Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Tsjechische wetenschaps Stichting (18-10035S), het nationaal duurzaamheidsprogramma I (LO1419), institutionele ondersteuning (RVO68378050), het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) en het subsidie Bureau van Universiteit van Charles (GAUK 134516). Verder erkennen we de Lichtmicroscopie kern faciliteit, IMG CAS, Praag, Tsjechië (ondersteund door subsidies (Tsjechisch-Bioimaging-LM2015062).

1. bereiding van Snrna's voor micro Injection
<ol><li>Bereid een DNA-template met de volledige of afgeknotte/gemuleerde versie van snRNA door PCR met behulp van een volgende PCR-instelling: 98 °C voor 60 s, 98 °C voor 15 s, 68 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 1 minuut, 98 °C gedurende 15 sec. voor 35x en 72 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>De voorwaartse primer moet een volgorde van de organisator voor in vitro transcriptie bevatten, net stroomopwaarts van het eerste getranscribeerde nucleotide. Amplificatie U2 snRNA-s...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

We werkten met Microinjection van fluorescently gelabelde Snrna's om sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor snRNA-lokalisatie in nucleaire Cajal-lichamen. Door een snelle en vrij eenvoudige bereiding van gelabelde Rna's (voorbereiding van DNA-Template door PCR gevolgd door in vitro transcriptie) biedt de methode een effectieve analyse van hoe verschillende sequenties bijdragen aan RNA lokalisatie. In relatief korte tijd konden we tien verschillende verwijderingen of vervangingen van het snRNA van U2 (referentie<s...

RNA splicing is een van de cruciale stappen in genexpressie, die wordt gekatalyseerd door een groot RiboNucleoProteïne complex genaamd de spliceosome. In totaal zijn meer dan 150 eiwitten en 5 kleine nucleaire rna's (snrna's) geïntegreerd in de spliceosoom in verschillende stadia van het splicing traject. De Snrna's U1, U2, U4, U5 en U6 nemen deel aan de splitsing van de grote GU-AG introns. Deze snrna's voegen zich bij de spliceosoom als voorgevormde kleine nucleaire RiboNucleoProteïne deeltjes (snrnps) die snrna bevatten, zeven SM-eiwitten geassocieerd met snrna (of like-SM-eiwitten, die associëren met de U6 snrna) en 1-12 eiwitten die specifiek zijn voor elke snRNP.
Assemblage van snRNPs omvat cytoplasmatische en nucleaire stadia. Nieuw getranscribeerd snRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma waar het verwerft een ring geassembleerd uit zeven SM-eiwitten. De SM-ring dient vervolgens als een signaal voor het opnieuw importeren van snRNA terug naar de Nucleus. Defecte Snrna's die niet associëren met SM eiwitten worden bewaard in het cytoplasma1. Nieuw geïmporteerde snrnps verschijnen eerst in het lichaam van Cajal waar ze snRNP-specifieke eiwitten ontmoeten en hun rijping voltooien (beoordeeld in referentie2,3). We hebben onlangs aangetoond dat remming van de uiteindelijke rijpings stappen resulteert in vastlegging van onrijpe snrnps in Cajal-lichamen4,5. We stelden een model voor waarbij de uiteindelijke rijping van snRNP onder kwaliteitscontrole is die de toevoeging van snRNP-specifieke eiwitten en de vorming van actieve snRNPs bewaakt. Echter, moleculaire Details van hoe cellen onderscheid maken tussen correct geassembleerde volwassen en afwijkende onvolgroeide deeltjes blijven ongrijpbaar.
Om snRNA-sequenties te bepalen die essentieel zijn voor de targeting en accumulatie van Snrna's in nucleaire Cajal-lichamen, hebben we besloten om micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's in gebruik te nemen. Micro Injection was een methode van keuze omdat: 1) het vereist geen extra sequentie tag om synthetische Snrna's te onderscheiden van hun endogene tegenhangers, wat vooral belangrijk is voor korte Rna's met weinig ruimte voor het inbrengen van extra tagvolgorde; 2) het maakt analyse van sequenties die belangrijk zijn voor biogenese. De SM-reeks is bijvoorbeeld essentieel voor SM-ring assemblage en opnieuw importeren in de Nucleus6. Wanneer Snrna's worden uitgedrukt in de cel, Snrna's ontbreekt de SM sequentie zijn afgebroken in het cytoplasma en niet bereiken de Nucleus en Cajal lichamen7. Echter, Snrna's zonder de SM sequentie kunnen direct microgeïnjecteerd in de Nucleus en dus een mogelijke rol van de SM sequentie in Cajal lichaam lokalisatie geassageerd.
Hier beschrijven we in detail een micro injectie methode die we hebben toegepast om snRNA-sequenties te bepalen die nodig zijn om Snrna's in de Cajal-Body5te targeten. We toonden aan dat SM en SMN binding sites samen noodzakelijk en voldoende zijn om niet alleen Snrna's te lokaliseren, maar verschillende korte niet-Codeer Rna's in het Cajal lichaam. Op basis van Microinjection en ander bewijs, stelden we voor dat de SM-ring die op de SM-bindingsplaats is geassembleerd, het Cajal-lichaam lokalisatie signaal is.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

Biogenese van spliceosomale Snrna's is een complex proces waarbij zowel nucleaire als cytoplasmatische fasen en de laatste stap optreedt in een nucleair compartiment genaamd de Cajal lichaam. Echter, sequenties die direct snRNA lokalisatie in deze subnucleaire structuur zijn niet bekend tot voor kort. Om de sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor accumulatie van Snrna's in Cajal-lichamen, werkten we met micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's, gevolgd door hun lokalisatie in cellen. Eerst bereidden we snRNA deletie mutanten voor, synthetiseerde DNA templates voor in vitro transcriptie en transcribeerde Snrna's in aanwezigheid van UTP in combinatie met Alexa488. Gelabelde Snrna's werden gemengd met 70 kDa-dextran geconjugeerd met TRITC, en microgeïnjecteerde naar de Nucleus of het cytoplasma van menselijke HeLa cellen. Cellen werden gedurende 1 uur geïnincubeerd en de Cajal-Body marker coilin werd gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie, terwijl Snrna's en dextran, die dient als een marker van nucleaire of cytoplasmatische injectie, direct werden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Deze methode maakt het mogelijk om efficiënt en snel te testen hoe verschillende sequenties de RNA lokalisatie in cellen beïnvloeden. Hier tonen we het belang van de SM-bindende sequentie voor efficiënte lokalisatie van Snrna's in de Cajal-body.

Voor het monitoren van snRNA lokalisatie en de rol van de SM binding site in Cajal Body targeting, bereidden we een DNA-template voor met de T7 promoter en ofwel de full-length U2 snRNA of U2 snRNA zonder de zeven nucleotiden (AUUUUUG) die de SM binding site vormen. Snrna's werden in vitro getranscribeerd, geïsoleerd en vermengd met TRITC-gekoppelde dextran-70kDa. We microgeïnjecteerde het mengsel dat in vitro getranscribeerd snRNA in de Nucleus of het cytoplasma van HeLa cellen.
Er is al ee...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.

Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Hier hebben we micro-injectie van fluorescerende RNAs toegepast om RNA-sequenties te detecteren die essentieel zijn voor de lokalisatie van korte nucleaire RNAs in nucleaire structuren genaamd Cajal-lichamen. Deze techniek heeft twee grote voordelen. Ten eerste kan het worden toegepast voor korte RNAs die anders moeilijk te labelen en te volgen zijn.En ten tweede, het maakt een snelle screening van verschillende sequenties en het testen van hun rol in RNA lokalisatie. Een dag voor micro-injectie, zaad HeLa of andere aanhangende cellen op 12 millimeter coverslips tot 50% samenvloeiing te bereiken op het moment van microinjectie. Om te beginnen, plaats een voorbereide coverslip in het midden van een petrischaal, voeg cellen en twee millimeter van de cultuur media.De volgende dag, plaats de cel gevuld petri schotel op een microscoop podium. Met behulp van een microloader laad je drie microliters van het snRNA-mengsel in de naald en installeer je de naald in de houder van de microinjector onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak van de petrischaal. Gebruik een doelstelling van 10x lange afstand om de naald te vinden.Stel eerst de snelheid grof op de injector en laat de naald zakken totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de microscoop verrekijker, vind het lichtpunt dat is de plaats waar de naald raakt de cultuur medium. Verander de snelheid in boete en verder lager de naald tijdens het kijken in de microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen.Verplaats de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over naar een doelstelling van 40x lange afstand. Selecteer hierna de cel en beweeg de naald boven de cel. Stel de druk en tijd in voor het celcontact.Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens van de micromanipulator in. Het instellen van de ondergrens is het meest kritieke deel van het protocol. Omdat het coverslipoppervlak niet perfect is en omdat elke cel anders is, moet u tijdens de injectiesessie meerdere keren de ondergrens instellen.Beweeg vervolgens de naald terug boven de cel en druk op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt zich automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld om het RNA-mengsel te injecteren. Als u wilt voltooien, drukt u op de menuknop op de injector en verwijdert u de naald van de houder.Koppel vervolgens de buis los van de injector voordat u de injector en de micromanipulator uitschakelt. Breng na de microinjectie de cellen terug naar een koolstofdioxide-incubator en broed gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de cellen drie keer met PBS bij kamertemperatuur.Bevestig de cellen gedurende 20 minuten met 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire pijpen bij pH 6.9. Was vervolgens de cellen drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA lokalisatie wordt geanalyseerd, kort spoelen van de cellen in water en monteren in een montagemedium met DAPI.In het geval van extra eiwitlokalisatie, permeabiliseren de cellen met 0,5%Triton X-100 in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen drie keer af met PBS en bevlek ze met de juiste primaire en secundaire antilichamen zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel vervolgens drie keer met PBS en spoel één keer in water.Monteer hierna de cellen in een montagemedium met DAPI. Wanneer klaar om te beelden, gebruik maken van een high-end fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een onderdompeling doelstelling om de beelden te verwerven. Zodra de microinjected cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 Z secties met 200 nanometer Z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie.Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, opent u eerst het microscopiebeeld in ImageJ en splits u kanalen in vensters. Vensters synchroniseren met het gereedschap Venster synchroniseren. Trek vervolgens het gebied van belang rond een Cajal lichaam geïdentificeerd door coilin immunostaining.Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de coilin-gedefinieerde ROI. Bepaal de intensiteit van snRNA fluorescentie in ROI willekeurig geplaatst in het nucleoplasma. Sla gemeten waarden op en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het Cajal-lichaam en nucleoplasma.In deze studie worden fluorescerende snRNAs gemicroinjecteerd om hun transport in de cel te controleren. Om te testen of de SM-site belangrijk is voor cajal lichaam accumulatie, snRNA ontbreekt de SM-site is direct microinjected in de kern. Injectie in het cytoplasma dient als een controle, terwijl de volledige lengte snRNA is microinjected om te dienen als een positieve controle.Na incubatie worden microinjected cellen gefixeerd en wordt de Cajal body marker coilin gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie. De volledige lengte snRNA opgebouwd in Cajal lichamen na zowel nucleaire en cytoplastische injecties. In tegenstelling, snRNA ontbreekt de SM site bleef in het cytoplasma na microinjectie in dit compartiment, terwijl de nucleaire micro-injectie van snRNA zonder de SM site blijkt dat de SM bindende sequentie is belangrijk voor Cajal lichaam lokalisatie als dit snRNA blijft in de kern, maar niet accumuleren in Cajal organen.Soms is de micro-injectie in slechts een cellulaire compartiment mislukt en bedrogen Dextran 70 kilodalton kan worden gevonden in zowel de kern en het cytoplasma. Deze cellen worden verwijderd uit verdere analyse. Ondanks het feit dat de fluorescerende snRNAs worden opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius vóór de injectie, kan RNA-afbraak optreden.Gedegradeerd snRNA geïnjecteerd in het cytoplasma wordt niet vervoerd in de kern en blijft gelokaliseerd in het cytoplasma. Dergelijke snRNA moet worden weggegooid en nieuwe snRNA moet worden gesynthetiseerd. Het is belangrijk om de injectie- en compenserende druk voor uw celtype correct aan te passen.En zoals eerder gezegd, het instellen van de juiste ondergrens voor celinjectie is essentieel voor een goede microinjectie. Houd er rekening mee dat de fenol-chloroform die wordt gebruikt tijdens RNA-isolatie gevaarlijk is en dat de microinjectienaald een scherp voorwerp is. Wees voorzichtig bij het hanteren van deze materialen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Elektrofysiologische metingen en analyse van Nociceptie in Human Zuigelingen

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...