Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

وقد دعمت هذا العمل مؤسسة العلوم التشيكية (18-10035S)، والبرنامج الوطني للاستدامة الأول (LO1419)، والدعم المؤسسي (RVO68378050)، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ووكالة المنح التابعة لمنظمة الأمم المتحدة للتنمية الاجتماعية ومنطقة البحر الصناعي. جامعة تشارلز (GAUK 134516). كما نعترف بالمرفق الأساسي للميكروسكوب الخفيف، IMG CAS، براغ، الجمهورية التشيكية (بدعم من المنح (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. إعداد snRNAs للحقن الدقيق
<ol><li>إعداد قالب الحمض النووي الذي يحتوي على إصدار كامل الطول أو مقتطع/متحول من snRNA بواسطة PCR باستخدام إعداد PCR التالي: 98 درجة مئوية لـ 60 درجة مئوية، 98 درجة مئوية لمدة 15 ق، 68 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 98 درجة مئوية لمدة 15 درجة مئوية لمدة 35 درجة م?...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

لقد استخدمنا الحقن الدقيق للسنRNAs التي تحمل علامة الفلورسنت لتحديد التسلسلات الهامة لتوطين الرنا في أجسام كاجال النووية. نظرًا لإعداد RNAs المسمى بسرعة وبساطة (إعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR متبوعاً بالنسخ في المختبر) تقدم الطريقة تحليلاً فعالاً لكيفية مساهمة التسلسلات المختلفة في توطين...

ربط الحمض النووي الريبي هو واحد من الخطوات الحاسمة في التعبير الجيني، الذي يحفزه مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يسمى spliceosome. في المجموع، يتم دمج أكثر من 150 بروتين و 5 RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) في spliceosome في مراحل مختلفة من مسار الربط. U1، U2، U4، U5 و U6 snRNAs تشارك في الربط من الإنترونات GU-AG الرئيسية. هذه snRNAs الانضمام إلى spliceosome كما شكلت مسبقا جزيئات ريبونوكليوبروتين النووية الصغيرة (snRNPs) التي تحتوي على snRNA, سبعة البروتينات SM المرتبطة snRNA (أو البروتينات مثل SM, التي ترتبط مع SnRNA U6) و 1-12 البروتينات المحددة لكل snRNP.
تجميع snRNPs ينطوي على مراحل السيتوبلازمية والنووية. يتم تصدير snRNA المكتوبة حديثا إلى السيتوبلازم حيث يكتسب حلقة تجميعها من سبعة بروتينات SM. حلقة SM في وقت لاحق بمثابة إشارة لإعادة استيراد snRNA مرة أخرى إلى النواة. يتم الاحتفاظ snRNAs المعيبة التي تفشل في الارتباط مع البروتينات SM في السيتوبلازم1. تظهر الـ snRNPs المستوردة حديثًا لأول مرة في جسم Cajal حيث تلتقي بالبروتينات الخاصة بالsnRNP وتنهي نضجها (تم استعراضها في المرجع2و3). أظهرنا مؤخرا أن تثبيط خطوات النضج النهائي يؤدي إلى عزل snRNPs غير ناضجة في الهيئات Cajal4،5. اقترحنا نموذجا حيث النضج snRNP النهائي هو تحت مراقبة الجودة التي تراقب إضافة البروتينات الخاصة snRNP وتشكيل snRNPs النشطة. ومع ذلك، فإن التفاصيل الجزيئية لكيفية تمييز الخلايا بين الجسيمات الناضجة والشاذة غير الناضجة التي تم تجميعها بشكل صحيح لا تزال بعيدة المنال.
لتحديد تسلسل snRNA التي هي ضرورية لاستهداف وتراكم snRNAs في الهيئات كاجال النووية، قررنا استخدام الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت. وكان الحقن المجهري طريقة للاختيار لأنه: 1) أنها لا تتطلب علامة تسلسل إضافية للتمييز snRNAs الاصطناعية تشكل نظرائهم الذاتية وهو أمر مهم بشكل خاص لRNAs قصيرة مع مساحة صغيرة لإدراج تسلسل علامة إضافية; 2) فإنه يسمح بتحليل التسلسلات التي هي مهمة للتكوين الحيوي. على سبيل المثال، تسلسل SM ضروري لتجميع حلقة SM وإعادة الاستيراد إلى النواة6. عندما يتم التعبير عن snRNAs في الخلية ، يتم تدهور snRNAs تفتقر إلى تسلسل SM في السيتوبلازم ولا تصل إلى النواة والهيئات Cajal7. مهما, [سنّن] دون ال [سم] تسلسل يستطيع كنت مباشرة [ميكرونّد] داخل النواة ولذلك دور ممكنة من ال [سم] تسلسل في [كجل] جسم توطين يُسَرَّب.
هنا، ونحن نصف بالتفصيل طريقة الحقن المجهري التي طبقناها لتحديد تسلسل snRNA اللازمة لاستهداف snRNAs في الجسم Cajal5. أظهرنا أن SM وSMN مواقع ملزمة ضرورية وكافية لتوطين ليس فقط snRNAs ولكن مختلف قصيرة غير الترميز RNAs في الجسم Cajal. استنادا ً إلى الحقن المجهري بالإضافة إلى أدلة أخرى، اقترحنا أن حلقة SM تجميعها على موقع الربط SM هو إشارة توطين الجسم Cajal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs snrnas هي عملية معقدة تنطوي على كل من المراحل النووية والسيتوبلازمية والخطوة الأخيرة تحدث في مقصورة نووية تسمى هيئة كاجال. ومع ذلك، فإن التسلسلات التي توجه توطين snRNA إلى هذا الهيكل دون النووي لم تكن معروفة حتى وقت قريب. لتحديد تسلسل مهم لتراكم snRNAs في أجسام Cajal، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت تليها توطينها داخل الخلايا. أولا، قمنا بإعداد snRNA حذف المسوخ، توليفها قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر وsnRNAs مسجلة في وجود UTP إلى جانب Alexa488. تم خلط snRNAs وصفت مع 70 kDa-Dextran مترافقة مع TRITC، وحقنها بميكروين في النواة أو السيتوبلازم من خلايا HeLa البشرية. تم احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة وثابتة، وكان تصور اللفائف علامة الجسم Cajal من قبل الفلورة المناعية غير المباشرة، في حين snRNAs وdextran، الذي يعمل كعلامة على الحقن النووي أو السيتوبلازم، لوحظ مباشرة باستخدام المجهر الفلورية. يسمح هذا الأسلوب لاختبار فعال وسريع لكيفية تأثير تسلسلات مختلفة على توطين RNA داخل الخلايا. هنا، نبين أهمية تسلسل SM ملزمة لتوطين كفاءة snRNAs في الجسم Cajal.

لمراقبة توطين snRNA ودور موقع الربط SM في استهداف الجسم Cajal، قمنا بإعداد قالب الحمض النووي الذي يحتوي على المروج T7 وإما كامل طول U2 snRNA أو U2 snRNA تفتقر إلى النيوكليوتيدات السبعة (AUUUUUG) تشكيل موقع الربط SM. [سنّرنا] كان في مختبرة منقولة, يعزل ويمزج مع [تريستك]-يضمّ [دإكسترن-70كد]. قمنا بحقن الخليط الذي يح...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs spliceosomal هي عملية معقدة تنطوي على مختلف المقصورات الخلوية. هنا، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت من أجل رصد نقلها داخل الخلية.

تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

هنا قمنا بتطبيق الحقن المجهري من الرنا الفلورية المسمى للكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي التي هي ضرورية لتوطين RNAs النووية قصيرة في الهياكل النووية تسمى الهيئات Cajal. هذه التقنية لها ميزتان رئيسيتان. أولاً، يمكن تطبيقه على RNAs قصيرة التي يصعب خلاف ذلك تسمية وتتبع.وثانيا، فإنه يسمح بالفحص السريع للتسلسلات المختلفة واختبار دورها في تعريب الحمض النووي الريبي. قبل يوم واحد من الحقن المجهري، بذور HeLa أو الخلايا الأخرى الملتزمة على 12 ملليمتر يغطي أن تصل إلى 50٪ التقاء في وقت الحقن المجهري. للبدء ، ضع غطاءً معدًا في وسط طبق بيتري ، وأضف الخلايا واثنين ملليمترات من وسائل الإعلام الثقافية.في اليوم التالي، ضع طبق بيتري المليء بالخلايا على خشبة المجهر. باستخدام microloader، تحميل ثلاثة ميكرولترات من خليط snRNA في الإبرة وتثبيت الإبرة في حامل الحقن المجهري في زاوية 45 درجة فيما يتعلق سطح طبق بيتري. استخدام هدف مسافة طويلة 10X للعثور على الإبرة.أولا، تعيين سرعة الخشنة على حاقن وخفض إبرة حتى اللمسات على المتوسطة الثقافة. باستخدام مناظير المجهر، والعثور على النقطة المضيئة التي هي المكان الذي تلامس الإبرة المتوسطة الثقافة. تغيير السرعة إلى غرامة وخفض مزيد من الإبرة في حين تبحث في المجهر حتى يتم رصد طرف الإبرة.حرك الإبرة في منتصف الحقل المرئي والتبديل إلى هدف مسافة طويلة 40X. بعد ذلك، حدد الخلية وتحريك الإبرة فوق الخلية. تعيين الضغط والوقت للاتصال الخلية.نقل الإبرة إلى أسفل في الخلية ومن ثم تعيين الحد الأدنى من micromanipulator. تعيين الحد الأدنى هو الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول. لأن سطح الغطاء ليس مثاليا ولأن كل خلية مختلفة، سيكون لديك لتعيين الحد الأدنى عدة مرات خلال جلسة الحقن.بعد ذلك، قم بتحريك الإبرة مرة أخرى فوق الخلية واضغط على زر الحقن على عصا التحكم في الحقن. سوف الإبرة تتحرك تلقائيا داخل الخلية إلى المكان الذي يتم تعيين الحد لحقن المزيج RNA. لإنهاء, اضغط على زر القائمة على حاقن وإزالة إبرة من حامل.ثم قطع الأنبوب من حاقن قبل إيقاف عن حاقن وmicromanipulator. بعد الحقن المجهري ، إعادة الخلايا إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة مع 4٪ شبه شكلي في أنابيب 0.1 الضرس في 6.9 pH. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة PBS. إذا تم تحليل توطين snRNA فقط ، شطف الخلايا في الماء لفترة وجيزة وجبل في وسط تصاعد مع DAPI.في حالة توطين البروتين إضافية، permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وصمة عار لهم مع الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية المناسبة كما هو مبين في بروتوكول النص. ثم شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وشطف مرة واحدة في الماء.بعد ذلك، قم بتحميل الخلايا في متوسطة تحميل مع DAPI. عندما تكون جاهزة للصورة، استخدم نظام مجهري الفلوريسين الراقية المجهز بهدف الغمر للحصول على الصور. وبمجرد تحديد الخلايا المجهرية، قم بجمع كومة من 20 مقطعًا Z مع 200 خطوة من نانومتر Z لكل عينة وتخضع للفك الضوئي الرياضي.لتحديد حجم الإشارة الفلورسنت، قم أولاً بفتح صورة المجهر في ImageJ وتقسيم القنوات إلى نوافذ. مزامنة الإطارات بواسطة أداة نافذة مزامنة. المقبل، رسم المنطقة من الاهتمام حول الجسم Cajal التي حددتها اللوين مناعة.قياس شدة إشارة snRNA في ROI المحدد للملف. تحديد شدة الفلورية snRNA في العائد على الاستثمار وضعت عشوائيا في النوى. حفظ القيم المقاسة وحساب نسبة إشارة RNA في الجسم Cajal وnucleoplasm.في هذه الدراسة، يتم تحديد الفلورسنت المسمى snRNas microinjected من أجل مراقبة نقلها داخل الخلية. لاختبار ما إذا كان موقع SM مهم لتراكم الجسم Cajal، snRNA تفتقر إلى موقع SM هو microinjected مباشرة في النواة. حقن في السيتوبلازم بمثابة عنصر تحكم في حين أن طول كامل snrna هو microinjected لتكون بمثابة سيطرة إيجابية.بعد الحضانة ، يتم إصلاح الخلايا الدقيقة ويتم تصور لفائف علامة الجسم Cajal بواسطة الفلوروس المناعية غير المباشرة. كامل طول snRNA تراكمت في الهيئات Cajal بعد كل من حقن النووية والسيتوبلازمية. في المقابل، snRNA تفتقر إلى موقع SM ظلت في السيتوبلازم بعد الحقن المجهري في هذه المقصورة في حين أن الحقن المجهري النووي من snRNA دون موقع SM يكشف أن تسلسل الربط SM مهم لتوطين الجسم Cajal لأن هذا snRNA يبقى في النواة ولكن لا تتراكم في الهيئات Cajal.في بعض الأحيان ميكروجينكشن في مقصورة خلوية واحدة فقط فشل وخدع Dextran 70 كيلودالون يمكن العثور عليها في كل من النواة والسيتوبلازم. يتم تجاهل هذه الخلايا من تحليل إضافي. على الرغم من حقيقة أن يتم تخزين snRNAs المسمى الفلورسنت في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية قبل الحقن، يمكن أن يحدث تدهور الحمض النووي الريبي.لا يتم نقل الرنا المتدهورة حقن في السيتوبلازم في النواة ويبقى موضعية في السيتوبلازم. وينبغي التخلص من هذا snRNA وينبغي توليف snRNA جديدة. من المهم ضبط الحقن بشكل صحيح والضغط التعويضي لنوع الخلية.وكما قال من قبل، وضع الحد الأدنى الصحيح لحقن الخلية أمر ضروري للضجين المجهري جيدة. يرجى تذكر أن الفينول- الكلوروفورم المستخدمة أثناء عزل الحمض النووي الريبي أمر خطير وأن إبرة الحقن المجهري هي كائن حاد. كن حذرا عند التعامل مع هذه المواد.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

القياسات الكهربية وتحليل Nociception الإنسان في الرضع

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

في فيتفو استهداف الخلايا السلف العصبية في النمس نيوكورتكس من قبل في الكهربائية الرحمية

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...