Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den tjekkiske videnskabs fond (18-10035S), det nationale bæredygtigheds program I (LO1419), institutionel støtte (RVO68378050), den europæiske fond for regional udvikling (CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775) og tilskuds organet for Charles University (GAUK 134516). Vi anerkender endvidere den lette mikroskopi kerne facilitet, IMG CAS, Prag, Tjekkiet (støttet af tilskud (tjekkisk-bioimaging-LM2015062).

1. klargøring af snRNAs til mikroinjektion
<ol><li>Forbered en DNA-skabelon, der indeholder den fulde længde eller afkortet/muteret version af snRNA ved PCR ved hjælp af en følgende PCR-opsætning: 98 °C for 60 s, 98 °C for 15 s, 68 °C for 30 s, 72 °C i 1 min, 98 °C for 15 s for 35x og 72 °C i 5 min.</li>
	<li>Forward primer skal indeholde en promotor sekvens for in vitro transkription lige opstrøms for den første transkriberet nucleotid. Amplify U2 snRNA-sekvens ved hjælp af fremad primer, der indeholder ...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

Vi beskæftigede mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs for at bestemme sekvenser, som er vigtige for snRNA-lokalisering i nukleare Cajal-kroppe. På grund af hurtig og ret simpel tilberedning af mærkede RNAs (udarbejdelse af DNA-skabelon ved PCR efterfulgt af in vitro-transskription) giver metoden en effektiv analyse af, hvordan forskellige sekvenser bidrager til RNA-lokalisering. På relativt kort tid, vi var i stand til at analysere ti forskellige sletninger eller erstatninger af U2 snRNA (reference<sup clas...

RNA splejsning er et af de afgørende skridt i genekspression, som er katalyseret af en stor ribonucleoprotein kompleks kaldet spliceosome. I alt er mere end 150 proteiner og 5 små nukleare RNAs (snrnas) integreret i spliceosome på forskellige stadier af splejsning pathway. U1, U2, U4, U5 og U6 snrnas deltager i splejsning af Major Gu-AG introns. Disse snRNAs slutte sig til spliceosome som præ-dannet små nukleare ribonucleoprotein partikler (snRNPs), der indeholder snRNA, syv SM proteiner forbundet med snRNA (eller lignende-SM proteiner, der forbinder med U6 snRNA) og 1-12 proteiner specifikke for hver snRNP.
Montering af snRNPs involverer cytoplasmiske og nukleare stadier. Nyligt transkriberet snRNA eksporteres til cytoplasmaet, hvor det erhverver en ring samlet fra syv SM proteiner. SM ring efterfølgende tjener som et signal for snRNA re-import tilbage til kernen. Defekte snRNAs, der undlader at associere med SM proteiner er bevaret i cytoplasmaet1. Nyligt importerede snrnp'er vises først i Cajal-kroppen, hvor de møder snrnp-specifikke proteiner og afslutter deres modning (gennemgået i reference2,3). Vi har for nylig vist, at hæmning af de endelige modning trin resulterer i binding af umodne snrnps i Cajal organer4,5. Vi foreslog en model, hvor den endelige snRNP modning er under kvalitetskontrol, der overvåger tilsætning af snRNP-specifikke proteiner og dannelsen af aktive snRNPs. Molekylære detaljer om, hvordan celler skelner mellem korrekt monterede modne og afvigende umodne partikler, forbliver dog flygtige.
For at bestemme snRNA-sekvenser, der er afgørende for målretning og akkumulering af snRNAs i nukleare Cajal-organer, besluttede vi at anvende mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs. Mikroinjektion var en metode til valg, fordi: 1) det kræver ikke en ekstra sekvens tag at skelne syntetiske snRNAs danne deres endogene modparter, som er særligt vigtigt for korte RNAs med lidt plads til indsættelse af ekstra tag sekvens; 2) det giver mulighed for analyse af sekvenser, der er vigtige for Biogenesis. For eksempel, SM sekvens er afgørende for SM ring samling og re-import i Nucleus6. Når snRNAs er udtrykt i cellen, snRNAs mangler SM sekvens er forringet i cytoplasmaet og ikke nå kernen og Cajal organer7. Men, snRNAs uden SM sekvens kan være direkte microinjiceres i kernen og dermed en potentiel rolle af SM sekvens i Cajal Body lokalisering assayed.
Her beskriver vi i detaljer en mikroinjektionsmetode, som vi anvendte til at bestemme snRNA-sekvenser, der er nødvendige for at målrette snRNAs ind i Cajal-kroppen5. Vi viste, at SM og SMN bindende sites er sammen nødvendige og tilstrækkelige til at lokalisere ikke kun snRNAs men forskellige korte ikke-kodning RNAs i Cajal kroppen. Baseret på mikroindsprøjtning samt andre beviser, foreslog vi, at SM ring samlet på SM binding site er Cajal Body lokaliserings signal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

Biogenesis af Spliceosomal snRNAs er en kompleks proces, der involverer både nukleare og cytoplasmiske faser, og det sidste trin forekommer i et nukleart rum kaldet Cajal-kroppen. Men sekvenser, der direkte snRNA lokalisering i denne subnukleare struktur har ikke været kendt indtil for nylig. For at bestemme sekvenser, som er vigtige for akkumulering af snRNAs i Cajal-kroppe, anvendte vi mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs efterfulgt af deres lokalisering inde i cellerne. Først forberedte vi snRNA sletning mutanter, syntetiseret DNA skabeloner til in vitro transkription og transskriberede snRNAs i nærværelse af UTP kombineret med Alexa488. Mærkede snRNAs blev blandet med 70 kDa-dextran konjugeret med TRITC, og microinjiceres til kernen eller cytoplasmaet af humane HeLa celler. Cellerne blev inkuberet i 1 time og fast, og Cajal Body Marker coilin blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens, mens snRNAs og dextran, som fungerer som markør for nuklear eller cytoplasmisk injektion, blev observeret direkte ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Denne metode giver mulighed for effektiv og hurtig test af, hvordan forskellige sekvenser påvirker RNA lokalisering inde celler. Her viser vi vigtigheden af SM-bindings sekvensen for effektiv lokalisering af snRNAs i Cajal-kroppen.

For at overvåge snRNA lokalisering og rollen som SM binding site i Cajal krop målretning, vi udarbejdet en DNA-skabelon, der indeholder T7 promoter og enten fuld længde U2 snRNA eller U2 snRNA mangler de syv nukleotider (auuuuug) danner SM binding site. snRNAs blev in vitro transkriberet, isoleret og blandet med TRITC-koblet dextran-70kDa. Vi microinjiceres blandingen indeholder in vitro transkriberet snRNA i kernen eller cytoplasmaet af HeLa celler.
Det har tidligere vist sig, at SM-bindin...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis af Spliceosomal snRNAs er en kompleks proces, der involverer forskellige cellulære rum. Her beskæftigede vi mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs for at overvåge deres transport inde i cellen.

Analyse af Spliceosomale snRNA-lokalisering i humane Hela-celler ved hjælp af mikroinjektion

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Her har vi anvendt mikroinjektion af fluorescerende mærket RNA'er til at opdage RNA sekvenser, som er afgørende for lokalisering af korte nukleare RNA'er i nukleare strukturer kaldet Cajal organer. Denne teknik har to store fordele. For det første kan det anvendes til korte RNA'er, som ellers er vanskelige at mærke og spore.Og for det andet giver det mulighed for hurtig screening af forskellige sekvenser og teste deres rolle i RNA lokalisering. En dag før mikroinjektion, frø HeLa eller andre tilstødende celler på 12 millimeter coverslips at nå 50% sammenløb på tidspunktet for microinjection. Til at begynde, placere en forberedt coverslip i midten af en petriskål, tilføje celler og to millimeter af kultur medier.Den følgende dag, placere cellen fyldt Petriskål på et mikroskop fase. Ved hjælp af en mikroloader indlæses tre mikroliter af snRNA-blandingen i nålen, og nålen monteres i mikroinjektorens holder i en vinkel på 45 grader med hensyn til petriskålens overflade. Brug en 10X langdistance mål for at finde nålen.Først skal du indstille hastigheden grove på injektoren og sænke nålen, indtil den rører kulturmediet. Brug mikroskop kikkerten, find det lyse punkt, som er det sted, hvor nålen rører kulturmediet. Skift hastigheden til fine og yderligere sænke nålen, mens man ser ind i mikroskopet, indtil spidsen af nålen er observeret.Flyt nålen i midten af synsfeltet og skift til en 40X langdistance mål. Derefter skal du markere cellen og flytte nålen over cellen. Indstil trykket og tiden for cellekontakten.Flyt nålen ned i cellen, og angiv derefter mikromanipulatorens nedre grænse. Angivelse af den nedre grænse er den mest kritiske del af protokollen. Da coverslip overflade ikke er perfekt, og fordi hver celle er forskellig, bliver du nødt til at indstille den nedre grænse flere gange i løbet af injektionsessionen.Flyt derefter nålen tilbage over cellen, og tryk på injektionsknappen på injektorens joystick. Nålen vil bevæge sig automatisk inde i cellen til det sted, hvor grænsen er indstillet til at injicere RNA blandingen. Tryk på menuknappen på injektoren, og fjern nålen fra holderen.Tag derefter røret ud af injektoren, før injektoren og mikromanipulatoren slukkes. Efter mikroinjektion, returnere cellerne til en kuldioxid inkubator og inkubere ved 37 grader Celsius i en time. Skyl derefter cellerne tre gange med PBS ved stuetemperatur.Fastgør cellerne i 20 minutter med 4% paraformaldehyd i 0,1 kindtandrør ved pH 6,9. Derefter vaskes cellerne tre gange med rumtemperatur PBS. Hvis kun snRNA-lokalisering analyseres, skal cellerne kortvarigt skylles i vand og monteres i et monteringsmed DAPI.I tilfælde af yderligere protein lokalisering, permeabilize cellerne med 0,5% Triton X-100 i PBS i fem minutter ved stuetemperatur. Skyl cellerne tre gange med PBS og plette dem med de relevante primære og sekundære antistoffer som beskrevet i tekstprotokollen. Skyl derefter tre gange med PBS og skyl en gang i vand.Derefter monteres cellerne i et monteringsmedium med DAPI. Når du er klar til at billedet, skal du bruge en high-end fluorescens mikroskopisk system udstyret med en nedsænkning mål at erhverve billederne. Når de mikroinjslede celler er identificeret, indsamles en stak på 20 Z sektioner med 200 nanometer Z trin pr prøve og underlagt matematisk deconvolution.Hvis du vil kvantificere fluorescerende signalet, skal du først åbne mikroskopibilledet i ImageJ og opdele kanaler i vinduer. Synkroniser vinduer med værktøjet til synkronisering af vindue. Dernæst trække regionen af interesse omkring en Cajal organ identificeret ved coilin immunostaining.Mål intensiteten af snRNA-signalet i det coilindefinerede INVESTERINGSAFKAST. Bestemmes intensiteten af snRNA fluorescens i ROI tilfældigt placeret i nukleoplasmen. Gem målte værdier og beregne forholdet mellem RNA-signal i Cajal krop og nukleoplasme.I denne undersøgelse, fluorescerende mærket snRNAs er microinjected for at overvåge deres transport inde i cellen. For at teste, om SM site er vigtigt for Cajal krop ophobning, snRNA mangler SM site er microinjected direkte ind i kernen. Injektion i cytoplasmaet fungerer som en kontrol, mens fuld længde snRNA er microinjected at tjene som en positiv kontrol.Efter inkubation, mikroinjected celler er faste og Cajal krop markør coilin visualiseres ved indirekte immunfluorescens. Den fulde længde snRNA akkumuleret i Cajal organer efter både nukleare og cytoplasmatiske injektioner. I modsætning hertil forblev snRNA mangler SM site i cytoplasmaet efter mikroinjektion i dette rum, mens den nukleare mikroinjektion af snRNA uden SM site afslører, at SM bindende sekvens er vigtigt for Cajal krop lokalisering som denne snRNA forbliver i kernen, men ikke ophobes i Cajal organer.Nogle gange mikroinjektion i kun én cellulære rum mislykkes og lokket Dextran 70 kilodalton kan findes i både kernen og cytoplasmaet. Disse celler kasseres fra yderligere analyse. På trods af at de fluorescerende mærket snRNAs opbevares ved negative 80 grader Celsius før injektionen, kan RNA nedbrydning forekomme.Nedbrudt snRNA, der sprøjtes ind i cytoplasmaet, transporteres ikke ind i kernen og forbliver lokaliseret i cytoplasmaet. Sådanne snRNA skal kasseres, og nyt snRNA skal syntetiseres. Det er vigtigt at justere injektions- og kompenserende tryk korrekt for din celletype.Og som sagt før, indstilling korrekt nedre grænse for celle injektion er afgørende for en god mikroinjektion. Husk, at den phenol-chloroform, der anvendes under RNA-isolation, er farlig, og at mikroinjektionsnålen er en skarp genstand. Vær forsigtig, når du håndterer disse materialer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Elektrofysiologiske målinger og analyser af nociception i Human Spædbørn

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering af dendritter og udløberne i mus cerebrale cortex og hippocampus under anvendelse<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipuleringer af genekspression i Adult zebrafisk Brain Brug Cerebroventricular mikroinjektion af Morpholino oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Kvantificering af cerebral vaskulær arkitektur ved hjælp af to-foton mikroskopi i en musemodel af HIV-induceret Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantificering af endosom og lysosommotiliteter i dyrkede neuroner ved anvendelse af fluorescerende prober

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

I Vivo Målretning af neurale progenitor celler i Ferret Neocortex ved In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...