Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הצ (18-10035S), התוכנית הלאומית לקיימות I (LO1419), תמיכה מוסדית (RVO68378050), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (COM. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) וסוכנות המענק של אוניברסיטת צ'רלס (GAUK 134516). אנו מכירים בנוסף את מתקן הליבה של מיקרוסקופ האור, IMG CAS, פראג, צ'כיה (נתמך על ידי מענקים (צ'כית-Bioimaging-LM2015062).

1. הכנת מיקרונס למיקרו-מזרקה
<ol><li>הכנת תבנית DNA המכילה את הגירסה באורך מלא או מעוגל/מוטציה של snRNA על ידי ה-PCR באמצעות ההתקנה הבאה PCR: 98 ° c עבור 60 s, 98 ° צ' עבור 15 s, 68 ° c עבור 30, 72 ° c עבור 1 דקות, 98 ° צ' עבור 15 s עבור 35x , ו 72 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>התחל הקדמי חייב להכיל רצף מיזם עבור שעתוק מבחנה בדיוק במעלה ה?...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

אנו המועסקים מיקרוהזרקה של המסומנת מתויג snRNAs כדי לקבוע רצפים חשובים עבור snRNA לוקליזציה לתוך הגופים הגרעיניים Cajal. בשל הכנה מהירה ופשוטה למדי של RNAs מתויג (הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR ואחריו שעתוק מבחנה) השיטה מציעה ניתוח אפקטיבי של איך רצפים שונים תורמים ללוקליזציה של RNA. בזמן קצר יחסית, הצלחנו ל...

שחבור ה-RNA הוא אחד השלבים הקריטיים בביטוי הגנים, אשר מזרז על ידי מתחם ribonucleoprotein גדול הנקרא מתחת לתחתית. בסך הכל, יותר מ 150 חלבונים ו-5 RNAs גרעיני קטן (snRNAs) משולבים לתוך מתחת שלבים בשלבים שונים של המסלול השחבור. U1, U2, U4, U5 ו U6 snRNAs משתתפים בהשתתפות של introns הגדולות גו-AG. SnRNAs אלה להצטרף המאחדים כמו טרום בנוי חלקיקים גרעיניים גרעינית קטנה (Snrnas) המכילים snRNA, שבעה חלבונים Sm הקשורים snRNA (או כמו-Sm חלבונים, אשר מקשרים עם U6 snRNA) ו 1-12 חלבונים ספציפיים עבור כל Snrnas.
הרכבת של snRNPs כוללת cytoplasmic ושלבים גרעיניים. שופץ לאחרונה snRNA מיוצא אל הציטופלסמה שבו הוא רוכש טבעת שנאספו מתוך שבעה חלבונים Sm. הטבעת Sm משמש לאחר מכן כאות לייבא snRNA מחדש חזרה לגרעין. SnRNAs פגומים שאינם משייכים עם חלבונים Sm נשמרים בציטופלסמה1. מיובא snrnps החדש להופיע לראשונה בגוף cajal שבו הם פוגשים snrnps-ספציפיים חלבונים ולסיים את ההבשלה שלהם (נבדקו בהתייחסות2,3). לאחרונה הראינו כי עיכוב של שלבי ההבשלה הסופי תוצאות בקיבוע על של snrnps בוגר בגוף cajal4,5. הצעת מודל שבו ההבשלה snRNP הסופי הוא תחת שליטה איכותית כי מפקחת תוספת של חלבונים ספציפיים snRNP והיווצרות Snrnp פעיל. עם זאת, פרטים מולקולריים של האופן שבו תאים מבחינים בין חלקיקים בוגרים שאינם מפותחים בצורה נכונה, נותרים חמקמקים.
כדי לקבוע רצפים snRNA כי הם חיוניים עבור המיקוד והצטברות של snRNAs בגופים הגרעין Cajal, החלטנו להעסיק מיקרוהזרקה של הסימון מתויג של snRNAs. מיקרוהזרקה היתה שיטה של בחירה כי: 1) זה לא דורש תג רצף נוסף כדי להבחין snRNAs סינתטי טופס עמיתיהם האנדוגניים שהוא חשוב במיוחד עבור RNAs קצר עם מעט מקום להוספה של רצף תג נוסף; 2) הוא מאפשר ניתוח רצפים החשובים עבור biogenesis. לדוגמה, רצף Sm חיוני להרכבת הטבעת Sm ולייבא מחדש לתוך הגרעין6. כאשר snRNAs מבוטא בתא, snRNAs חסר הרצף Sm מושפל בציטופלסמה ולא להגיע הגרעין הגופים Cajal7. עם זאת, snRNAs ללא רצף Sm יכול להיות ישירות מיקרו לתוך הגרעין ולכן תפקיד פוטנציאלי של רצף Sm ב Cajal לוקליזציה של הגוף.
כאן, אנו מתארים בפירוט שיטת מיקרו הזרקה שאנו מיושמים כדי לקבוע רצפים snRNA הנחוצים למקד snRNAs לתוך הגוף Cajal5. הראנו כי האתרים מחייב Sm ו SMN הם ביחד הכרחי ומספיק כדי להתאים לא רק snRNAs, אך שונים RNAs ללא קידוד קצר לתוך הגוף Cajal. מבוסס על הזרקת מיקרו כמו גם ראיות אחרות, הציעו כי טבעת Sm התאספו על האתר מחייב Sm הוא אות הגוף Cajal לוקליזציה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

ביוגנזה של snRNAs התחתית הוא תהליך מורכב הכרוך הן בשלבים גרעינית, cytoplasmic והשלב האחרון מתרחש בתוך תא גרעיני בשם הגוף Cajal. עם זאת, רצפים הישירים לוקליזציה snRNA למבנה זה תת גרעיני לא ידוע עד לאחרונה. כדי לקבוע רצפים חשובים עבור הצטברות של snRNAs בגופים Cajal, אנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שלהם snRNAs ואחריו הלוקליזציה שלהם בתוך תאים. ראשית, הכנו snRNA מוטנטים מוטציות, מסונתז תבניות דנ א עבור תמלול ושעתוק והעתק snRNAs בנוכחות של UTP ביחד עם Alexa488. מתויג snRNAs היו מעורבים עם 70 kDa-Dextran מצועם TRITC, ו מיקרווזרק לגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה האדם. תאים היו מודבטים עבור 1 h ו קבוע את הסמן הגוף Cajal לאסוף היה דמיינו על ידי immunofluorescence עקיף, בעוד snRNAs ו dextran, אשר משמש כסמן של הזרקה גרעינית או cytoplasmic, נצפו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה ומהירה של איך רצפים שונים להשפיע לוקליזציה RNA בתוך תאים. כאן, אנו מראים את החשיבות של רצף מחייב-Sm ללוקליזציה יעיל של snRNAs לתוך הגוף Cajal.

כדי לנטר snRNA לוקליזציה ואת התפקיד של האתר מחייב Sm מיקוד הגוף Cajal, הכנו תבנית DNA המכילה את היזם T7 או באורך מלא U2 snRNA או U2 snRNA חסר שבעת נוקלאוטידים (AUUUUUG) להרכיב את האתר מחייב Sm. , מבודדים ומעורבבים בעזרת טריTC. עם דקטרן-70kDa אנו מזריקים את התערובת המכילה בתוך מבחנה מתורבת snRNA לתוך הגרעין או ציטופלסמה ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

ביוגנזה של snRNAs של הספנסאוסיס הוא תהליך מורכב הכולל תאים סלולריים שונים. כאן, אנחנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שוכרים snRNAs כדי לפקח על ההובלה שלהם בתוך התא.

ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

כאן יישמו microinjection של RNAs שכותרתו פלואורסצנטי לזהות רצפי RNA אשר חיוניים לוקליזציה של RNAs גרעיניים קצרים לתוך מבנים גרעיניים הנקראים גופים Cajal. לטכניקה זו יש שני יתרונות עיקריים. ראשית, ניתן להחיל אותו על RNAs קצרים שאחרת קשה לסמן ולעקוב אחריהם.ושנית, זה מאפשר סינון מהיר של רצפים שונים ובדיקת תפקידם לוקליזציה RNA. יום אחד לפני microinjection, זרעי HeLa או תאים חסידים אחרים על 12 מילימטר מכסה כדי להגיע 50% confluency בזמן microinjection. כדי להתחיל, למקם כיסוי מוכן למרכז צלחת פטרי, להוסיף תאים ושני מילימטרים של מדיה תרבותית.למחרת, מניחים את צלחת פטרי מלא התא על שלב מיקרוסקופ. באמצעות microloader, לטעון שלושה microliters של תערובת snRNA לתוך המחט ולהתקין את המחט לתוך המחזיק של microinjector בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח של צלחת פטרי. השתמש במטרה 10X למרחקים ארוכים כדי למצוא את המחט.ראשית, להגדיר את המהירות גסה על המזרק ולהוריד את המחט עד שהוא נוגע במדיום התרבות. באמצעות משקפת מיקרוסקופ, למצוא את נקודת האור שהוא המקום שבו המחט נוגעת באמצעי התרבות. לשנות את המהירות כדי לקנוס ולהוריד עוד יותר את המחט תוך כדי התבוננות לתוך המיקרוסקופ עד קצה המחט הוא ציין.להזיז את המחט באמצע השדה החזותי ולעבור למטרה 40X למרחקים ארוכים. לאחר מכן, בחר את התא והזז את המחט מעל התא. הגדר את הלחץ והזמן עבור איש הקשר הסלולרי.להזיז את המחט למטה לתוך התא ולאחר מכן להגדיר את הגבול התחתון של micromanipulator. הגדרת הגבול התחתון היא החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול. בגלל משטח coverslip אינו מושלם, כי כל תא שונה, תצטרך להגדיר את הגבול התחתון מספר פעמים במהלך הפעלת ההזרקה.לאחר מכן, להזיז את המחט בחזרה מעל התא ולחץ על כפתור ההזרקה על מוט ההיגוי של המזרק. המחט תעבור באופן אוטומטי בתוך התא למקום שבו הגבול מוגדר להזריק את תערובת RNA. כדי לסיים, לחץ על כפתור התפריט על המזרק ולהסיר את המחט מהמחזיק.לאחר מכן נתק את הצינור מהמזרק לפני כיבוי המזרק והמיקרומניפולטור. לאחר המיקרו-ג'ינג'י, החזירו את התאים לאנקובטור פחמן דו-חמצני ולאנקובטה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.תקן את התאים במשך 20 דקות עם 4%paraformaldehyde בצינורות טוחנים 0.1 ב- pH 6.9. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS טמפרטורת החדר. אם מנתחים רק לוקליזציה של snRNA, שטפו בקצרה את התאים במים והרו במדיום הרכבה באמצעות DAPI.במקרה של לוקליזציה נוספת של חלבונים, יש לחלחל לתאים עם 0.5% טריטון X-100 ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות PBS ולהכתים אותם בנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולשטוף פעם אחת במים.לאחר מכן, תן את התאים במדיום הרכבה עם DAPI. כאשר אתם מוכנים לתמונה, השתמשו במערכת מיקרוסקופית פלואורסצנטית יוקרתית המצוידת במטרה טבילה כדי לרכוש את התמונות. לאחר זיהוי התאים microinjected, לאסוף ערימה של 20 מקטעי Z עם 200 ננומטר Z צעדים לכל מדגם בכפוף deconvolution מתמטי.לכימות אות הפלואורסצנט, פתחו תחילה את תמונת המיקרוסקופיה ב-ImageJ ופצלו ערוצים לחלונות. סנכרן חלונות לפי כלי הסינכרון של החלון. לאחר מכן, לצייר את האזור של עניין סביב גוף Cajal מזוהה על ידי כשל חיסוני coilin.למדוד את עוצמת אות snRNA בהדרת ההשקעה המוגדרת על ידי קולין. לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות snRNA בהדרה חוזרת (ROI) הממוקמת באופן אקראי בגרעין. שמור ערכים נמדדים וחשב את היחס של אות RNA בגוף Cajal ונוקליופלזמה.במחקר זה, snRNAs שכותרתו פלואורסצנטי הם microinjected על מנת לפקח על התחבורה שלהם בתוך התא. כדי לבדוק אם אתר SM חשוב עבור הצטברות הגוף Cajal, snRNA חסר אתר SM הוא microinjected ישירות לתוך הגרעין. הזרקה לתוך הציטופלסמה משמשת כפקד בעוד snRNA באורך מלא הוא microinjected לשמש שליטה חיובית.לאחר הדגירה, תאים microinjected קבועים ואת קולין סמן הגוף Cajal הוא דמיין על ידי שפעת חיסונית עקיפה. snRNA באורך מלא הצטבר בגופי Cajal לאחר זריקות גרעיניות וציטופלסמיות. לעומת זאת, snRNA חסר אתר SM נשאר ציטופלסמה לאחר microinjection לתוך תא זה בעוד microinjection הגרעיני של snRNA ללא אתר SM מגלה כי רצף קשירה SM חשוב לוקליזציה הגוף Cajal כמו snRNA זה נשאר בגרעין אבל לא מצטבר בגופי Cajal.לפעמים microinjection לתוך תא סלולרי אחד בלבד נכשל מרומה Dextran 70 קילודלטון ניתן למצוא הן בגרעין ואת הציטופלסמה. תאים אלה נמחקים מניתוח נוסף. למרות העובדה כי snRNAs שכותרתו פלואורסצנטי מאוחסנים שלילי 80 מעלות צלזיוס לפני הזריקה, השפלה RNA יכול להתרחש.snRNA מושפל מוזרק לתוך הציטופלסמה אינו מועבר לתוך הגרעין ונשאר מקומי בציטופלסמה. snRNA כזה צריך להיות מושלך snRNA חדש צריך להיות מסונתז. חשוב להתאים כראוי הזרקה ולחצים מפצה עבור סוג התא שלך.וכך נאמר קודם, הגדרת הגבול התחתון הנכון להזרקת תאים היא חיונית עבור microinjection טוב. זכור כי פנול-כלורופורם המשמש במהלך בידוד RNA הוא מסוכן, כי מחט microinjection הוא אובייקט חד. היזהר בעת טיפול בחומרים אלה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

מדידות אלקטרו וניתוח Nociception אצל תינוקות אדם

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...