Name: pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av arvsmassa Kanada, Ontarios forskningsfond och de kanadensiska instituten för hälsoforskning (MOP-142375, PJT-148802).

De experiment som beskrivs nedan bör följa institutets miljöskyddsbyråns riktlinjer.
1. poolade CRISPR sgRNA lentiviral bibliotek plasmid amplifiering
<ol><li>Späd det färdigtillverkade CRISPR sgRNA plasmid DNA-biblioteket till 50 ng/μL i TE (t. ex. TKOv3).</li>
	<li>Electroporate biblioteket med hjälp av elektrokompetenta celler. Ställ in totalt fyra elektroportionsreaktioner enligt beskrivningen nedan.<ol>
<li>Tillsätt 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliotek till 25 μL upptinade elektroko...

<ol>
	<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms.">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li><li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+(Review).">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+CRISPR/Cas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes.">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+execution,+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR/Cas9+screens.">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knock-out+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies.">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors.">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras.">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions.">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li><li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification.">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li><li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STBL2:+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences.">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li><li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAGEL:+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens.">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).</li><li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ.">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Pedregosa, F. V., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scikit-learn:+Machine+Learning+in+Python.">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li><li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213 (2011).</li><li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Am+I+ready+for+CRISPR?+A+user's+guide+to+genetic+screens.">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li><li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR/Cas9+technology.">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knock-out+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).</li><li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens.">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li><li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells.">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li><li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators:+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays.">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li></ol>

På grund av sin enkelhet i användning och hög följbarhet, CRISPR teknik har allmänt antagits som verktyg för val för exakt genomredigering. Poolade CRISPR screening ger en metod för att förhöra tusentals genetiska störningar i ett enda experiment. I poolade skärmar fungerar sgRNA-biblioteken som molekylära streckkoder, eftersom varje sekvens är unik och mappas till den riktade genen. Genom att isolera det genomiska DNA från cellpopulationen kan gener som orsakar fenotypen av intresse bestämmas genom att k...

CRISPR-CAS, kort för grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner och CRISPR-associerade Nuclease, består av ett enda nukleasprotein (t. ex., Cas9) i komplex med en syntetisk guide RNA (sgrna). Detta ribonukleoprotein Complex riktar sig till Cas9 enzym för att inducera dubbelsträngade DNA-brott vid en specifik genomisk Locus1. Dubbel-strandsatta raster kan repareras via homologi riktad reparation (HDR) eller, mer allmänt, genom icke-homolog sammanfogning (nhej), en felbenägna reparationsmekanism som resulterar i införande och/eller borttagningar (indels) som ofta stör genfunktion 1. den effektivitet och enkelhet CRISPR möjliggör en tidigare ouppnåelig nivå av genomisk inriktning som vida överträffar tidigare genom redigering teknik [i.e., zink finger nukleaser (ZNF) eller transkription Activator-liknande effektor nukleaser ( TALENS), som båda lider av ökad design komplexitet, lägre transfektion effektivitet, och begränsningar i multiplex genredigering2].
Den grundläggande forskningen tillämpning av CRISPR Single-guide RNA-baserad genom redigering har gjort det möjligt för forskare att effektivt och billigt förhöra funktionerna i enskilda gener och topologi av genetiska interaktioner nätverk. Förmågan att utföra funktionella genom-wide skärmar har förbättrats avsevärt genom användning av CRISPR-CAS-systemet, särskilt jämfört med tidigare genetiska störningar teknik såsom RNA-interferens (RNAi) och Gene trap mutagenes. I synnerhet lider RNAi av höga off-Target effekter och ofullständig knockdown, vilket resulterar i lägre känslighet och specificitet jämfört med CRISPR3,4,5, medan gen fällor metoder är endast möjligt i haploida celler för förlust av funktion skärmar, begränsa omfattningen av cellmodeller som kan förhörs6. CRISPR förmåga att generera fullständig Gene Knock-Out ger ett mer biologiskt robust system för att förhöra muterade fenotyper, med låg ljudnivå, minimal off-mål effekter och konsekvent aktivitet över reagenser5. CRISPR-Cas9 sgrna-bibliotek som riktar sig till hela människans arvsmassa är nu allmänt tillgängliga, vilket möjliggör samtidig generering av tusentals genknock-outs i ett enda experiment3,7,8,9 .
Vi har utvecklat unika CRISPR-Cas9 genom-omfattande sgRNA lentivirala bibliotek som kallas Toronto knock-out (TKO) bibliotek (tillgängliga via Addgene) som är kompakta och sekvens-optimerade för att underlätta högupplöst funktionell Genomics skärmar. Det senaste biblioteket, TKOv3, mål ~ 18 000 Human protein-kodning gener med 71 090 guider optimerad för redigering effektivitet med hjälp av empiriska data10. Dessutom är TKOv3 tillgänglig som en en-komponent bibliotek (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) uttrycker Cas9 och sgRNAs på en enda vektor, att lindra behovet av att generera stabila Cas9-uttrycker celler, vilket möjliggör genombrett knock-out över ett brett spektrum av däggdjurscell typer. TKOv3 finns även i en vektor utan Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) och kan utnyttjas i celler som uttrycker Cas911.
En genombred, CRISPR-Cas9-redigerad cellpopulation kan exponeras för olika tillväxtförhållanden, med överflödet av sgRNAs över tid som kvantifierats genom nästa generations sekvensering, vilket ger en avläsning för att bedöma avhopp eller berikning av celler med spårbar genetisk Störningar. CRISPR knock-out bibliotek kan utnyttjas för att identifiera gener som vid störning, orsaka cellulära Fitness defekter, måttlig läkemedels känslighet (t. ex. känsliga eller resistenta gener), reglera proteinuttryck (t. ex., reporter), eller krävs för en viss Pathway funktion och cellulära tillstånd12,13,14. Till exempel, differentiell Fitness skärmar i en cancer cell linje kan identifiera både utarmning eller minskning av onkogener och berikning eller en ökning av tumör dämpning gener3,14,15. På samma sätt, med hjälp av mellanliggande doser av terapeutiska läkemedel kan avslöja både läkemedelsresistens och sensibilisering gener16,17.
Tillhandahålls här är ett detaljerat screening protokoll för genomskala CRISPR-Cas9 förlust-av-funktion screening med Toronto knock-out bibliotek (TKOv1 eller v3) i däggdjursceller från bibliotek generation, screening prestanda till dataanalys. Även om detta protokoll har optimerats för screening med Toronto knock-out bibliotek, det kan tillämpas och bli skalbar till alla CRISPR sgRNA poolade bibliotek.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 micron filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C plate incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C shaking incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N Hydrochloric acid solution</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>HCL666.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-light transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cel culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>90293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>recommend passage number &#60;15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer to enhance transduction efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plates with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0544L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G (envelope plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 (packaging plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>400-160-UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C recovery medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRB Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #90203</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #125517</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard genomic DNA purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06 365 809 001</td>
			<td>Lipid based transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells

Genom redigering med hjälp av CRISPR-CAS-systemet har mycket avancerat förmågan att exakt redigera arvsmassan hos olika organismer. I samband med däggdjursceller utgör denna teknik ett nytt sätt att utföra genetiska skärmar av genomomfattande form för funktionella genomik-studier. Bibliotek av guide RNAs (sgRNA) som riktar sig till alla öppna läsramar tillåter den facile generationen av tusentals genetiska störningar i en enda pool av celler som kan screenas för specifika fenotyper att implikera genfunktion och cellulära processer i en opartisk och systematisk sätt. CRISPR-CAS skärmar ger forskarna en enkel, effektiv och billig metod för att avslöja den genetiska ritningar för cellulära fenotyper. Dessutom kan differentiell analys av skärmar som utförs i olika cellinjer och från olika cancertyper identifiera gener som är kontextuellt viktiga i tumörceller, avslöjar potentiella mål för specifika cancerbehandlingar. Att utföra genomomfattande skärmar i mänskliga celler kan vara skrämmande, eftersom detta innebär hantering av tiotals miljoner celler och kräver analys av stora mängder data. Detaljerna för dessa skärmar, till exempel cellinskarakterisering, CRISPR-biblioteksöverväganden och förståelse av CRISPR-teknikens begränsningar och möjligheter under analys, förbises ofta. Här finns ett detaljerat protokoll för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 baserade skärmar.

Översikt över genomskalningsarbetsflödet för CRISPR
Figur 1 illustrerar en översikt över det POOLADE CRISPR-screeningflödet, som börjar med infektion av målceller med CRISPR Library lentivirus vid en låg Moi för att säkerställa en enda integrations händelse och adekvat biblioteks representation (typiskt 200-till 1000 -Fold). Efter infektion, celler behandlas med antibi...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells (Video) | JoVE

CRISPR-Cas9 teknik ger en effektiv metod för att exakt redigera däggdjur arvsmassan i någon celltyp och representerar ett nytt sätt att utföra genomomfattande genetiska skärmar. Ett detaljerat protokoll som diskuterar de steg som krävs för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 skärmar finns här.

Poolade CRISPR-baserade genetiska skärmar i däggdjursceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPR-skärmade avhoppsskärmar ger forskarna en enkel, effektiv och billig metod för att förhöra kedjefunktionen på genomet.wide level. Fördelen med CRISPR är dess smidighet att redigera vilken gen som helst genom att helt enkelt ändra guidesekvensen. CRISPR guide bibliotek gör det möjligt för forskare att förhöra hela genomet av någon organism i ett experiment på ett opartiskt, systematiskt sätt.För närvarande används CRISPR-skärmar för att identifiera viktiga gener över hundratals mänskliga cancerformer och för att kartlägga genetiska interaktioner. Skärmar kan också utförligt profil droger för att avslöja läkemedelsmekanismer för åtgärder. Crispr-biblioteken som beskrivs här riktar sig mot mänskliga celler.Men guidebibliotek som riktar sig till andra arter, till exempel mus, är tillgängliga och kan visas på samma sätt. Att utföra genomomfattande skärmar i mänskliga celler kan vara skrämmande i praktiken, eftersom det innebär hantering av tiotals miljoner i celler och kräver analys av stora uppsättningar data. Innan du startar en skärm, se till att cellinjer noggrant karakteriseras.Detta inkluderar att veta renhet din cellinje, fördubbling tid, lentivirus transduktion effektivitetsvinster, och känslighet för antibiotika urval agenter. En visuell demonstration kommer att ge en bild av hur man praktiskt taget hantera de miljontals celler som krävs i en skärm och hålla reda på tusentals perturbations på ett systematiskt sätt. Demonstrerar proceduren blir Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh, och Ryan Climie, alla tekniker från mitt laboratorium.Börja med att omvandla den färdiga CRISPR sgRNA-plasmiden till elektrokompetenta celler och odla dem enligt manuskriptriktningar. När du är redo att skörda kolonierna, tillsätt sju milliliter LB med carbenicillin till varje platta och skrapa av kolonierna med cellspridaren. Använd en 10-milliliterpipett för att överföra de skrapade cellerna till en steril enliters konisk kolv och skölj plattan med fem milliliter LB med karbaticillin.Återigen, överför sköljlösningen till kolven. Centrifugera cellerna enligt manuskriptet riktningar, och sedan, bestämma vikten av den våta pelleten. Rena plasmid-DNA:t med hjälp av en Maxi- eller Megaskala plasmidreningssats.Förbered celler för transfektion genom att så 293 T-celler och inkubera dem över natten. På nästa dag, förbereda de tre transfektionsplasmid blandningen för 15-centimeter plattor. Beräkna mängden plasmid som behövs för en transfektion och gör en blandning av plasmider för antalet plattor, plus en, som ska transfekteras.Därefter förbereda en lipid-baserade transfection reagens för varje transfection och alikvotera serum media i enskilda 1,5-milliliter microcentrifug rör för antalet plattor som ska transfekteras. Tillsätt transfektionsreagensen, blanda försiktigt och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Efter inkubationen, tillsätt DNA till transfektionsreagensen vid ett tre till ett förhållande mellan transfection-reagens till mikrogram DNA-komplex.Blanda lösningen försiktigt och låt bli rumstemperaturen i 30 minuter. Tillsätt transfektionsblandningen i förpackningsceller och inkubera dem enligt manuskriptriktningar. På dagen för viral skörd, kontrollera cellerna för onormal och smält morfologi som en indikation på god virusproduktion, och skörda lentivirus genom att samla supernatant och överföra den till en steril centrifugrör.Börja med att välja CRISPR-guidens RNA-bibliotekstäckning som ska upprätthållas under hela skärmen. Baserat på bibliotekets täckning, bestämma antalet celler som krävs för att upprätthålla den per guide RNA och antalet celler som krävs för infektion vid MOI 0,3. Därefter bestämma antalet plattor som krävs för att ställa in infektionen och sedan, skörda och utsäde cellerna till varje platta.Lägg till hexadimetrine bromid till alla plattor och lägga till den nödvändiga volymen av virus för att screening och kontroll två plattor. Lägg inte till virus för att kontrollera en. Ersätt den volymen med media.Blanda plattorna noggrant genom att luta och placera plattorna i en inkubator, se till att de är jämna. Skörda infekterade celler enligt manuskriptriktningar och samla in tre replikat av cellpellets från de poolade cellerna för genomisk DNA-extraktion. Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i fem minuter och tvätta dem med PBS.Märk rören och frys torrt cellpelletsen vid minus 80 grader Celsius. Dela poolen av infekterade celler till tre replikera grupper, se till att upprätthålla bibliotekstäckning inom varje replikat. Utsäde cellerna i en densitet som normalt skulle användas när expandera dem.Använd samma antal celler för varje replikat och samma totala antal celler mellan replikat. Fortsätt att passage cellerna och skörda tre replikat av cell pellets från varje replikeras av poolade infekterade celler för upp till 15 till 20 cell fördubblingar. Vid varje passage, skörda cellerna från alla plattor i varje replikera med varandra.Märk varje pellet med tids- och replikeringsbeteckningen. Ställ in PCR1 enligt manuskriptriktningar med totalt 100 mikrogram genomiskt DNA vid 3,5 mikrogram genomiskt DNA per 50-mikroliterreaktion och ställ in identiska 50-mikroliterreaktioner för att uppnå önskad täckning. Ställ in en PCR-rörreaktion enligt manuskriptriktningar.Använd fem mikroliter av den poolade PCR1-produkten som en mall och använd unika indexprimerkombinationer för varje enskilt prov för att tillåta poolning av sekvenseringsbibliotekets prover. Efter att du har avslutat PCR kör du PCR-tubprodukten på en 2%agarosgel vid låg spänning i en till 1 1/2 timme. Visualisera produkten på en blå ljus transilluminator och punktskatt 200 basparet bandet.Rena DNA:t och mät dess kvantitet och kvalitet med både en spektrofotometer och en fluorometer. Ett ideal vägleder RNA-arkiv bör ha varje singel vägleder RNA som föreställs på liknande antal. Nästa generations sekvensering kan användas för att bekräfta att biblioteket har en tät distribution av guide RNAs.Precision-recall-analys kan användas för att utvärdera skärmens prestanda. En högpresterande skärm bör återvinna ett stort antal viktiga gener vid en basfaktor större än sex och en falsk upptäcktsfrekvens på mindre än 5% Precision-recall kurvan bör ha en skarp armbåge och en rak linje till terminalpunkten. Bayes-faktorn representerar ett förtroendemått som genen knockout resulterar i en fitness defekt.Höga poäng indikerar ökat förtroende, medan låga poäng tyder på att genen knockout ger tillväxt fördelar. Genome hela knockout pooler kan odlas i närvaro av överskott läkemedel agent för att leta efter suppressor resistens gener. För att utföra en positiv urvalsskärm för suppressor av tymidinblock, är normaliserade läsantal för alla guide RNAs vid T0 plottade mot medelvärde-normaliserade läsantal för tymidinbehandlade prover.En viktig detalj för att framgångsrikt utföra CRISPR-skärmar är att upprätthålla en god distribution av varje guide-RNA, från transfektion av plasmiden till transduktion av celler. Detta kommer att minimera risken för slumpmässiga effekter som kan skeva guide RNA representation och leda till falska positiva eller negativa resultat. Efter en skärmvalidering bör experiment göras för att bekräfta träffar eftersom den primära skärmen endast identifierar potentiella träffar.Beroende på träffarnas biologi kan olika metoder användas. CRISPR-redigering, i kombination med nästa generations sekvensering, har möjliggjort genomskala förlust av funktionsskärmar i olika mänskliga modellsystem. På grund av enkelheten i CRISPR, dessa typer av skärmar är nu i stort sett tillgängliga för alla forskare, vilket gör att fler forskare att använda funktionella genetiska metoder för att studera biologiska processer och sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Genetics

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions (Video) | JoVE

Genmanipulation av växtpatogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Att studera Svamp biologi och växt mikrobinteraktioner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome (Video) | JoVE

Poolade shRNA skärm för reaktivering av MeCP2 på inaktiva X-kromosomen

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells (Video) | JoVE

Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Formaldehyd-assisted isolering av reglerande element till åtgärd kromatin tillgänglighet i däggdjursceller

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens (Video) | JoVE

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines (Video) | JoVE

Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells (Video) | JoVE

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria (Video) | JoVE

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas (Video) | JoVE

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...