Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
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这项工作得到了捷克科学基金会(18-10035S)、国家可持续发展方案I(LO1419)、机构支持(RVO68378050)、欧洲区域发展基金(CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775)和赠款机构的支持。查尔斯大学 (GAUK 134516)。我们进一步认可光显微镜核心设施,IMG CAS,捷克共和国布拉格(由赠款支持(捷克生物成像 - LM2015062)。

1. 制备用于显微注射的snRNA
<ol><li>使用以下 PCR 设置,准备包含全长或截断/突变版本的 SnRNA 的 DNA 模板:98 °C,60 s,98 °C,15 s,68 °C,1 分钟,98 °C 15 秒和 72 °C 5 分钟。</li>
	<li>前引物必须包含一个促进因子序列,用于第一个转录核苷酸的上游体外转录。使用含有T7启动子和反向底漆的正向底漆放大U2 snRNA序列,该底漆以最后一个转录的核苷酸结束(详情见材料表)。</li>
	<li>使用用于短RNA合成试剂?...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

我们采用荧光标记snRNA的显微注射来确定对snRNA定位到核Cajal体中的重要序列。由于标签RNA的快速且相当简单制备(通过PCR制备DNA模板,然后进行体外转录),该方法提供了有效分析各种序列如何促进RNA定位。在相对较短的时间内,我们能够分析U2 snRNA的10个不同的删除或替换(参考文献5和未显示的数据)。对于具有复杂生物成因途径的RNA,这种方法还允许对成熟至关重要的测试序列。在snRNA?...

RNA拼接是基因表达的关键步骤之一,基因表达是由一种称为拼接体的大型核糖核蛋白复合物催化的。总共,超过150种蛋白质和5种小核RNA(snRNA)在拼接途径的不同阶段被集成到拼接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA正在参与主要GU-AG的拼接。这些snRNA加入拼接的拼接体作为预形成的小核核核核核核核核核核核核蛋白颗粒(snRNA),含有snRNA,7个Sm蛋白与snRNA(或类似Sm蛋白,与U6 snRNA相关)和1-12个特定蛋白质为每个snRNP。
snRNP 的组装涉及细胞质和核阶段。新转录的snRNA被导出到细胞质中,在那里它获得一个从七种Sm蛋白组装而成的环。Sm环随后充当snRNA重新导入到核的信号。有缺陷的snRNA,不能与Sm蛋白关联,被保留在细胞质1。新进口的snRNPs首先出现在Cajal体内,它们与snRNP特异性蛋白质相遇并完成其成熟(参考文献2,3)。我们最近表明,抑制最终成熟步骤导致在Cajal身体4,5中固存未成熟的snRNPs。我们提出了一个模型,其中最终的snRNP成熟是在质量控制下,监测snRNP特异性蛋白质的添加和活性snRNPs的形成。然而,细胞如何区分正确组装的成熟颗粒和异常未成熟颗粒的分子细节仍然难以捉摸。
为了确定在核Cajal体内靶向和积累snRNA所必需的snRNA序列,我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射。微注射是一种选择的方法,因为:1) 它不需要额外的序列标记来区分合成 snRNA 形成其内源性对应物,这对短 RNA 尤其重要,空间很小,无法插入额外的标记序列;2) 它允许分析对生物发生很重要的序列。例如,Sm 序列对于 Sm 环组件和重新导入到原子核6中至关重要。当snRNA在细胞中表达时,缺乏Sm序列的snRNA在细胞质中降解,并且不到达细胞核和Cajal体7。然而,没有Sm序列的snRNA可以直接微注入到细胞核中,从而在Cajal身体定位测定中Sm序列的潜在作用。
在这里,我们详细描述了一种显微注射方法,我们应用这种方法来确定将snRNA靶向Cajal体5所需的snRNA序列。我们表明,Sm 和 SMN 绑定位点是必要和足够的,不仅 snRNA,而且各种短非编码 RNA 到 Cajal 身体。基于显微注射和其他证据,我们提出在Sm绑定位点上组装的Sm环是Cajal体定位信号。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

乘子鼻核素的生物发生是一个复杂的过程,涉及核和细胞质阶段,最后一步发生在一个称为Cajal体的核隔间中。然而,将snRNA定位到这种亚核结构的序列直到最近才被发现。为了确定在Cajal体内积累snRNA的重要序列,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,然后在其细胞内进行定位。首先,我们准备了snRNA缺失突变体,合成DNA模板进行体外转录,并在UTP与Alexa488相伴的情况下转录snRNA。标记snRNA与70kDa-Dextran与TRITC结合,并微注入到人类HeLa细胞的细胞质。细胞孵育1小时,固定,Cajal身体标记线圈通过间接免疫荧光可视化,而作为核或细胞质注射标志物的snRNA和dextran直接使用荧光显微镜观察。这种方法可以高效、快速地测试各种序列如何影响细胞内的RNA定位。在这里,我们展示 Sm 绑定序列对于将 snRNA 有效定位到 Cajal 体中的重要性。

为了监测snRNA的定位和Sm结合位点在Cajal身体靶向中的作用,我们准备了一个DNA模板,其中包含T7启动子和全长U2 snRNA或U2 snRNA,缺少构成Sm结合位点的七个核苷酸(AUUUUG)。snRNA在体外转录、分离和与TRITC耦合dextran-70kDa混合。我们微注射含有体外转录的snRNA的混合物到HeLa细胞的细胞质。
此前已经表明,Sm绑定场址是核进口6所必需的。为了测试Sm位点是否对Cajal身体积累也很重要,我...

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Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

乘腔snRNA的生物发生是一个复杂的过程,涉及各种细胞隔间。在这里,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,以监测其在细胞内的传输。

使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

在这里，我们应用荧光标记RNA的微注射来检测RNA序列，这些序列对于将短核RNA定位到称为Cajal天体的核结构中至关重要。这项技术有两个主要优点。首先，它可以应用于短期RNA，否则很难标记和跟踪。其次，它允许快速筛选不同的序列，并测试它们在RNA定位中的作用。在微注射前一天，种子 HeLa 或其他粘附细胞在 12 毫米盖玻片上达到 50% 的汇合在微注射时。首先，将准备好的盖玻片放入培养皿的中心，添加细胞和两毫米培养介质。第二天，将充满细胞的培养皿放在显微镜的舞台上。使用微加载器，将三微升的 SnRNA 混合物加载到针头中，然后将针头以与 Petri 盘表面 45 度的角度安装到微注射器的支架中。使用 10 倍长距离目标查找针头。首先，在喷油器上设置粗糙的速度并降低针头，直到它接触培养介质。使用显微镜双筒望远镜，找到针接触培养基的地方的亮点。将速度更改为精细，进一步降低针头，同时观察显微镜，直到观察到针头的尖端。在视场中间移动针头，然后切换到 40 倍远距离目标。在此之后，选择单元格并移动单元格上方的指针。设置电池接触的压力和时间。将针头向下移动到单元格中，然后设置微操纵器的下限。设置下限是协议最重要的部分。由于盖玻片表面并不完美，并且每个单元格都不同，因此在注射过程中必须多次设置下限。接下来，将针头移回电池上方，然后按下喷油器操纵手柄上的喷射按钮。针头将在细胞内自动移动到设定为注射RNA混合物的地方。要完成，请按下喷油器上的菜单按钮，然后从支架上取下针头。然后断开喷油器和微操纵器，然后断开管与喷油器的连接。微注射后，将细胞返回二氧化碳培养箱，在37摄氏度下孵育一小时。接下来，在室温下用PBS冲洗细胞三次。在 pH 6.9 的 0.1 摩尔管中用 4% 的甲醛修复细胞 20 分钟。然后用室温PBS清洗细胞三次。如果只分析snRNA定位，请在水中短暂冲洗细胞，并用DAPI安装介质。在额外的蛋白质定位的情况下，在室温下用0.5%Triton X-100渗透细胞5分钟。用PBS冲洗细胞三次，并用文本协议中概述的适当的初级抗体和二级抗体染色。然后用 PBS 冲洗三次，在水中冲洗一次。在此之后，使用 DAPI 将电池安装到安装介质中。准备好成像时，请使用配备浸入式目标的高端荧光显微系统获取图像。一旦识别了微射细胞，收集一叠20 Z部分，每个样本有200纳米Z步数，并经过数学去卷。要量化荧光信号，请首先打开 ImageJ 中的显微镜图像，然后将通道拆分为窗口。通过同步窗口工具同步窗口。接下来，绘制通过线圈免疫污染识别的卡哈尔体周围感兴趣的区域。测量线圈定义 ROI 中 snRNA 信号的强度。确定随机放置在核质中的ROI中的snRNA荧光强度。保存测量值并计算卡哈尔体和核质中的RNA信号比。在这项研究中，荧光标记的snRNA被微表示，以监测它们在细胞内的传输。为了测试SM位点是否对Cajal身体积累很重要，缺少SM位点的SnRNA被微入细胞核。注射到细胞质作为控制，而全长snRNA被微注入，作为一个积极的控制。孵育后，通过间接免疫荧光对微注射细胞进行固定，对Cajal身体标记线圈进行可视化。在核质和细胞质注射后，在Cajal身体中累积的全长snRNA。相比之下，缺乏SM位点的snRNA在微注射到这个隔间后仍留在细胞质中，而没有SM位点的SnRNA的核微注射表明SM结合序列对Cajal身体定位很重要，因为这种SnRNA留在细胞核中，但不会积聚在Cajal体内。有时，只有一个细胞隔间的微注射失败，欺骗的德克斯特拉70千代吨可以在细胞核和细胞质找到。这些单元格从进一步分析中被丢弃。尽管荧光标记的 snRNA 在注射前储存在负 80 摄氏度，但RNA可能会降解。注入细胞质的降解性SnRNA不会被运送到细胞质中，并在细胞质中保持局部化。这种snRNA应该被丢弃，新的snRNA应该合成。正确调整细胞类型的注射和补偿压力非常重要。正如之前说的，为细胞注射设置正确的下限对于良好的微注射至关重要。请记住，RNA 分离期间使用的苯酚氯仿是危险的，微注射针是一个尖锐的物体。处理这些材料时要小心。

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