Name: measuring sperm guidance and motility within the caenorhabditis elegans hermaphrodite reproductive tract
Uploaded: 2019-06-06T15:00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract at JoVE.com

ونحن نشكر بإخلاص مرشدنا الراحل ، الدكتور مايكل ميلر ، علي إرشاده الملهم ونكران الانانيه وإنشاءه لهذه الطريقة كاداه لفهم الاتصالات المنوية والبويضات بشكل أفضل. وقد كانت وفاته المفاجئة خسارة هائله لعائلته ، ومختبره ، والمجتمع العلمي. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة (R01GM085105 إلى MAM و F30HD094446 إلى MH). والمضمون هو المسؤولية الوحيدة للمؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

<ol>
	<li>Boryshpolets, S., Perez-Cerezales, S., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mechanism+of+human+sperm+in+thermotaxis:+a+role+for+hyperactivation.">Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: a role for hyperactivation.</a> Human Reproduction. 30 (4), 884-892 (2015).</li><li>Edmonds, J. W., McKinney, S. L., Prasain, J. K., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gap+junctional+protein+INX-14+functions+in+oocyte+precursors+to+promote+C.+elegans+sperm+guidance.">The gap junctional protein INX-14 functions in oocyte precursors to promote C. elegans sperm guidance.</a> Developmental Biology. 359 (1), 47-58 (2011).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Developmental Cell. 19 (6), 858-871 (2010).</li><li>Espinal-Enriquez, J., Priego-Espinosa, D. A., Darszon, A., Beltran, C., Martinez-Mekler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+model+predicts+that+CatSper+is+the+main+Ca(2+)+channel+in+the+regulation+of+sea+urchin+sperm+motility.">Network model predicts that CatSper is the main Ca(2+) channel in the regulation of sea urchin sperm motility.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4236 (2017).</li><li>Hunter, R. H., Nichol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preovulatory+temperature+gradient+between+the+isthmus+and+ampulla+of+pig+oviducts+during+the+phase+of+sperm+storage.">A preovulatory temperature gradient between the isthmus and ampulla of pig oviducts during the phase of sperm storage.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 77 (2), 599-606 (1986).</li><li>Hussain, Y. H., Guasto, J. S., Zimmer, R. K., Stocker, R., Riffell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+chemotaxis+promotes+individual+fertilization+success+in+sea+urchins.">Sperm chemotaxis promotes individual fertilization success in sea urchins.</a> Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 10), 1458-1466 (2016).</li><li>Kantsler, V., Dunkel, J., Blayney, M., Goldstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheotaxis+facilitates+upstream+navigation+of+mammalian+sperm+cells.">Rheotaxis facilitates upstream navigation of mammalian sperm cells.</a> Elife. 3, e02403 (2014).</li><li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo.">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1143-1148 (2006).</li><li>Miki, K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheotaxis+guides+mammalian+sperm.">Rheotaxis guides mammalian sperm.</a> Current Biology. 23 (6), 443-452 (2013).</li><li>Ting, J. J., Tsai, C. N., Schalkowski, R., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Contributions+to+Ectopic+Sperm+Cell+Migration+in+Caenorhabditis+Nematodes.">Genetic Contributions to Ectopic Sperm Cell Migration in Caenorhabditis Nematodes.</a> G3. 8 (12), 3891-3902 (2018).</li><li>Yanagimachi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+guidance+of+fish+spermatozoa+into+the+egg+through+the+micropyledagger,+double+dagger.">Chemical and physical guidance of fish spermatozoa into the egg through the micropyledagger, double dagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (4), 780-799 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Gradients+on+a+Microfluidic+Device:+Toward+a+High-Throughput+Investigation+of+Spermatozoa+Chemotaxis.">Generation of Gradients on a Microfluidic Device: Toward a High-Throughput Investigation of Spermatozoa Chemotaxis.</a> PloS One. 10 (11), e0142555 (2015).</li><li>Hoang, H. D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+and+hyperoxia+circuits+in+C.+elegans+males+influence+sperm+navigational+capacity.">Chemosensory and hyperoxia circuits in C. elegans males influence sperm navigational capacity.</a> PLoS Biology. 15 (6), e2002047 (2017).</li><li>Hansen, J. M., Chavez, D. R., Stanfield, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMP-1+promotes+competitive+advantage+of+nematode+sperm.">COMP-1 promotes competitive advantage of nematode sperm.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>L&#39;Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-14 (2006).</li><li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation.">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291 (5511), 2144-2147 (2001).</li><li>Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+oocyte+meiotic+maturation+and+fertilization.">Control of oocyte meiotic maturation and fertilization.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-12 (2005).</li><li>O'Hagan, R., Wang, J., Barr, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behavior,+male+sensory+cilia,+and+polycystins+in+Caenorhabditis+elegans.">Mating behavior, male sensory cilia, and polycystins in Caenorhabditis elegans.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 33, 25-33 (2014).</li><li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogeneous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+Caenorhabditis+elegans+reproductive+tract.">A heterogeneous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the Caenorhabditis elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).</li><li>McKnight, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosensory+perception+of+environmental+cues+modulates+sperm+motility+critical+for+fertilization.">Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization.</a> Science. 344 (6185), 754-757 (2014).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Chatterjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+fertility+decline+in+aging+C.+elegans+males+is+associated+with+mating+execution+deficits+rather+than+diminished+sperm+quality.">Dramatic fertility decline in aging C. elegans males is associated with mating execution deficits rather than diminished sperm quality.</a> Experimental Gerontology. 48 (11), 1156-1166 (2013).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , 80-90 (2017).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos.">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+paternal+mitochondrial+elimination+in+Caenorhabditis+elegans.">Kinetics and specificity of paternal mitochondrial elimination in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 7, 12569 (2016).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis.">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li><li>Mottram, L. F., Forbes, S., Ackley, B. D., Peterson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+analogues+of+rhodamine+B+and+rhodamine+101:+potent+fluorescent+probes+of+mitochondria+in+living+C.+elegans.">Hydrophobic analogues of rhodamine B and rhodamine 101: potent fluorescent probes of mitochondria in living C. elegans.</a> Beilstein Journal of Organic Chemistry. 8, 2156-2165 (2012).</li><li>Singson, A., Hill, K. L., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+in+the+absence+of+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans.">Sperm competition in the absence of fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 152 (1), 201-208 (1999).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+development+and+motility+are+regulated+by+PP1+phosphatases+in+Caenorhabditis+elegans.">Sperm development and motility are regulated by PP1 phosphatases in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 190 (1), 143-157 (2012).</li><li>Seidel, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+sperm-delivered+toxin+causes+late-stage+embryo+lethality+and+transmission+ratio+distortion+in+C.+elegans.">A novel sperm-delivered toxin causes late-stage embryo lethality and transmission ratio distortion in C. elegans.</a> PLoS Biology. 9 (7), e1001115 (2011).</li></ol>

ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.

قدره السائل المنوي علي التنقل في المسالك التناسلية الانثويه الملتوية والعثور علي البويضات أمر بالغ الاهميه للاستنساخ الجنسي. تشير الدراسات الحديثة باستخدام السائل المنوي للحيوانات المخصبة داخليا إلى انها تستجيب بنشاط للإشارات البيئية المختلفة ، بما في ذلك الإشارات الكيميائية وتدفق السوائل وتدرجات درجه الحرارة1و5و7 9 , 12-بيد ان هذه الملاحظات نتجت إلى حد كبير عن التجارب المختبرية ولم يعرف سوي القليل عن سلوك النطاف والاتصالات داخل الجهاز التناسلي. ومن العوائق الرئيسية التي تحول دون الحصول علي البيانات المجرية عن هجره السائل المنوي وحركيته انعدام الرؤية في معظم المناطق الانجابيه للإناث. الطريقة التي وصفناها هنا باستخدام c. اليجس يتغلب علي هذا القيد. كما تظهر النتائج التمثيلية ، فان البشرة الشفافة تسمح بالتصور المباشر وتتبع كل السائل المنوي عند دقه الخلية الواحدة في كائن حي وسليم.
جيم- اليجان له جنسان. الذكور ، مع النمط الجيني XO ، تنتج فقط السائل المنوي ، وفي هذا الأسلوب ، وتستخدم كمتبرعين العنبر. المخنثين ، مع النمط الجيني XX ، يتم تعديل الإناث. الغدد التناسلية الخاصة بهم الخضوع لأول مره النطاف خلال مرحله اليرقات الرابعة والتحول إلى oogenesis في سن الرشد25. يستخدم هذا الفحص المخنثين الكبار ، الذين توفر الانسجه الانجابيه نموذجا للجهاز التناسلي الأنثوي. استخدام كلا الجنسين في هذا الفحص يسمح لنا لتحديد المسارات الوراثية والجزيئية في كل من الذكور والإناث التي قد تنظم توجيه السائل المنوي والحركية. بالاضافه إلى المجموعة الكاملة من التقنيات الوراثية والجزيئية المتاحة ل c. اليجايليس، يمكن ان يؤدي هذا الأسلوب إلى رؤى جديده في هجره المني وحركيته وكذلك السائل المنوي والاتصال بالبويضات.
وهناك بضع خطوات حاسمه في هذا البروتوكول تستدعي مزيدا من النظر ، بالاضافه إلى التفاصيل الواردة في القسم الخاص بالبروتوكول.
الديدان الضباب-2 (q71)، وهو-5 (e1490)، أو له-8 (e1489) الذكور متحولة يمكن استخدامها بدلا من الذكور N2. هذه الطفرات زيادة وتيره الذكور في الثقافات ، ولكن لا تؤثر علي التزاوج الذكور أو وظائف العنبر13. الإناث ، مثل الضباب-2 (q71) الإناث ، ويمكن استخدامها بدلا من المخنثين. ومع ذلك ، يجب ان تكون الإناث قبل تزاوج مع الذكور للسماح التنمية البويضة السليمة. ان وجود الاجنه المخصبة من هذا التزاوج المسبق يضمن أيضا ان الرحم طويل بما يكفي لتقييم توزيع السائل المنوي بشكل صحيح. إذا تم تقييم متحولة أو الخنثى التجريبية ، وتشمل مجموعه (ق) السيطرة. علي سبيل المثال ، يجب ان يقترن متحولة المخنثين مع النوع الوحشي N2 المخنثين كعنصر تحكم للمتغيرات الأخرى في الفحص. وينبغي أيضا ان تغذي البكتيريا التي تم تغذيتها بالبكتيريا التي تحتوي علي البلازميدات لاختبارات تداخل الحمض الريبي النيبالي ببكتريا تحتوي علي مكافحه النواقل الفارغة. المسافة من الفرج ، حيث يتم تلقيح السائل المنوي ، إلى spermatheca ، موقع الإخصاب ، يمكن ان تختلف تبعا لعدد البيض في الرحم (اي ، الرحم يتوسع مع زيادة عدد البيض). إذا تم اجراء مقارنات بين الأنماط الجينية ، حدد المخنثين الذين تحتوي الرحم علي اعداد مماثله من البيض. لا تقم بتحديد الخنثى التي تحتوي علي أجنه الفقس أو اليرقات المتحركة. ويمكن القيام بدوره زمنيه لتحديد العمر الأمثل الذي يجب ان يكون فيه المخنثين.
انتقاء المخنثين والذكور ومن المهم ان المخنثين التقطت لهذا الفحص ليست من لوحات متضخمة أو تجويع. الغذاء والعظة فرمون تعدل التعبير عن DAF-7 ، وهو TGFß homolog. وقد أظهرت المسار DAF-7 تنظيم تخليق السلسلة F-البروستاغلينات التي تلعب دورا هاما في توجيه السائل المنوي إلى spermatheca20. قد يؤدي قطف المخنثين من الصفائح المكتظة أو المتعطشة إلى عدم توجيه السائل المنوي الضعيف المرتبط بهدف الاهتمام. كثافة لوحات لا يبدو ان تؤثر علي السائل المنوي الذكور. ومع ذلك ، فان الذكور الذين هم صغار جدا أو كبار السن قد يؤدي إلى انخفاض كفاءه التزاوج (اي النسبة المئوية من الخنثى علي لوحه التزاوج التي لديها ما يكفي من السائل المنوي في الرحم لقياس). 1-3 الذكور البالغين من العمر اليوم هي الأمثل لهذا الفحص23.
تخدير المخنثين في ايدينا ، والجمع بين تيترايسوزول و Tricaine يضمن ان يتم تعبئة الديدان ، وتبقي علي قيد الحياة اثناء التزاوج واكتساب الصورة. ويمكن أيضا استخدام التخدير الأخرى ، مثل الصوديوم الأزيد. ومع ذلك ، فان أزيد الصوديوم شديد السمية ويجب توحيد الظروف. لا ينصح بتقنيات التعبئة باستخدام الخرز المجهري ، والحجرات الصغيرة ، وغرف ميكروفلويديكس لأنها تتداخل مع التزاوج.
الذكور تلطيخ وقد استخدمت لصبغ ميتو المستخدمة في هذه المخطوطة ، MitoTrackerCMXRos ، علي نطاق واسع لوضع العلامات المنوية ، فضلا عن الميتوكوندريا الأخرى ، في c. اليجايليس. السائل المنوي المسمي مع هذا ميتو صبغ يعمل بشكل كامل ، والحفاظ علي قدرته علي تنشيط ، والهجرة ، تسميد البويضات ، وإنتاج ذريه قابله للحياة26،27. وقد استخدمت الاصباغ الميتوكوندريا الأخرى, مثل رونامامين 6g و DiOC6 لوصمه العار c. اليجس الميتوكوندريا28,29. ومع ذلك ، الشروط لهذه الاصباغ تحتاج إلى ان تكون موحده لوضع العلامات المنوية في هذا الفحص. بالاضافه إلى أليات الوسم mitochrondrial ، والبقع الحمض النووي ، مثل Syto17 ، ويمكن أيضا ان تستخدم لتسميه السائل المنوي لاختبارات الهجرة30. في حين ان هذه التقنيات الوسم هي سهله نسبيا وسريعة لأداء, ويمكن أيضا ان تستخدم استراتيجيات المحورة وراثيا لتوليد السائل المنوي التي تعبر عن علامات الفلورسنت تحت المروجين محدده31,32.
التزاوج التزاوج النقاط التي هي سميكه جدا قد يقلل من كفاءه التزاوج. وينبغي توخي الحذر لنقل البكتيريا الصغيرة قدر الإمكان عند نقل الذكور وتخدير المخنثين علي نقطه التزاوج.
جعل منصات اجثار ووضع زلة الغطاء فقاعات الهواء يمكن ان تتولد في منصات اجبرزت. وقد ينكسر الضوء اثناء الحصول علي الصورة أو ، عندما يكون كبيرا بما فيه الكفاية ، يتسبب في سقوط الديدان ، مما يجعل من المستحيل الحصول علي الصورة (الصور). المثل ، قد يتم إنشاء فقاعات الهواء علي طول الخنثى عندما يتم وضع زلة الغطاء عليها علي وساده اجبرزت. هذه الفقاعات ينكسر الضوء ويؤدي إلى انخفاض جوده الصورة. الممارسة سوف تساعد علي تقليل حدوث فقاعات الهواء.
التحديد الكمي عند التحديد الكمي لتوزيع السائل المنوي ، قد يكون لمختلف الطائرات z من خلال رحم الدودة اختلافات طفيفه في توزيع السائل المنوي. نجد ان أخذ صوره واحده تركز علي spermatheca يعطينا نتائج قابله للتكرار مشابهه للنتائج التي تم الحصول عليها من خلال المتوسط عده أقسام z. نوصي بتركيز الصورة علي مركز الspermatheca ، ولكن يمكن تغيير الطائرات المحورية قليلا استنادا إلى احتياجات المجرب. بيد انه من الاهميه بمكان ان تؤخذ جميع الصور بنفس الطريقة. وعلاوة علي ذلك ، من المهم ان يتم احتساب فقط السائل المنوي التي هي في التركيز. انها السلطة التقديرية المضادة في تحديد معايير السائل المنوي في التركيز. غير انه من الاهميه بمكان ان تطبق المعايير بصوره منهجيه علي كل دوده يتم تحديدها كميا. لتتبع النطفة ، والعديد من البرامج توفر قدرات التتبع التلقائي. ومع ذلك ، نجد ان التتبع اليدوي يتفوق علي خوارزميه التتبع التلقائي للبرنامج لسببين رئيسيين: 1) وفره من نوى بالمثل الحجم داخل المساحة المحصورة يجعل من الصعب علي البرنامج للتمييز بين السائل المنوي الفردية وإنشاء ROIs محدده لكل السائل المنوي. 2) كما يذهب السائل المنوي في والخروج من التركيز ، والتحول كثافتها ، مما يجعل من الصعب علي البرنامج لتتبع السائل المنوي علي مدي فترات طويلة من الزمن.

أليات الجزيئية التي تنقل النطاف (المشار اليها باسم السائل المنوي) من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي نحو البويضة ليست مفهومه جيدا ، ولكنها أساسيه للاستنساخ الجنسي. حركيه السائل المنوي ديناميكية للغاية وتعتمد علي إشارات الاتصال القوية التي تغير سرعه السائل المنوي والحركية الاتجاهية1،2،3،4،5،6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. c. وقد أصبحت ايليناليس نموذجا قويا لدراسة حركه النطاف في الجسم الحي لان البشرة الشفافة المخنثة تسمح بتتبع السائل المنوي المباشر في الخلية الواحدة القرار2,3, 8و10. الغرض من هذه الورقة هو توفير طرق لتقييم حركه السائل المنوي داخل الرحم الخنثى المخنث. 
في الأنواع الحيوانية حيث يلتقي السائل المنوي والبويضات في البيئة الخارجية (اي البيئات الملكية) ، تستجيب السائل المنوي للإشارات الكيميائية التي تفرزها البويضات. ترشد هذه الإشارات اتجاه حركه السائل المنوي ، وتقربها من مصدر الاشاره4،6،11. ومع ذلك ، يعرف اقل بكثير عن حركه السائل المنوي في الأنواع التي تسميد داخليا. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في هيكل الجهاز التناسلي للإناث ، الذي يتعذر الوصول اليه بالمجهر في معظم الأنواع. في المختبر الدراسات في البشر, الفئران, والخنازير, علي سبيل المثال, تقديم أدله علي ان السكان الفرعيين من السائل المنوي يمكن ان تستجيب لتشيمواتراكتانتس, تدفق السوائل, والتدرجات الحرارية1,5,7,9, 12-الآن مع هذه الانظمه ، وعدم القدرة علي تصور وتتبع حركه النطاف في الجسم الآخر يضع قيودا خطيره علي استراتيجيات لاكتشاف أليات الرئيسية التي تنظم هذه الوظائف.
للتغلب علي هذه القيود ، قمنا بتطوير أساليب باستخدام الديدان الخيطية c. اليجس لتصور مباشره السائل المنوي بعد التلقيح ، لقياس المعلمات الفردية الهجرة المنوية في الجسم المجري ، وقياس قدره السكان المنوية لاستهداف موقع الإخصاب. وتسهل هذه الأساليب ، بالاضافه إلى مجموعه أدوات الجزيئات والجينات الخاصة ب c. ، اكتشاف جزيئات الإشارات الكيميائية وآلات الجزيئية التي تنظم سلوكيات حركيه السائل المنوي. علي سبيل المثال ، يمكن اجراء الشاشات الجينية في المخنثين أو الذكور لتحديد الجينات الضرورية لحركه النطاف الفعالة في الجسم الحيوي13. يمكن حقن الجزيئات في الغدد التناسلية لاختبار التاثيرات علي تنشيط السائل المنوي ، وسرعه الهجرة ، والحركة الاتجاهية3. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الطرق الموصوفة لمراقبه هجره النطفة المارقة إلى مواقع الجسم التي يتم الاستعانة بها في الرحم ولتقييم منافسه المني10،14.
C. اليجانيين موجودة في الطبيعة كالمخنثين والذكور (انظر الشكل 1). الغدة التناسلية المخنثة لديها اثنين من الاسلحه علي شكل حرف U التي هي صور متطابقة لبعضها البعض. خلال المرحلة L4 يرقات ، والخلايا الجرثومية الأكثر القريبة (اي الخلايا بالقرب من spermatheca) الخضوع للسائل المنوي. كل الخلايا المنوية الاساسيه يدخل الانقسام الأول وتنتج أربعه النطاف المنوية. ويتم دفع هذه المبيدات المنوية إلى المبيدات المنوية إلى جانب البويضة الناضجة الاولي والخضوع لعمليات النطاف15. الكبار المخنثين التبديل من النطاف إلى التكوين. البويضات تنضج في خط التجميع الأزياء علي طول الغدد التناسلية ، مع البويضة الأكثر نضجا في نهاية القريب من الغدد التناسلية ، بجانب spermatheca. وهناك حاجه إلى إشارات MSP من السائل المنوي لتحريك نضوج ميوتيك والاباضه16,17. من ناحية أخرى ، لدي الذكور c.اليجان ، علي شكل J الغدد التناسلية التي تنتج فقط السائل المنوي. يتم تخزين المبيدات المنوية في الحويصلة المنوية. عند التزاوج مع المخنثين أو الإناث ، والذكور ادراج كانسيلوس بالقرب من الذيل في الفرج. يتم تنشيط المبيدات المنوية اثناء القذف ، عندما تاتي في اتصال مع السائل المنوي18. C. السائل المنوي التي لا تسبح لأنها ليست ساريه. بدلا من ذلك ، فانها تزحف عبر الجهاز التناسلي ، وذلك باستخدام الكاذب للتنقل. ومن الثابت ان السائل المنوي الذكور ، والتي هي أكبر في الحجم ، لديها ميزه تنافسيه علي النطاف خنثى14.
في هذا الأسلوب ، والذكور c. اليجريس بمثابه المتبرع العنبر وتزاوج إلى hermaprhodites الكبار. الذكور البالغين ملطخه بصبغه الميتوكوندريا الفلورية لإنتاج السائل المنوي المسمي. وبمجرد إيداعه من خلال الفرج المخنث ، يجب ان يزحف السائل المنوي حول الاجنه في الرحم نحو النطاف ، أو موقع الإخصاب. البشرة الشفافة للنموذج c. اليجس يسمح للتصور المباشر لكل السائل المنوي الفردية كما انه يتنقل من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي. في السنوات الاخيره ، استخدم معملنا بنجاح هذه الطريقة لإثبات اهميه فئة F-سلسله بروستاغلينات في توجيه السائل المنوي من الفرج إلى spermatheca19،20. الميكانيكية الجزيئية التي تنظم تخليقها من قبل خنثى والاستجابة من قبل السائل المنوي لا تزال قيد التحقيق. ومع ذلك ، فان هذه الطريقة لتقييم حركيه السائل المنوي والهجرة تسهل بشكل كبير تحديد اللاعبين الرئيسيين الذين يتحكمون في السائل المنوي والاتصال بالبويضات في التسميد الداخلي للحيوانات. يصف البروتوكول التالي خطوه بخطوه كيفيه اجراء هذا الفحص.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td>Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fog-2(q71)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>CB4108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire 0.25mm dia</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4&#34; Disposable Pasteur pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-612A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mm Dia. Glass rod</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-121-5269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker CMXRos (Mito-dye)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td>Shield from light, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopostassium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td>Store in aliquotes at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-A</td>
			<td>18 x 18-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-552-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16&#176;C and 20&#176;C incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td>Same model, set at different temperatures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software with image acquisition and tracking capabilities</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-elements AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring sperm guidance and motility within the caenorhabditis elegans hermaphrodite reproductive tract

الإخصاب الناجح هو أمر أساسي للاستنساخ الجنسي ، ولكن لا يعرف سوي القليل عن أليات التي توجه السائل المنوي إلى البويضات داخل الجهاز التناسلي الأنثوي. بينما في المختبر الدراسات تشير إلى ان السائل المنوي من التسميد الحيوانية داخليا يمكن ان تستجيب لمختلف العظة من المناطق المحيطة بها, عدم القدرة علي تصور سلوكهم داخل الجهاز التناسلي الأنثوي يخلق تحديا لفهم هجره النطاف والتنقل في بيئتها الاصليه. هنا ، ونحن وصف الأسلوب باستخدام c. اليجس التي تتغلب علي هذا القيد ويستفيد من البشرة الشفافة. C. وتزاوج الذكور اليجس الملونة مع صبغ الميتوكوندريا مع البالغين المخنثين ، والتي تعمل بوصفها الإناث المعدلة ، وإيداع فلوريسسينتلي المسمي السائل المنوي في الرحم خنثى. ويمكن بعد ذلك تعقب الهجرة وحركيه السائل المنوي المسمي مباشره باستخدام مجهر التحصين الموسع الفلوري في خنثى الحية. في البرية من نوع الحيوانية ، حوالي 90 ٪ من العنبر المسمي الزحف من خلال الرحم والوصول إلى موقع الإخصاب ، أو spermatheca. يمكن أخذ صور الرحم 1 ح بعد التزاوج لتقييم توزيع السائل المنوي داخل الرحم والنسبة المئوية للسائل المنوي التي وصلت إلى spermatheca. بدلا من ذلك ، يمكن ان تؤخذ الصور الفاصلة الزمنيه علي الفور بعد التزاوج لتقييم سرعه السائل المنوي ، وسرعه الاتجاه وتردد عكس. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع الاداات الوراثية والجزيئية الأخرى المتاحة لل c. اليجس لتحديد أليات الوراثية والجزيئية الجديدة التي هي مهمة في تنظيم توجيه السائل المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي الأنثوي.

لتوليد النتائج المبينة في هذه الورقة ، كان الضباب-2 (q71) الذكور ملطخه بصبغ ميتو وتزاوج إلى النوع البري ، المخنثين N2. ويقدم الشكل 2 مخططا عاما للأسلوب ، بما في ذلك اعداد الدودة ، والتزاوج ، والتحليل. كما يظهر الفيلم 1 ، الجهاز التناسلي للكبار المخنثين لديه اثنين من الاسلحه التي هي مراه الصور من بعضها البعض. عند التزاوج ، يتم إيداع السائل المنوي المسمي في الرحم المخنث من خلال الفرج. يتحرك السائل المنوي حول الاجنه النامية داخل الرحم باتجاه النطاف ، حيث يتم تخزينها حتى الإخصاب. كما الخلايا الجرثومية في خنثى الكبار تتطور إلى البويضات ، يتم دفع القريبة ، البويضة الأكثر نضجا في spermatheca عن طريق الانقباضات الخلية غمد. الإخصاب يحدث في حين ان البويضة في spermatheca.
لقياس توزيع السائل المنوي والهجرة من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي ، ينقسم الرحم المخنث إلى ثلاث مناطق (الفيلم 1 ، الشكل 3 ا). المنطقة 1 تمتد علي الثلث الأول من الرحم ، بدءا من الفرج. وتمتد المنطقة الثانية إلى الثلث الأوسط من الرحم ، وتمتد المنطقة الثالثة إلى الثلث الأخير من الرحم وتشمل المبيد المنوي. توجيه السائل المنوي السليم باستخدام نوع البرية ، N2 الخنثى والضباب -2 (q71) الذكور ينبغي ان يؤدي إلى حوالي 90 ٪ من السائل المنوي المسمي الوصول إلى spermatheca ، أو المنطقة 3 (الشكل 3b).  Matings التي تؤدي في عدد قليل جدا (الشكل 3C، اقل من 10-15 السائل المنوي) أو كثيره جدا (الشكل3c، الرحم مليئه السائل المنوي) النطفة في الرحم لا ينبغي ان تحسب. في تزاوج التي تؤدي إلى اقل من 10-15 السائل المنوي ، 3-4 السائل المنوي المارقة قد انحراف البيانات بشكل كبير. المثل ، عندما يتم ملء الرحم تماما مع السائل المنوي ، لا يمكن لنطفه الهجرة بشكل مناسب. قد يبدو السائل المنوي متناثرا في جميع انحاء الرحم من بعض المسوخ التي تعرض النمط الظاهري الفقراء توجيه السائل المنوي. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يجب ان لا تملا السائل المنوي كل صرير الرحم ، كما راينا في الشكل 3D. ويعتبر القياس الكمي لكل ذراع من الغدد التناسلية عينه واحده ، أو واحده ن.
وتؤخذ الصور الفاصلة الزمنيه لقياس سرعه السائل المنوي وتردد الانعكاس. يجب ان يتم تتبع السائل المنوي فقط في المنطقة 2 (الشكل 4A) لان السائل المنوي في المناطق 1 و 3 (الفيلم1) يميل إلى التحرك في نمط دائري حتى داخل الحيوانية من النوع البري. الوقت-laspe الصور التي اتخذت علي فترات 15-30 s وعاده ما تستخدم لتتبع السائل المنوي. يتم تحديد كميه السائل المنوي فقط التي يمكن اتباعها في إطارات متتالية لأكثر من 2.5-3 دقيقه. في الشكل 4B-M، فان السائل المنوي الذي يتميز بالنقاط الحمراء والزرقاء يستوفي هذا المعيار ، في حين ان السائل المنوي الذي تميزه النقطة الخضراء لا. ولذلك ، فان القيم المحددة في الشكل 4N يتم قياسها كميا بالنسبة للمني الذي تميزت به النقاط الحمراء والزرقاء (الشكل4n) ، في حين لم يتم تحديد كميات تلك الخاصة بالسائل المنوي الموسوم بالنقطة الخضراء.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig1.jpg"> الشكل 1: الرسوم الكاريكاتورية للكبار c. الفاسقات خنثى والذكور. وتصنف الهياكل التناسلية الرئيسية في هذا الشكل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig2v2.jpg"> الشكل 2: رسم تخطيطي لاعداد العينات والحصول علي البيانات. وتزاوج الذكور الملطخة بصبغ ميتو لمتزامنة البالغين المخنثين. تؤخذ الصور الفاصلة الزمنيه لتزاوج الخنثى علي الفور بعد التزاوج للتقاط البيانات للسرعة المنوية وتردد الانعكاس. تؤخذ الصور الثابتة لتزاوج المخنثين 1 ح بعد التزاوج لتقييم توزيع السائل المنوي داخل الرحم. راجع النص للحصول علي مزيد من التفاصيل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig3v2.jpg"> الشكل 3: القياس الكمي لتوزيع السائل المنوي داخل الرحم المخنث. (ا). التخطيطي لل c. الفاسقات الرحم خنثى. V = الفرج ، E = الجنين ، S = spermatheca ، O = البويضة ، Z1-Z3 = المناطق 1-3 المستخدمة لقياس توزيع السائل المنوي. (ب-د). اندمجت DIC + TRITC (اللوحات اليسرى) و TRITC فقط (لوحات الحق) صور من البرية من نوع خنثى الرحم 1 ح بعد التزاوج إلى الضباب-2 (q71) الذكور ملطخه بصبغ ميتو. تظهر السائل المنوي احمر. الخطوط العريضة الصفراء تشير إلى موقع spermatheca. شريط المقياس: 20 μm. Z1 ، Z2 ، Z3 التحديد الكمي في B تمثل النسبة المئوية في المئة السائل المنوي في كل منطقه ± الانحراف المعياري. الصور في c و D تمثل تزاوج التي أسفرت عن عدد قليل جدا (ج) أو كثيره جدا (د) السائل المنوي للقياس الكمي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig4v2.jpg"> الشكل 4: قياس سرعه السائل المنوي وتردد الانعكاس اثناء الهجرة عن طريق الرحم. (ا). DIC + tritc صوره مدمجه من الرحم خنثى التي تحتوي علي السائل المنوي الفلورسنت (الأحمر). V = الفرج ، الأصفر = spermatheca ، Z1-Z3 = ثلاث مناطق من الرحم ، الصندوق الأسود: المنطقة 2. (B-M). الفاصل الزمني الصور قناه TRITC التكبير في المنطقة 2 (المربع الأسود في A). تم الحصول علي الصور علي فترات 20 ثانيه. تم تتبع 3 النطفة الفردية في كل صوره (الأحمر والأخضر ، والنقاط الزرقاء). النقاط الملونة في لوحه M يمثل مسار كل السائل المنوي من B-L. شريط مقياس = 20μm. (ن). المعادلات والتعاريف للسرعة المنوية ، وسرعه ناقلات وتردد عكس. (س). السرعة ، ومعدل سرعه الموجات وعكس تردد السائل المنوي تتبع في لوحات B-L بالنقاط الحمراء والزرقاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/59783/59783movie1.jpg"> فيلم 1: فيلم من حركه السائل المنوي والهجرة. وقد تزاوج النوع الوحشي خنثى إلى الضباب-2 (q71) الذكور ملطخه بصبغ ميتو. الفيلم هو مركب من الصور الفاصلة الزمنيه التي اتخذت في فترات زمنيه مختلفه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/Movie_1_final.mp4" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract at JoVE.com

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

يجب ان السائل المنوي التنقل بنجاح من خلال القناة لتسميد البويضة. هنا ، نقوم بوصف فحص لقياس هجره السائل المنوي داخل الرحم خنثى. ويمكن لهذا الفحص ان يوفر بيانات كميه عن توزيع السائل المنوي داخل الرحم بعد التزاوج ، وكذلك عن سرعه الاتجاه الاتجاهي ، وتردد الانعكاس.

قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

توفر هذه الطريقة أداة للعلماء لدراسة العوامل الوراثية البيئية التي تؤثر على هجرة الحيوانات المنوية وسلوكها في بيئاتها الأصلية داخل الجهاز التناسلي الأنثوي. وتنبع الميزة الرئيسية لهذه التقنية من البشرة الشفافة للـ C.elegans، والتي تسمح للمجربين بتصور حركة الحيوانات المنوية وتسجيلها بسهولة في الحيوانات الحية. للبدء، استخدم قطف دودة مصنوعة من ماصة باستور وسلك بلاتيني بالارض على نهاية واحدة لاختيار 20 إلى 30 L4 مرحلة hermaphrodites، ووضعها بلطف على لوحة NGM المصنفة ستة سنتيمترات.احتضان hermaphrodites في 20 درجة مئوية لمدة 28 إلى 30 ساعة. بعد ذلك، جعل لوحة تلطيخ الذكور. استخدام نهاية قضيب اثارة الزجاج لكشط E.coli من حديقة البكتيريا من لوحة بذر، وإيداعها على وسط لوحة NGM غير المصنفة، مما يجعل نقطة الطعام من خمسة إلى سبعة ملليمترات قطرها.مزيج معا اثنين من ميكرولترات من صبغة ميتويتو واحد ميليلي في DMSO و 10 ميكرولترات من M9 العازلة في أنبوب microcentrifuge. الماصات كل من محلول صبغ الميتو على نقطة الغذاء على لوحة تلطيخ الذكور. ضع الطبق في الظلام حتى يجف لمدة 30 دقيقة.تحت المجهر، على لوحة تحتوي على واحد إلى ثلاثة أيام الكبار C.elegans، وتحديد الذكور من قبل ذيلهم على شكل مروحة. اختيار ما يقرب من 100 الذكور إلى نقطة الطعام الملون ميتو صبغ على لوحة تلطيخ الذكور. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.في اليوم الثاني، نقل الذكور الملونين على لوحة NGM مبذرة جديدة لتنظيف البكتيريا الزائدة الملطخة بصبغة الميتو. إبقاء لوحة في الظلام حتى التزاوج. لجعل لوحة التزاوج، على لوحة NGM غير المصنفة، بالتنقيط اثنين من ميكرولترات من خليط الإشريكية القولونية سميكة.انتظر حوالي 10 إلى 15 دقيقة حتى تجف البكتيريا السميكة لتشكل نقطة تزاوج. في انتظار أن يجف لوح التزاوج، اخلطي 300 ميكرولترات من وزن 1٪ حسب حجم التريكين، 300 ميكرولترات من وزن 0.1٪من قبل رباعيات التراميسول، و 900 ميكرولترات من M9. نقل 600 ميكرولترات من محلول التتراميسول/تريكابيل إلى زجاج الساعة. نقل 12 إلى 15 hermaphrodites التقطت في اليوم الأول في حل tetramisole / tricaine على زجاج الساعة.ضع النصف السفلي من طبق بيتري فوق زجاج الساعة للحفاظ على تغطيته من التبخر ، واحتضان لمدة 30 دقيقة لشل حركة hermaphrodites. بعد ذلك ، استرداد لوحة NGM المصنفة التي تحتوي على الذكور الملونين من الظلام ، واختيار 50 إلى 60 ذكرا ملطخة على نقطة التزاوج المجففة على لوحة التزاوج. تخزين لوحة في الظلام.بعد أن يتم شل حركة hermaphrodites ، استخدم ماصة باستور الزجاجية لالتقاط hermaphrodites المُشلول من زجاج الساعة. تجنب مص hermaphrodites وراء الجزء الضيق من الماصات. نقل hermaphrodites على لوحة NGM غير المصنفة.إزالة السائل قدر الإمكان، والسماح للسائل الزائد الجافة. بمجرد أن تبخرت جميع السائل المرئي ، نقل hermaphrodites تخدير على نقطة التزاوج مع الذكور الملون. احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة للسماح التزاوج.إذا كان تقييم توزيع الحيوانات المنوية مرغوبًا ، فانقل hermaphrodites المتزاوج إلى لوحة NGM مبذرة والسماح لهم بالراحة لمدة ساعة واحدة قبل التركيب للتصور. لتركيب الديدان للتصور، بالتنقيط الأول 10 إلى 15 ميكرولترات من حل tetramisole/tricaine على لوحة agarose المعدة 2٪، ونقل hermaphrodites تزاوج في الحل على لوحة. ضع غطاء على الديدان.جبل الشريحة على مجهر تستقيم مجهزة epifluorescence، ووضع الدودة بحيث كل من الفرج والحيوانات المنوية واحدة هي في العرض. التركيز على الصورة من خلال التركيز على مركز الحيوانات المنوية. تحقق من التعرض لكل من قنوات DIC وTRITC.في DIC، هياكل دودة الداخلية واضحة للعيان. في TRITC، الحيوانات المنوية الفردية مرئية كما بونكتا متميزة. الحصول على صور DIC و fluorescence لكل رحم.لالتقاط مقاطع فيديو بفاصل زمني، حدد أولاً موقع الهرمافروديت التي تحتوي على منوية تحمل علامات داخل الرحم. في لوحة الاكتساب، اضبط الفواصل الزمنية للحصول على الصورة إلى 15 إلى 30 ثانية، ومدة الاكتساب إلى 10 إلى 20 دقيقة لكل رحم. ثم انقر فوق تشغيل للحصول على الصور الفاصل الزمني في قنوات DIC وTRITC.بدءا من الفرج على نهاية واحدة والحيوانات المنوية من ناحية أخرى، وتقسيم الرحم إلى ثلاث مناطق، مع منطقة تحتوي على الفرج والمنطقة الثلاثة التي تحتوي على الحيوانات المنوية. عد يدويا عدد الحيوانات المنوية في كل ثلث الرحم، والإبلاغ عن عدد في كل منطقة في المئة من مجموع الحيوانات المنوية في الرحم بأكمله. إذا لزم الأمر، استخدم جدول البحث لضبط شدة إشارة صور قناة TRITC بحيث يمكن أن يكون كل من الحيوانات المنوية مرئيًا ومقَدَّمًا.لتتبع الحيوانات المنوية في الصور الفاصلة بين الوقت، استخدم برنامج فيجي للتحليل. استخدم الدالة استيراد تنسيقات حيوية لاستيراد الصور من سلسلة زمنية واحدة كـ هوبركاكس. ثم انقر فوق الإضافات، والتتبع، ثم دليل التعقب.في مربع الحوار المفتوح، حدد أداة TrackMate في شريط الأدوات فيجي. انقر نقراً مزدوجاً على الحيوانات المنوية التي سيتم تعقبها. انقر داخل الدائرة الخضراء ظهرت مع خطوط متقطعة، واسحب إلى الموضع المطلوب.انقر على الدائرة مرة أخرى. يتحول الخط الأخضر المتقطع إلى خط أخضر صلب. في وقت واحد ضرب مفاتيح التحول وL لتشغيل على وضع التتبع.الانتقال إلى الإطار التالي في سلسلة الفاصل الزمني. لتعيين الموقع الجديد للحيوانات المنوية المتعقبة في الإطار الجديد، قم بتمرير الماوس فوق النقطة الجديدة واضغط على المفتاح A. يظهر المتعقب في الموقع الجديد، ويظهر خط، يربط الموقع الذي تم وضع المتعقب فيه في الإطار السابق.كرر نفس الإجراء لبقية الإطارات. بعد اكتمال التتبع، انقر فوق تحليل في مربع الحوار TrackMate لإنشاء البيانات المطلوبة. لحساب السرعة، قم بتقسيم طول المسار الكلي للحيوانات المنوية على الوقت المنقضي.لحساب السرعة المتجهية، رسم خط من خلال الرحم بدءا من الفرج، مشيرا نحو الحيوانات المنوية. استخدم أداة الخط لقياس المسافة التي هاجرها الحيوان المنوي على طول هذا الخط من بداية التتبع إلى نهايته. تقسيم هذه المسافة على الوقت المنقضي.تشير القيم السلبية إلى أن الحيوانات المنوية قد هاجرت بعيداً عن الحيوانات المنوية. لتسجيل تكرار الانعكاس، عد عدد المرات التي قام خلالها تتبع الحيوانات المنوية بتوليد زاوية أقل من 90 درجة خلال ثلاثة إطارات زمنية متتالية. في هذا البروتوكول، كانت الديدان الذكرية الضباب-2 q71 ملطخة بصبغة الميتو وتزاوجت مع الهرمفروديتس N2 من النوع البري.السنكة التناسلية هيرمافروديت البالغ اثنين من الأسلحة التي هي صور مرآة لبعضها البعض. عند التزاوج، يتم إيداع الحيوانات المنوية المسماة في رحم هيرمافروديت من خلال الفرج. الحيوانات المنوية تتحرك حول الأجنة النامية داخل الرحم، نحو الحيوانات المنوية، حيث يتم تخزينها حتى الإخصاب.تم تقسيم الرحم hermaphrodite إلى ثلاث مناطق لتحديد كمية توزيع الحيوانات المنوية والهجرة. لتقييم سرعة الحيوانات المنوية وتواتر الانعكاس، تم تتبع الحيوانات المنوية فقط في المنطقة الثانية من خلال صور الفاصل الزمني. الحيوانات المنوية في المنطقة الأولى، بدءا من الفرج، والمنطقة الثالثة، بما في ذلك الحيوانات المنوية، تميل إلى التحرك في نمط دائري.الحيوانات المنوية التي تميزت النقاط الحمراء والزرقاء كان سرعة الحيوانات المنوية وعكس تردد كمي. عند تحديد كمية توزيع الحيوانات المنوية في الرحم، التوجيه السليم الحيوانات المنوية باستخدام نوع البرية N2 hermaphrodites والضباب-2 q71 الذكور أدى إلى ما يقرب من 90٪ من الحيوانات المنوية المسمى الوصول إلى الحيوانات المنوية. لا ينبغي أن تحسب البيانات إذا كان التزاوج يؤدي إلى عدد قليل جدا من الحيوانات المنوية في الرحم أو الكثير من الحيوانات المنوية في الرحم، وملء كل شق.من المهم أن يتم التعامل مع الحيوانات بلطف أثناء كل خطوة نقل ، وأن يتم شل الهرمفروديتس تماما ، وأن يتم حماية الصفائح والديدان التي تحتوي على صبغة ميو من الضوء. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة وتجارب الضربة القاضية الجينية أو التجارب على التعرض للمواد الكيميائية أو التجارب البيئية أو الكيميائية، أو غيرها من التلاعبات لتحديد العوامل التي قد تنظم ترحيل الحيوانات المنوية. وقد مكنتنا هذه التقنية من تحديد البروستاجلاندين محددة التي هي مهمة لتوجيه الحيوانات المنوية إلى البويضة.يتم تصنيع هذه البروستاجلاندين عن طريق آلية غير تقليدية يمكن حفظها في الثدييات العليا. تتراميسول, تريكين, DMSO هي الجلد والعين المهيجات، وقد يكون لها آثار سامة في جرعات عالية. من المهم ارتداء معدات الحماية المناسبة عند التعامل مع أي مواد كيميائية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

جمع بعد التزاوج السائل المنوي من الإناث المسالك التناسلية وقياس لتسييل المني في الفئران

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

فلوريميتريك تقنيات لتقييم أغشية الحيوانات المنوية

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...