Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation tchèque pour la science (18-10035S), le Programme national de développement durable I (LO1419), le soutien institutionnel (RVO68378050), le Fonds européen de développement régional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775) et l'Agence de subventions de Université Charles (GAUK 134516). Nous reconnaissons en outre le Centre de microscopie légère, IMG CAS, Prague, République tchèque (soutenu par des subventions (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. Préparation des snARN pour la microinjection
<ol><li>Préparer un modèle d'ADN contenant la version intégrale ou tronquée/mutée de l'ARNs par PCR à l'aide d'une configuration PCR suivante : 98 oC pour 60 s, 98 oC pour 15 s, 68 oC pour 30 s, 72 oC pour 1 min, 98 oC pour 15 s pour 35x , et 72 oC pendant 5 min.</li>
	<li>L'apprêt avant doit contenir une séquence de promoteur pour la transcription in vitro juste en amont du premier nucléotide transcrit. Amplifiez la séquence snRNA de U2 à l'aide de l'amorce a...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

Nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents pour déterminer des séquences importantes pour la localisation de snRNA dans les corps nucléaires de Cajal. En raison de la préparation rapide et assez simple des ARN étiquetés (préparation du modèle d'ADN par PCR suivi de la transcription in vitro), la méthode offre une analyse efficace de la façon dont les différentes séquences contribuent à la localisation de l'ARN. En relativement peu de temps, nous avons pu analyser dix suppressions ou substi...

L'épissage de l'ARN est l'une des étapes cruciales dans l'expression des gènes, qui est catalysée par un grand complexe de ribonucléoprotéines appelé l'épiscédsome. Au total, plus de 150 protéines et 5 petits ARN nucléaires (ARNN) sont intégrés dans l'épisséoce à différents stades de la voie d'épissage. Les snRNAS U1, U2, U4, U5 et U6 participent à l'épissage des principaux introns GU-AG. Ces snRNAs se joignent à l'épiscédsome comme petites particules de ribonucléoprotéines nucléaires préformées (snRNPs) qui contiennent de l'ARNs, sept protéines Sm associées à l'ARSS (ou protéines Like-Sm, qui s'associent à l'ARNT U6) et 1-12 protéines spécifiques pour chaque snRNP.
L'assemblage des snRNPs implique des étapes cytoplasmiques et nucléaires. L'ARS nouvellement transcrit est exporté vers le cytoplasme où il acquiert un anneau assemblé à partir de sept protéines Sm. L'anneau Sm sert par la suite de signal pour la réimportation de l'ARNds vers le noyau. Les snARN défectueux qui ne s'associent pas aux protéines Sm sont conservés dans le cytoplasme1. Les snRNP nouvellement importés apparaissent pour la première fois dans le corps de Cajal où ils rencontrent des protéines spécifiques au snRNP et terminent leur maturation (revue en référence2,3). Nous avons récemment montré que l'inhibition des étapes finales de maturation entraîne la séquestration des snRNPs immatures dans les corps de Cajal4,5. Nous avons proposé un modèle où la maturation finale de snRNP est sous contrôle de qualité qui surveille l'addition des protéines snRNP-spécifiques et la formation des snRNPs actifs. Cependant, les détails moléculaires de la façon dont les cellules font la distinction entre les particules matures et immatures aberrantes correctement assemblées restent insaisissables.
Pour déterminer les séquences d'ARNs qui sont essentielles pour le ciblage et l'accumulation des ARNs dans les corps nucléaires de Cajal, nous avons décidé d'utiliser la microinjection de snRNAs fluorescents. La microinjection était une méthode de choix parce que : 1) il ne faut pas une étiquette de séquence supplémentaire pour distinguer les snRNAs synthétiques forment leurs homologues endogènes qui est particulièrement important pour les ARN courts avec peu d'espace pour l'insertion de séquence supplémentaire d'étiquette ; 2) il permet l'analyse des séquences qui sont importantes pour la biogenèse. Par exemple, la séquence Sm est essentielle pour l'assemblage de l'anneau Sm et la réimportation dans le noyau6. Lorsque les snRNAS sont exprimés dans la cellule, les snRNAs dépourvus de la séquence Sm sont dégradés dans le cytoplasme et n'atteignent pas le noyau et les corps cajal7. Cependant, les snRNAs sans la séquence Sm peuvent être directement microinjectés dans le noyau et donc un rôle potentiel de la séquence Sm dans la localisation du corps Cajal a été mis en compte.
Ici, nous décrivons en détail une méthode de microinjection que nous avons appliquée pour déterminer les séquences snRNA nécessaires pour cibler les ARNs dans le corps cajal5. Nous avons montré que les sites de liaison Sm et SMN sont ensemble nécessaires et suffisants pour localiser non seulement les ARN, mais aussi divers ARN courts non codants dans le corps de Cajal. Sur la base de la microinjection ainsi que d'autres preuves, nous avons proposé que l'anneau Sm assemblé sur le site de liaison Sm est le signal de localisation du corps Cajal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant des phases nucléaires et cytoplasmiques et la dernière étape se produit dans un compartiment nucléaire appelé le corps de Cajal. Cependant, les séquences qui dirigent la localisation de l'ARNs dans cette structure sous-nucléaire n'ont pas été connues jusqu'à récemment. Pour déterminer des séquences importantes pour l'accumulation des snRNAs dans les corps de Cajal, nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents étiquetés suivis de leur localisation à l'intérieur des cellules. Tout d'abord, nous avons préparé des mutants de suppression de snRNA, synthétisé des modèles d'ADN pour la transcription in vitro et snRNAs transcrits en présence de l'UTP couplé avec Alexa488. Les snARN étiquetés ont été mélangés avec 70 kDa-Dextran conjugués avec TRITC, et microinjectés au noyau ou au cytoplasme des cellules humaines de HeLa. Les cellules ont été incubées pendant 1 h et fixes et la coiline de marqueur de corps de Cajal a été visualisée par immunofluorescence indirecte, alors que les snARN et le dextran, qui sert de marqueur de l'injection nucléaire ou cytoplasmique, ont été observés directement utilisant une microscope fluorescence. Cette méthode permet des tests efficaces et rapides de la façon dont diverses séquences influencent la localisation de l'ARN à l'intérieur des cellules. Ici, nous montrons l'importance de la séquence Sm-contraignante pour une localisation efficace des arnaques dans le corps cajal.

Pour surveiller la localisation de snRNA et le rôle du site de liaison de Sm dans le ciblage de corps de Cajal, nous avons préparé un modèle d'ADN contenant le promoteur de T7 et l'ARNs de S2 pleine longueur ou le snRNA de U2 manquant les sept nucléotides (AUUUUUG) formant le site de liaison de Sm. les snRNAs ont été transcrits in vitro, isolés et mélangés avec le dextran-70kDa TRITC-coupled. Nous avons microinjecté le mélange contenant l'ARNs transcrit in vitro dans le noyau ou le cytoplasme des cellules de ...

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Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant divers compartiments cellulaires. Ici, nous avons utilisé la microinjection de snRNAs fluorescents afin de surveiller leur transport à l'intérieur de la cellule.

Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Ici, nous avons appliqué la microinjection d’ARN étiquetés fluorescents pour détecter les séquences d’ARN qui sont essentielles à la localisation des ARN nucléaires courts dans des structures nucléaires appelées corps cajal. Cette technique présente deux avantages majeurs. Tout d’abord, il peut être appliqué pour les ARN courts qui sont par ailleurs difficiles à étiqueter et à suivre.Et deuxièmement, il permet le dépistage rapide de différentes séquences et de tester leur rôle dans la localisation de l’ARN. Un jour avant la microinjection, les graines HeLa ou d’autres cellules adhérentes sur des coverslips de 12 millimètres pour atteindre 50% de confluence au moment de la microinjection. Pour commencer, placez un coverslip préparé au centre d’une boîte de Petri, ajoutez des cellules et deux millimètres de médias culturels.Le lendemain, placez la boîte de Pétri remplie de cellules sur une scène de microscope. À l’aide d’un microchargeur, charger trois microlitres du mélange de snRNA dans l’aiguille et installer l’aiguille dans le support du microinjecteur à un angle de 45 degrés par rapport à la surface de la boîte de Pétri. Utilisez un objectif 10X longue distance pour trouver l’aiguille.Tout d’abord, réglez la vitesse grossière sur l’injecteur et abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche le milieu de culture. À l’aide des jumelles au microscope, trouvez le point lumineux qui est l’endroit où l’aiguille touche le milieu de culture. Changez la vitesse pour affiner et abaisser davantage l’aiguille tout en regardant dans le microscope jusqu’à ce que le bout de l’aiguille soit observé.Déplacez l’aiguille au milieu du champ visuel et passez à un objectif 40X longue distance. Après cela, sélectionnez la cellule et déplacez l’aiguille au-dessus de la cellule. Réglez la pression et le temps pour le contact cellulaire.Déplacez l’aiguille vers le bas dans la cellule, puis réglez la limite inférieure du micromanipulateur. La fixation de la limite inférieure est la partie la plus critique du protocole. Parce que la surface de coverslip n’est pas parfaite et parce que chaque cellule est différente, vous devrez définir la limite inférieure plusieurs fois pendant la session d’injection.Ensuite, déplacez l’aiguille au-dessus de la cellule et appuyez sur le bouton d’injection sur le joystick de l’injecteur. L’aiguille se déplacera automatiquement à l’intérieur de la cellule à l’endroit où la limite est définie pour injecter le mélange d’ARN. Pour terminer, appuyez sur le bouton du menu sur l’injecteur et retirez l’aiguille du support.Déconnectez ensuite le tube de l’injecteur avant d’éteindre l’injecteur et le micromanipulateur. Après la microinjection, retourner les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, rincez les cellules trois fois avec du PBS à température ambiante.Fixer les cellules pendant 20 minutes avec 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 tuyaux molaires au pH 6,9. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec la température ambiante PBS. Si seule la localisation de l’ARNN est analysée, rincez brièvement les cellules à l’eau et montez dans un milieu de montage avec DAPI.En cas de localisation supplémentaire des protéines, perméabiliser les cellules avec 0,5%Triton X-100 en PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Rincez les cellules trois fois avec du PBS et tachez-les avec les anticorps primaires et secondaires appropriés tels que décrits dans le protocole de texte. Rincez ensuite trois fois avec PBS et rincez une fois à l’eau.Après cela, monter les cellules dans un milieu de montage avec DAPI. Lorsque vous êtes prêt à l’image, utilisez un système microscopique de fluorescence haut de gamme équipé d’un objectif d’immersion pour acquérir les images. Une fois que les cellules microinjectées sont identifiées, recueillir une pile de 20 sections Z avec 200 étapes Z nanométriques par échantillon et soumis à la déconvolution mathématique.Pour quantifier le signal fluorescent, ouvrez d’abord l’image de microscopie dans ImageJ et divisez les canaux en fenêtres. Synchronisez les fenêtres par l’outil de fenêtre de synchronisation. Ensuite, dessinez la région d’intérêt autour d’un corps de Cajal identifié par immunostaining de bobine.Mesurer l’intensité du signal snRNA dans le retour sur investissement défini par la bobine. Déterminer l’intensité de la fluorescence du snRNA dans le retour sur investissement placé au hasard dans le nucléoplasme. Enregistrez les valeurs mesurées et calculez le rapport du signal d’ARN dans le corps et le nucléoplasme de Cajal.Dans cette étude, les snARN étiquetés fluorescents sont microinjectés afin de surveiller leur transport à l’intérieur de la cellule. Pour vérifier si le site SM est important pour l’accumulation du corps de Cajal, l’ARN snRNA dépourvu du site SM est microinjecté directement dans le noyau. L’injection dans le cytoplasme sert de contrôle tandis que l’ARN snRNA pleine longueur est microinjecté pour servir de contrôle positif.Après incubation, les cellules microinjectées sont fixées et la bobine du marqueur du corps cajal est visualisée par immunofluorescence indirecte. Le snRNA pleine longueur s’est accumulé dans les corps de Cajal après des injections nucléaires et cytoplasmiques. En revanche, le snRNA n’ayant pas le site SM est resté dans le cytoplasme après microinjection dans ce compartiment tandis que la microinjection nucléaire de snRNA sans le site SM révèle que la séquence de liaison SM est importante pour la localisation du corps de Cajal car ce snRNA reste dans le noyau mais ne s’accumule pas dans les corps de Cajal.Parfois, la microinjection dans un seul compartiment cellulaire échoue et trompé Dextran 70 kilodalton peut être trouvé à la fois dans le noyau et le cytoplasme. Ces cellules sont écartées d’une analyse plus approfondie. Malgré le fait que les snARN étiquetés fluorescents sont stockés à 80 degrés Celsius négatifs avant l’injection, la dégradation de l’ARN peut se produire.Le snRNA dégradé injecté dans le cytoplasme n’est pas transporté dans le noyau et reste localisé dans le cytoplasme. Un tel ARNN doit être rejeté et un nouvel ARNn doit être synthétisé. Il est important d’ajuster correctement les pressions d’injection et de compensation pour votre type de cellule.Et comme dit auparavant, fixer une limite inférieure correcte pour l’injection cellulaire est essentiel pour une bonne microinjection. S’il vous plaît rappelez-vous que le phénol-chloroforme utilisé pendant l’isolement de l’ARN est dangereux et que l’aiguille de microinjection est un objet pointu. Soyez prudent lors de la manipulation de ces matériaux.

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