、ガイドRNA表現を歪め、偽陽性または否定的な結果につながるランダムな効果の可能性を最小限に抑えます.画面検証の後、プライマリ画面では潜在的なヒットしか識別されないため、ヒットを確認するための実験を行う必要があります。ヒットの生物学に応じて、様々な方法が使用できます。CRISPR編集は、次世代シーケンシングと組み合わせることで、多様なヒトモデルシステムにおける機能画面のゲノムスケールの損失を可能にしました。CRISPRのシンプルさのために、これらのタイプのスクリーンは現在、すべての研究者に広くアクセス可能であり、より多くの科学者が生物学的プロセスおよび疾患を研究するために機能的な遺伝的方法を利用することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるメジャー クロマチン アクセシビリティ規制要素のホルムアルデヒドによる分離

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...