Name: pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Bu çalışma Genom Kanada, Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (MOP-142375, PJT-148802) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda özetlenen deneyler, enstitünün Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi yönergelerine uymalıdır.
1. Havuzlu CRISPR sgRNA lentiviral kütüphane plazmid amplifikasyon
<ol><li>Hazır CRISPR sgRNA plazmid DNA kitaplığını TE'de 50 ng/μL'ye seyreltin (örn. TKOv3).</li>
	<li>Elektro-yetersiz hücreleri kullanarak kütüphaneyi elektroporate. Aşağıda açıklandığı gibi toplam dört elektroporasyon reaksiyonu ayarlayın.<ol>
<li>2 μL 50 ng/μL TKO kitaplığına 25 μL ?...

<ol>
	<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms.">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li><li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+(Review).">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+CRISPR/Cas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes.">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+execution,+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR/Cas9+screens.">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knock-out+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies.">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors.">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras.">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions.">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li><li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification.">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li><li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STBL2:+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences.">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li><li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAGEL:+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens.">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).</li><li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ.">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Pedregosa, F. V., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scikit-learn:+Machine+Learning+in+Python.">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li><li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213 (2011).</li><li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Am+I+ready+for+CRISPR?+A+user's+guide+to+genetic+screens.">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li><li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR/Cas9+technology.">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knock-out+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).</li><li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens.">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li><li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells.">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li><li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators:+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays.">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li></ol>

Kullanım kolaylığı ve yüksek esnekliği sayesinde CRISPR teknolojisi hassas genom düzenleme için tercih edilen bir araç olarak yaygın olarak benimsenmiştir. Havuzlu CRISPR taraması, tek bir deneyde binlerce genetik tedirginliği sorgulamak için bir yöntem sağlar. Havuzlu ekranlarda, sgRNA kitaplıkları moleküler barkod görevi görehizmet eder, çünkü her dizi benzersizdir ve hedeflenen genle eşlenir. Genomik DNA'nın hücre popülasyonundan izole edilmesiyle, ilgi fenotipine neden olan genler, sgRNA b...

CRISPR-Cas, kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar ve CRISPR ilişkili nükleaz ın kısaltması, sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) ile kompleks halinde tek bir nükleaz proteininden (örn. Cas9) oluşur. Bu ribonükleoprotein kompleksi Cas9 enzimini hedef alarak belirli bir genomik lokus1'deçift iplikçikli DNA kırıklarına neden olur. Çift iplikli molalar homoloji yönelimli onarım (HDR) veya daha yaygın olarak, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla onarılabilir, sık sık gen fonksiyonunu bozan ekleme ve/veya silme (INDELS) ile sonuçlanan hataya açık bir onarım mekanizması 1. CRISPR'ın etkinliği ve basitliği, önceki genom düzenleme teknolojilerini (örneğin, çinko parmak çekirdekleri (ZNF) veya transkripsiyon aktivatör benzeri efektör çekirdekleri aşan daha önce ulaşılmaz bir genomik hedefleme düzeyisağlar ( TALENS), her ikisi de artan tasarım karmaşıklığı muzdarip, düşük transfection verimliliği, ve multipleks gen düzenleme sınırlamaları2].
CRISPR tek kılavuzLu RNA tabanlı genom düzenleme temel araştırma uygulaması bilim adamları verimli ve ucuza bireysel genlerin işlevlerini ve genetik etkileşim ağlarının topoloji sorgulamak için izin verdi. Özellikle RNA paraziti (RNAi) ve gen kapanı mutagenezi gibi daha önceki genetik pertürbasyon teknolojileri ile karşılaştırıldığında, crispr-Cas sisteminin kullanımı yla fonksiyonel genom çapındaki ekranlar gerçekleştirebilme yeteneği büyük ölçüde artırılmıştır. Özellikle, RNAi yüksek off-hedef etkileri ve eksik nakavt muzdarip, CRISPR göre daha düşük duyarlılık ve özgüllük sonuçlanan3,4,5, gen tuzak yöntemleri haploid sadece uygulanabilir iken fonksiyon kaybı ekranlar için hücreler, sorgulanabilir hücre modellerinin kapsamını sınırlayan6. CRISPR'ın tam gen nakavtı üretme yeteneği, mutant fenotipleri sorgulamak için daha biyolojik olarak sağlam bir sistem sağlar, düşük gürültü, minimum hedef dışı etkiler ve reaktifler arasında tutarlı aktivite5. Tüm insan genomunu hedefleyen CRISPR-Cas9 sgRNA kütüphaneleri artık yaygın olarak mevcuttur, tek bir deneyde binlerce gen nakavtının aynı anda üretilmesine izinverir 3,7,8,9 .
Toronto Knock-out (TKO) kütüphaneleri (Addgene aracılığıyla temin edilebilir) adı verilen ve yüksek çözünürlüklü genomik ekranları kolaylaştırmak için kompakt ve dizi optimize edilmiş benzersiz CRISPR-Cas9 genom çapındaki sgRNA lentiviral kütüphaneler geliştirdik. En son kütüphane, TKOv3, hedef ~ 18,000 insan protein kodlama genleri ile 71.090 kılavuzları ampirik veri10kullanarak düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir. Buna ek olarak, TKOv3 tek bileşenli bir kütüphane olarak kullanılabilir (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) tek bir vektör üzerinde Cas9 ve sgRNA'ları ifade ederek, geniş bir yelpazede genom çapında nakavt sağlayan, kararlı Cas9 ifade eden hücreler üretme ihtiyacını hafifleterek memeli hücre tipleri. TKOv3 cas9 olmadan bir vektör de mevcuttur (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID # 125517) ve Cas911ifade hücrelerde kullanılabilir.
Genom çapında crispr-Cas9 düzenlenmiş hücre popülasyonu farklı büyüme koşullarına maruz kalabilir, zaman içinde sgRNA bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür, izlenebilir genetik hücrelerin terk veya zenginleşmesi değerlendirmek için bir okuma sağlayan tedirginlikler. CRISPR nakavt kütüphaneleri, tedirginlik üzerine hücresel fitness bozukluklarına, orta derecede ilaç duyarlılığına (örneğin, hassas veya dirençli genler) neden olan, protein ekspresyonunu (örn. muhabir) düzenleyen veya belirli bir yol fonksiyonu ve hücresel durum12,13,14. Örneğin, bir kanser hücresi hattında diferansiyel fitness ekranları hem tükenmesi veya onkogenlerin azaltılması ve zenginleştirme veya tümör bastırıcıgenler genlerin bir artış tespit edebilirsiniz3,14,15. Benzer şekilde, terapötik ilaçların ara dozlarda kullanarak hem ilaç direnci ve duyarlılık genleri ortaya çıkarabilir16,17.
Burada verilen genom ölçekli CRISPR-Cas9 fonksiyon kaybı tarama için ayrıntılı bir tarama protokolü Toronto Knock-out kütüphaneleri kullanarak (TKOv1 veya v3) kütüphane nesil memeli hücrelerde, veri analizi için tarama performansı. Bu protokol Toronto Knock-out kitaplıkları kullanılarak tarama için optimize edilmiş olsa da, uygulanabilir ve tüm CRISPR sgRNA havuzlu kütüphaneler için ölçeklenebilir hale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 micron filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C plate incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C shaking incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N Hydrochloric acid solution</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>HCL666.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-light transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cel culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>90293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>recommend passage number &#60;15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer to enhance transduction efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plates with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0544L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G (envelope plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 (packaging plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>400-160-UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C recovery medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRB Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #90203</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #125517</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard genomic DNA purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06 365 809 001</td>
			<td>Lipid based transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells

CRISPR-Cas sistemini kullanarak genom düzenleme, çeşitli organizmaların genomlarını tam olarak düzenleme yeteneğini büyük ölçüde ilerletmiştir. Memeli hücreleri bağlamında, bu teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç temsil eder. Tüm açık okuma çerçevelerini hedefleyen kılavuz RNA'ların (sgRNA) kütüphaneleri, gen fonksiyonunu ve hücresel süreçleri bir tarafsız ve sistematik bir şekilde. CRISPR-Cas ekranlar, araştırmacılara hücresel fenotiplerin genetik planlarını ortaya çıkarmak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. Ayrıca, çeşitli hücre hatları ve farklı kanser türlerinde gerçekleştirilen ekranların diferansiyel analizi tümör hücrelerinde bağlamsal olarak gerekli olan genleri belirleyebilir, belirli antikanser tedavileri için potansiyel hedefleri ortaya koymaktadır. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak göz korkutucu olabilir, çünkü bu on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirir ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirir. Hücre satırı karakterizasyonu, CRISPR kitaplık konuları ve analiz sırasında CRISPR teknolojisinin sınırlamalarını ve yeteneklerini anlama gibi bu ekranların ayrıntıları genellikle göz ardı edilir. Burada havuzlu genom çapında CRISPR-Cas9 tabanlı ekranların başarılı performans için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Genom ölçeğinde CRISPR tarama iş akışına genel bakış
Şekil 1, tek entegrasyon olayları ve yeterli kütüphane gösterimi (genellikle 200- 1000) sağlamak için düşük bir MOI CRISPR kütüphane lentivirus ile hedef hücrelerin enfeksiyonu ile başlayan, havuzlu CRISPR tarama iş akışı genel bir bakış göstermektedir -katlayın). Enfeksiyon dan sonra, hücreler tran...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells (Video) | JoVE

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPR ekranlı açılır ekranlar, araştırmacılara genom genelindeki zincir fonksiyonunu sorgulamak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. CRISPR'ın avantajı, kılavuz dizisini değiştirerek herhangi bir geni düzenleme becerisidir. CRISPR rehber kütüphaneleri, araştırmacıların bir deneyde herhangi bir organizmanın tüm genomunu tarafsız ve sistematik bir şekilde sorgulamalarına olanak tanır.Şu anda, CRISPR ekranlar insan kanserleri yüzlerce arasında temel genleri belirlemek ve genetik etkileşimleri haritalamak için kullanılmaktadır. Ekranlar da kapsamlı eylem uyuşturucu mekanizmaları ortaya çıkarmak için ilaçların profilini çıkarabilirsiniz. Burada açıklanan CRISPR kütüphaneleri insan hücrelerini hedef almaktadır.Ancak, fare gibi diğer türleri hedefleyen kılavuz kitaplıklar kullanılabilir ve benzer şekilde taranabilir. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak, on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirdiği ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirdiği için pratikte yıldırıcı olabilir. Bir ekrana başlamadan önce, hücre çizgilerinin dikkatle karakterize edildiklerinin sağlanmasını sağlayın.Bu hücre hattının saflığını bilmek içerir, iki katına zaman, lentivirus transdüksiyon verimliliği, ve antibiyotik seçimi ajanları için duyarlılıkları. Görsel bir gösteri, bir ekranda gereken milyonlarca hücreyi pratik olarak nasıl işleyeceğiniz ve binlerce tedirginliğin sistematik bir şekilde nasıl izleyeceğinin bir resmini sağlayacaktır. Prosedürü gösteren Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh ve Ryan Climie, benim laboratuvar tüm teknisyenler olacaktır.Hazır CRISPR sgRNA plazmidini elektroyit hücrelere dönüştürerek ve el yazması talimatlara göre büyüterek başlayın. Kolonileri hasat hazır olduğunda, her plaka carbenicillin ile LB yedi mililitre ekleyin ve hücre yayıcı ile kolonileri kazıyın. Kazınmış hücreleri steril bir litrelik konik şişeye aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve plakayı beş mililitre LIK LB ile karbenicillin ile durulayın.Yine, şişeye durulama çözeltisi aktarın. Hücreleri el yazması yönlere göre santrifüj edin ve sonra ıslak peletin ağırlığını belirleyin. Plazmid DNA'sını Maxi veya Mega ölçekli plazmid arınma kiti kullanarak arındırın.293 T-hücresi tohumlayarak ve bir gecede kuluçkaya yatarak hücreleri transfeksiyoniçin hazırlayın. Ertesi gün, 15 santimetreplakalar için üç transfection plazmid karışımı nı hazırlayın. Bir transfeksiyon için gerekli plazmid miktarını hesaplayın ve plaka sayısı için plazmidkarışımı yapmak, artı bir, transfected için.Daha sonra, her transfeksiyon için bir lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve aliquot azaltılmış serum media için tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere transfected plaka sayısı için hazırlayın. Transfeksiyon reaktifini ekleyin, hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra transfeksiyon reaktifine DNA kompleksinin mikrogramlarına 3-1 oranında DNA ekleyin.Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Transfeksiyon karışımını ambalaj hücrelerine ekleyin ve el yazması talimatlara göre kuluçkaya yatırın. Viral hasat gününde, iyi bir virüs üretiminin bir göstergesi olarak anormal ve erimiş morfoloji için hücreleri kontrol edin ve supernatant toplayıp steril bir santrifüj tüpüne aktararak lentivirus hasat.Ekran boyunca muhafaza edilecek CRISPR kılavuzu RNA kitaplık kapsamını seçerek başlayın. Kitaplık kapsamına bağlı olarak, kılavuz RNA başına korumak için gereken hücre sayısını ve MOI 0.3'te enfeksiyon için gereken hücre sayısını belirleyin. Daha sonra, enfeksiyonu kurmak için gerekli plaka sayısını belirleyin ve sonra, hasat ve her plaka hücreleri tohum.Tüm plakalara hexadimethrine bromür ekleyin ve tarama ve kontrol iki plaka için virüs gerekli hacmi ekleyin. Kontrol etmek için virüs eklemeyin. Bu ses düzeyini medyayla değiştirin.Plakaları yatırarak iyice karıştırın ve plakaları bir kuvöze yerleştirin ve düz olduğundan emin olun. El yazması talimatlara göre enfekte hücreleri hasat ve genomik DNA çıkarma için havuzlu hücrelerden hücre peletlerinin üç kopya toplamak. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve PBS ile yıkayın.Tüpleri etiketle ve hücre peletlerini eksi 80 derecede kurutun. Virüslü hücre havuzunu üç çoğaltma grubuna bölün ve her çoğaltma içinde kitaplık kapsamını koruduğundan emin olun. Hücreleri genişletirken normalde kullanılacak bir yoğunlukta tohumlayın.Her çoğaltma için aynı sayıda hücre ve çoğaltmalar arasında aynı toplam hücre sayısını kullanın. Hücreleri geçiş ve 15 ila 20 hücre iki katına kadar havuzlu enfekte hücrelerin her çoğaltma hücre pelet üç çoğaltma hasat devam edin. Her geçitte, her bir tabaktaki hücreleri birbiriyle çoğaltın.Her peleti zamana göre etiketlendirin ve atamayı çoğaltın. 50 mikrolitrelik reaksiyon başına 3,5 mikrogram genomik DNA'da toplam 100 mikrogram genomik DNA ile el yazması talimatlara göre PCR1'i kurun ve istenilen kapsama alanını elde etmek için aynı 50 mikrolitrelik reaksiyonları ayarlayın. El yazması talimatlara göre bir PCR tüp reaksiyonu ayarlayın.Bir şablon olarak havuza alınan PCR1 ürününün beş mikrolitresini kullanın ve sıralama kitaplığı örneklerinin biraraya getirmek için her bir örnek için benzersiz dizin astar kombinasyonları kullanın. PCR'yi tamamladıktan sonra, PCR tüp ürününü 1 ila 1/2 saat düşük voltajda %2 agarose jel üzerinde çalıştırın. Ürünü mavi ışık transilluminator üzerinde görselleştirin ve 200 baz çifti bandını çıkarın.DNA'yı arındırın ve hem spektrofotometre hem de florometre ile miktarını ve kalitesini ölçün. İdeal bir kılavuz RNA kitaplığı her bir kılavuz RNA benzer miktarlarda temsil olmalıdır. Yeni nesil sıralama, kitaplığın kılavuz RNA'larının sıkı bir dağılımına sahip olduğunu doğrulamak için kullanılabilir.Hassas hatırlama çözümlemesi ekran performansını değerlendirmek için kullanılabilir. Yüksek performanslı bir ekran, altıdan daha büyük bir baz faktöründe çok sayıda temel geni kurtarmalı ve %5'ten daha az bir yanlış keşif hızı hassas geri çağırma eğrisi keskin bir dirseğe ve terminal noktasına doğru düz bir çizgiye sahip olmalıdır. Bayes faktörü gen nakavt bir fitness kusuru sonuçları bir güven ölçüsü temsil eder.Yüksek skorlar güvenin arttığını gösterirken, düşük puanlar gen nakavtın büyüme avantajları sağladığını göstermektedir. Genom çapında nakavt havuzları bastırıcı direnç genleri aramak için aşırı ilaç ajan varlığında kültürlü olabilir. Timidin bloğunun bastırıcısı için pozitif bir seçim ekranı gerçekleştirmek için, T0'daki tüm kılavuz RNA'lar için normalleştirilmiş okuma sayıları, timidin ile tedavi edilen numuneler için ortalama normalleştirilmiş okuma sayılarına göre çizilir.CRISPR ekranlarının başarılı bir şekilde performans göstermesinin önemli bir ayrıntısı, plazmidin transdüksiyonundan hücrelerin transdüksiyonuna kadar her kılavuz RNA'nın iyi dağılımını sağlamaktır. Bu kılavuz RNA gösterimi çarpık ve yanlış pozitif veya olumsuz sonuçlara yol açabilir rasgele etkileri olasılığını en aza indirecektir. Bir ekran doğrulamasını takiben, birincil ekran yalnızca olası isabetleri tanımladığından, isabetleri doğrulamak için denemeler yapılmalıdır.Vuruşların biyolojisi bağlı olarak çeşitli yöntemler kullanılabilir. CRISPR düzenleme, yeni nesil sıralama ile birlikte, çeşitli insan modeli sistemlerinde fonksiyon ekranlarının genom ölçeğinde kaybına olanak sağlamıştır. CRISPR basitliği nedeniyle, ekranlar bu tür artık geniş tüm araştırmacılar için erişilebilir, daha fazla bilim adamı biyolojik süreçler ve hastalık çalışma için fonksiyonel genetik yöntemler kullanmak için izin.

Research

JoVE Journal

Genetics

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions (Video) | JoVE

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome (Video) | JoVE

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells (Video) | JoVE

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens (Video) | JoVE

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines (Video) | JoVE

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells (Video) | JoVE

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria (Video) | JoVE

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas (Video) | JoVE

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...